巖黃連總堿下調miR-223表達調控人牙齦成纖維細胞增殖與凋亡的分子機制研究

謝陸莉,李 鯤,鄧 琳

(成都市龍泉驛區第一人民醫院口腔科,四川 成都 610100)

牙周炎是一種高發的感染性疾病,以牙齦炎癥、牙槽骨吸收和牙齒松動甚至脫落為特征[1-2];細菌感染牙齦介導的炎癥細胞因子的釋放是牙周炎牙齒脫落的主要原因之一[3-5]。牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)是牙周炎的主要致病菌,脂多糖(Lipopolysacharide,LPS)是主要作用因子,其可破壞牙周組織細胞進而促進牙周炎發展進程[6-7]。因而抑制牙齦卟啉單胞菌脂多糖(Porphyromonas gingivalis lipopolysaccharide,Pg-LPS)的毒性作用是緩解牙周炎的重要途徑。巖黃連總堿是巖黃連的主要有效成分,具有抗炎、抗菌和抗氧化等作用[8]。研究[9]顯示,巖黃連總堿在體外可抑制Pg的生長,但巖黃連總堿對牙周炎的影響尚未闡明。miR-223是牙周炎組織中表達較高的微小RNA(microRNA,miRNA)之一,與牙周炎患者的血清和齦溝液中炎癥介質水平升高有關[10-11]。據報道,miR-223高表達可促進炎性反應,加重人牙齦成纖維細胞損傷[12]。磷脂酰肌醇-3-激酶(Phosphoinositide 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(Protein kinase B,AKT)信號通路是miR-223發揮炎癥調節劑作用的通路之一[13]。研究[14]顯示,miR-223可通過激活PI3K/AKT通路引發潰瘍性結腸炎大鼠細胞凋亡和炎性反應。抑制PI3K/AKT通路的激活可減輕LPS誘導的人牙齦成纖維細胞的炎性反應[15],并可抑制牙周炎大鼠牙槽骨的丟失[16]。因此,本研究采用Pg-LPS誘導人牙齦成纖維細胞建立細胞炎癥模型,探討巖黃連總堿對Pg-LPS誘導人牙齦成纖維細胞增殖、凋亡和炎性反應的影響及其對miR-223/PI3K/AKT信號通路的調控作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 巖黃連總堿(純度≥98%,上海西格生物科技有限公司);Pg-LPS(上海研卉生物);Lipofectamine2000(美國Thermo Fisher);人牙齦成纖維細胞(武漢普諾賽生命科技有限公司);miR-223 mimics、miR-NC、anti-miR-223、anti-miR-NC(廣州銳博生物);MTT試劑與凋亡檢測試劑盒(北京索萊寶);白細胞介素-1β(IL-1β)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA試劑盒(上海酶聯);兔抗人pro-caspase-3、Cleaved-caspase-3(美國Santa Cruz);兔抗人PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT抗體(美國CST)。

1.2 實驗方法

1.2.1 巖黃連總堿對人牙齦成纖維細胞的細胞毒性作用:人牙齦成纖維細胞以每孔2×104個細胞接種于96孔板中,使用終濃度為5、10、20、40、80、160 μg/ml的巖黃連總堿處理24 h,每孔加入20 μl的MTT溶液(PBS緩沖液制成5 mg/ml溶液),37 ℃避光孵育4 h,再加入150 μl DMSO溶液,檢測酶標儀490 nm處吸光度值(A490 nm),計算細胞增殖活力(%)。

1.2.2 實驗分組:人牙齦成纖維細胞按照每孔1×104個接種于6孔板后分為對照組(NC組,未經處理的人牙齦成纖維細胞)、Pg-LPS組(加入100 μg/ml的Pg-LPS處理24 h)、5 μg/ml巖黃連總堿+Pg-LPS組、10 μg/ml巖黃連總堿+Pg-LPS組和20 μg/ml巖黃連總堿+Pg-LPS組(分別添加含有5、10、20 μg/ml巖黃連總堿與100 μg/ml Pg-LPS共同處理人牙齦成纖維細胞24 h),miR-NC+Pg-LPS組、miR-223+Pg-LPS組、anti-miR-NC+Pg-LPS組和anti-miR-223+Pg-LPS組(miR-NC、miR-223 mimics、anti-miR-NC、anti-miR-223分別轉染至人牙齦成纖維細胞后加入100 μg/ml的Pg-LPS處理24 h),20 μg/ml巖黃連總堿+Pg-LPS+miR-NC組和20 μg/ml巖黃連總堿+Pg-LPS+miR-223組(miR-NC、miR-223 mimics分別轉染至人牙齦成纖維細胞后加入20 μg/ml巖黃連總堿與100 μg/ml Pg-LPS共同處理人牙齦成纖維細胞24 h)。

1.2.3 EDU檢測細胞增殖:將各組人牙齦成纖維細胞(1×106個/ml)接種于12孔板(200 μl/孔),加入EDU工作液(20 μmol/L)孵育2 h,用4%固定液固定15 min后,加入1 ml 0.3% Triton X-100,加入DAPI染色液孵育30 min,熒光顯微鏡下觀察,藍色為細胞核,綠色為EDU陽性細胞(增殖細胞),計算EDU染色陽性率(EDU陽性細胞數/DAPI染色總細胞數×100%)。

