整合DNA修復(fù)能力與核苷酸剪切修復(fù)標(biāo)志物評(píng)估頭頸鱗癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的初步研究

張 令,敬 怡,劉 琪,張曉彤,韓 鵬

(1.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科,陜西 西安 710061;2.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科,陜西 西安 710004;3.山陽縣人民醫(yī)院耳鼻喉科,陜西 山陽 726400)

在世界上最常見的惡性腫瘤中,頭頸部癌癥(Head and neck cancer,HNC)位于第6位,約 90% 的HNC在病理上均屬于鱗狀細(xì)胞癌(Squamous cell carcinoma,SCC),其主要的發(fā)生部位分布于口腔、口咽、下咽及喉部[1-4]。因此我們用頭頸部鱗狀細(xì)胞癌(Head and neck squamous cell carcinoma,HNSCC)將上述惡性腫瘤統(tǒng)一歸類,簡稱為頭頸鱗癌[5-6]。HNSCC的5年生存率相對(duì)較低,總體預(yù)后相對(duì)較差,致死率相對(duì)較高,給患者生命健康帶來極大危害[7-8]。HNSCC根據(jù)發(fā)病因素不同主要分為兩類:一類是由于長期吸煙及飲酒所致;另一類是因感染了人類乳頭狀病毒(Human papillomavirus,HPV)而引起[9-10]。世界衛(wèi)生組織的研究表明,在西方發(fā)達(dá)國家,HNSCC中口咽癌主要病因?yàn)镠PV感染;然而在我國約80%的口咽癌是由長期吸煙及飲酒所致,僅20%口咽癌是由HPV感染引起,并且多數(shù) HPV陽性的口咽癌患者常伴有吸煙史[11-14]。既往研究表明,DNA修復(fù)能力(DNA repair capacity,DRC)降低、核苷酸剪切修復(fù)(Nucleotide excision repair,NER)基因mRNA表達(dá)水平降低分別與HNSCC的易感性增加有關(guān),但單一水平的標(biāo)志物對(duì)預(yù)測HNSCC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的作用較為局限性,且該方法預(yù)測的準(zhǔn)確度和精確度相對(duì)較低[15-18]。值得注意的是目前尚無將DRC和NER標(biāo)志物相結(jié)合的來評(píng)估HNSCC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的研究。因此,本研究將基于82例HNSCC和81例健康對(duì)照,通過整合DRC水平和NER通路標(biāo)志物來預(yù)測HNSCC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 本研究選取2015-2021年間就診于西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院的82例HNSCC患者和81例無癌對(duì)照者進(jìn)行分析。為了避免種族間人種的差異,本研究僅選取中國漢族人群作為研究對(duì)象,在抽取研究對(duì)象外周血前詢問其個(gè)人信息、病史及相關(guān)的流行病學(xué)資料,主要內(nèi)容包括對(duì)年齡、性別、生活習(xí)慣(吸煙、飲酒等)及家族史。本研究檢測項(xiàng)目通過西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過,所有入選研究對(duì)象檢測前均告知相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)及簽署知情同意書。病例組的選擇標(biāo)準(zhǔn)為:新診斷為HNSCC,18歲以上,未患過其他腫瘤,被病理診斷為口腔、咽部(除外鼻咽部)及喉部的SCC,未接受過任何治療。對(duì)照組的選擇標(biāo)準(zhǔn)為:18歲以上,與病例組年齡和性別相匹配,未患過任何癌癥的個(gè)體。為了避免研究對(duì)象的重復(fù),我們僅選取每個(gè)患者的一個(gè)朋友或非血緣關(guān)系的親屬參與研究。排除標(biāo)準(zhǔn):年齡未滿18歲;不愿提供相應(yīng)的血液標(biāo)本;中途退出研究;接受過任何化療或放療的研究對(duì)象。