1.2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡率:收集各組人牙齦成纖維細胞并用500 μl Binding buffer重懸,分別加入Annexin V-FITC(5 μl)與PI(5 μl),室溫避光孵育10 min,用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.5 RT-qPCR檢測miR-223的表達水平:采用Trizol法提取細胞總RNA,反轉錄合成cDNA后進行RT-qPCR擴增。應用ABI Step One Plus熒光定量PCR儀檢測miR-223相對表達量。引物序列:miR-223正向5’-CGGACGTGTATTTGACAAGC-3’和反向5’-CAGTGCAGGGTCCGAGGTA-3’;U6正向5’-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3’和反向5’-GGAACGCTTCACGAATTTG-3’。

1.2.6 ELISA法測定炎癥因子IL-1β、TNF-α表達水平:將各組細胞培養上清液離心(1000 g、10 min),取上清液,ELISA試劑盒檢測IL-1β、TNF-α表達水平。

1.2.7 Western blot檢測Cleaved-caspase-3、pro-caspase-3和PI3K/AKT通路相關蛋白表達水平:RIPA裂解液提取細胞總蛋白,蛋白變性后進行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,轉膜、封閉2 h,孵育pro-caspase-3(1∶1000)、Cleaved-caspase-3(1∶800)、PI3K(1∶1000)、p-PI3K(1∶1000)、AKT(1∶1000)、p-AKT(1∶1000)一抗與β-actin抗體稀釋液(1∶1000),4 ℃孵育過夜,加入二抗稀釋液(1∶2000),室溫孵育1 h后加入電化學發光試劑顯影,用Image J軟件分析各條帶灰度值。

2 結 果

2.1 巖黃連總堿對人牙齦成纖維細胞的毒性作用 與0 μg/ml組比較,使用5、10、20、40 μg/ml的巖黃連總堿處理人牙齦成纖維細胞24 h后,細胞增殖活力無顯著變化(均P>0.05),而80、160 μg/ml巖黃連總堿可顯著降低人牙齦成纖維細胞的增殖活力(均P<0.05),見圖1。因此,選擇5、10、20 μg/ml的巖黃連總堿進行后續實驗。

注:與0 μg/ml組比較,*P<0.05圖1 巖黃連總堿對人牙齦成纖維細胞增殖的影響

2.2 巖黃連總堿對Pg-LPS誘導的人牙齦成纖維細胞增殖、凋亡和炎性因子水平的影響 與NC組比較,Pg-LPS組細胞凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白水平以及IL-1β、TNF-α水平升高,EDU陽性細胞數減少(均P<0.05);與Pg-LPS組比較,5 μg/ml巖黃連總堿+Pg-LPS組、10 μg/ml巖黃連總堿+Pg-LPS組、20 μg/ml巖黃連總堿+Pg-LPS組細胞凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白水平以及IL-1β、TNF-α水平降低,EDU陽性細胞數增多(均P<0.05),不同劑量巖黃連總堿組間各指標比較差異有統計學意義(均P<0.05)。見表1。

表1 巖黃連總堿對Pg-LPS誘導的人牙齦成纖維細胞增殖、凋亡與炎性因子水平的影響

2.3 巖黃連總堿對Pg-LPS誘導的人牙齦成纖維細胞中miR-223表達和PI3K/AKT通路的影響 與NC組比較,Pg-LPS組miR-223的表達量、p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比值升高(均P<0.05);與Pg-LPS組比較,5 μg/ml巖黃連總堿+Pg-LPS組、10 μg/ml巖黃連總堿+Pg-LPS組、20 μg/ml巖黃連總堿+Pg-LPS組miR-223的表達量、p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比值降低(均P<0.05),不同劑量巖黃連總堿組間各指標比較差異有統計學意義(均P<0.05)。見表2。

表2 巖黃連總堿對Pg-LPS誘導的人牙齦成纖維細胞中miR-223表達和PI3K/AKT通路的影響

2.4 miR-223對Pg-LPS誘導的人牙齦成纖維細胞增殖、凋亡和炎性因子水平的影響 與miR-NC+Pg-LPS組比較,miR-223+Pg-LPS組細胞凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白水平以及IL-1β、TNF-α水平升高,EDU陽性細胞數減少(均P<0.05);與anti-miR-NC+Pg-LPS組比較,anti-miR-223+Pg-LPS組細胞凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白水平以及IL-1β、TNF-α水平降低,EDU陽性細胞數增多(均P<0.05)。見表3。

表3 miR-223對Pg-LPS誘導的人牙齦成纖維細胞增殖、凋亡和炎性因子水平的影響

2.5 miR-223對Pg-LPS誘導的人牙齦成纖維細胞中PI3K/AKT通路的影響 與miR-NC+Pg-LPS組比較,miR-223+Pg-LPS組p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比值升高(均P<0.05);與anti-miR-NC+Pg-LPS組比較,anti-miR-223+Pg-LPS組p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比值降低(均P<0.05)。見表4。

表4 miR-223對Pg-LPS誘導的人牙齦成纖維細胞中PI3K/AKT通路的影響

2.6 miR-223可以逆轉巖黃連總堿對Pg-LPS誘導的人牙齦成纖維細胞增殖、凋亡和炎性因子水平 與20 μg/ml巖黃連總堿+Pg-LPS+miR-NC組比較,20 μg/ml巖黃連總堿+Pg-LPS+miR-223組細胞凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白水平以及IL-1β、TNF-α水平升高,EDU陽性細胞數減少(均P<0.05)。見表5。

表5 miR-223可以逆轉巖黃連總堿對Pg-LPS誘導的人牙齦成纖維細胞增殖、凋亡和炎性因子水平

2.7 miR-223可以逆轉巖黃連總堿對Pg-LPS誘導的人牙齦成纖維細胞中PI3K/AKT通路相關蛋白表達 與20 μg/ml巖黃連總堿+Pg-LPS+miR-NC組比較,20 μg/ml巖黃連總堿+Pg-LPS+miR-223組p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT比值升高(均P<0.05),見表6。

表6 miR-223可以逆轉巖黃連總堿對Pg-LPS誘導的人牙齦成纖維細胞中PI3K/AKT通路相關蛋白表達

3 討 論

牙齦成纖維細胞是牙周組織的主要細胞成分,參與牙周炎的發生發展過程。研究顯示,與健康人相比,慢性牙周炎患者牙齦成纖維細胞活性降低,細胞凋亡增加[17]。LPS是Pg外膜的重要毒力因子,可誘導人牙齦成纖維細胞產生IL-1β、TNF-α等炎性因子,促進炎性反應,加重牙周炎[7]。本研究發現,Pg-LPS誘導的人牙齦成纖維細胞活力降低,細胞凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白水平升高,而巖黃連總堿作用后Pg-LPS誘導的人牙齦成纖維細胞活力升高,細胞凋亡率和Cleaved-caspase-3蛋白水平降低,提示巖黃連總堿可促進Pg-LPS誘導的人牙齦成纖維細胞增殖,抑制細胞凋亡。此外,巖黃連總堿可降低Pg-LPS誘導的人牙齦成纖維細胞中IL-1β、TNF-α水平,提示巖黃連總堿可抑制Pg-LPS誘導的人牙齦成纖維細胞炎性反應。

miR-223參與感染、免疫反應和多種炎癥性疾病的調節。已有研究證明,與健康牙齦相比,牙周炎患者牙齦組織中miR-223上調[18]。在牙周炎大鼠模型的血清中也發現了miR-223的上調表達[19]。此外,據報道,miR-223是牙周炎患者血清和齦溝液中過表達的miRNA之一[11]。miR-223通過靶向NLRP3促進LPS誘導人類牙髓成纖維細胞的炎性反應[20]。本研究發現Pg-LPS誘導的人牙齦成纖維細胞中miR-223的表達量升高,抑制miR-223表達后Pg-LPS誘導的人牙齦成纖維細胞活力升高,凋亡能力和IL-1β、TNF-α水平降低,而過表達miR-223表現出相反作用,提示miR-223過表達可能促進牙周炎的發生。在本研究中,巖黃連總堿可降低Pg-LPS誘導的人牙齦成纖維細胞中miR-223的表達,且過表達miR-223可拮抗巖黃連總堿對Pg-LPS誘導的人牙齦成纖維細胞增殖及凋亡的作用,提示巖黃連總堿可能通過調控miR-223的表達而對Pg-LPS誘導的人牙齦成纖維細胞發揮保護作用。

此外,本研究發現,巖黃連總堿可抑制Pg-LPS誘導的人牙齦成纖維細胞中PI3K/AKT通路的激活。PI3K/AKT信號通路在牙周炎中被激活,可導致核因子-κB(Nuclear factor κB,NF-κB)活化,促進牙周炎的發生及發展[21-22]。Jiang等[14]發現,miR-223可通過激活PI3K/AKT信號通路促進潰瘍性結腸炎大鼠細胞凋亡和炎性反應。本研究發現Pg-LPS誘導的人牙齦成纖維細胞中p-PI3K、p-AKT蛋白水平升高,巖黃連總堿處理或抑制miR-223表達后p-PI3K、p-AKT蛋白水平降低,而過表達miR-223可降低巖黃連總堿對p-PI3K、p-AKT蛋白表達的抑制作用,提示巖黃連總堿可能通過下調miR-223表達,抑制PI3K/AKT通路的活化,進而抑制牙周炎的發生。

綜上所述,巖黃連總堿可促進Pg-LPS誘導的人牙齦成纖維細胞增殖,抑制細胞凋亡和炎性反應,可能是通過下調miR-223抑制PI3K/AKT信號通路實現的。由于miR-223基因序列上包含多個調控位點,巖黃連總堿通過何種途徑調控miR-223表達以及miR-223下游靶基因仍需進一步探究。