1.2 研究方法

1.2.1 Trizol法從血液中提取RNA:首先,從患者的血液標(biāo)本中提取淋巴細(xì)胞,并將已處理的各組淋巴細(xì)胞棄培養(yǎng)液,用溫度為4 ℃的PBS清洗細(xì)胞培養(yǎng)板,重復(fù)3次;每孔加入Trizol試劑1 ml,將細(xì)胞培養(yǎng)板置于冰上約15 min裂解后,反復(fù)吹打,裂解細(xì)胞,將裂解液置入1.5 ml EP 管中;將200 μl 的三氯甲烷加入每個(gè)小管,封閉好小管,劇烈震蕩55～65 s,并在室溫下放置10～15 min,充分裂解;在4 ℃、轉(zhuǎn)速12000 r/min下,將裂解液離心14～16 min,離心后樣品分層,RNA分布于上層水相內(nèi),吸取上層;取上清液至清潔的DEPC處理過的EP管,將異丙醇0.6 ml加入管中,上下輕柔顛倒約3～5次混勻,在-20 ℃冰箱內(nèi)放置約2～3 h;4 ℃、12000 r/min,離心10～15 min,棄上清液,可見沉于管底的RNA;取1 ml 75% 乙醇加入沉淀中,沉淀物溫和吹起即可;4 ℃、10000 r/min,離心10～15 min,盡量棄除上清液;將EP管倒置于濾紙上4～6 min,不要徹底干燥;加入10 μl DEPC水溶解RNA樣品,備用;對(duì)OD值進(jìn)行測定,得到RNA的濃度,按照試劑盒說明要求將RNA轉(zhuǎn)成cDNA,并置于-80 ℃冰箱中。

1.2.2 NER基因的PCR實(shí)驗(yàn)[17]: PCR反應(yīng)體系如下:每個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)在5 μl含有5 ng互補(bǔ)DNA、0.25 μl引物和2.5 μl Master混合物的最終體系中進(jìn)行。PCR反應(yīng)在384孔光學(xué)平板中進(jìn)行,終體積為5 μl反應(yīng)混合物。熱循環(huán)條件如下:95 ℃、5 min,然后在95 ℃變性15 s,40 ℃循環(huán),60 ℃退火、延伸1 min。以18 s作為內(nèi)參,Ct值為PCR實(shí)驗(yàn)中每個(gè)反應(yīng)內(nèi)的信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。通過ΔCt計(jì)算8個(gè)NER基因相對(duì)于18 s的表達(dá)水平。ΔCt值是目標(biāo)基因的Ct值減去其18 s的Ct值,即ΔCt=Ct(NER基因)-Ct(18 s)。ΔCt值越小,靶基因mRNA的相對(duì)表達(dá)水平越高。所有NER基因 mRNA及18 s rRNA的引物由美國 Applied Biosystems公司提供并保留引物序列信息。

1.2.3 宿主細(xì)胞再活化實(shí)驗(yàn)(HCR):通過梯度離心法從患者外周血中分離出T淋巴細(xì)胞,并將其儲(chǔ)存在低溫冰箱中,記錄儲(chǔ)存時(shí)間;純化的pCMV-CAT質(zhì)粒經(jīng)BPDE(由西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院科研平臺(tái)提供)處理后,再次純化后儲(chǔ)存于冰箱中。DRC的活性

被定義為轉(zhuǎn)染BPDE處理質(zhì)粒細(xì)胞的CAT活性除以轉(zhuǎn)染未被處理質(zhì)粒細(xì)胞的CAT活性[15]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SAS統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。用卡方檢驗(yàn)分析病例組與對(duì)照組之間的年齡、性別、吸煙和飲酒狀況的差異;采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)比較病例組與對(duì)照組之間的DRC水平和NER mRNA表達(dá)水平(連續(xù)變量)的差異;通過Logistic回歸將DRC和NER mRNA表達(dá)水平進(jìn)行了相關(guān)性分析;通過ROC曲線計(jì)算曲線下面積(AUC),對(duì)DRC和NER mRNA相對(duì)表達(dá)水平對(duì)HNSCC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的診斷價(jià)值進(jìn)行評(píng)價(jià),并通過Logistic回歸構(gòu)建四個(gè)水平進(jìn)行比較,分別為基礎(chǔ)水平、NER基因水平、DRC水平及整合水平;基礎(chǔ)水平僅包括年齡、性別、吸煙狀態(tài)及飲酒狀態(tài);NER基因水平包括NER基因的mRNA相對(duì)表達(dá)水平,再加上基礎(chǔ)水平中的變量;DRC水平包括DRC和基礎(chǔ)水平中的變量;整合水平包括DRC、NER基因的mRNA相對(duì)表達(dá)水平以及基礎(chǔ)水平中的變量。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組一般資料比較 見表1。病例組與對(duì)照組性別及年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05),病例組吸煙占比高于對(duì)照組(P<0.05),兩組飲酒人群比例比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 兩組一般資料比較

2.2 病例組與對(duì)照組DRC水平及NER基因mRNA表達(dá)水平的差異及相關(guān)性 見表2～5。病例組的DRC(連續(xù)變量)平均水平顯著低于對(duì)照組[(9.84±2.32 ) %與(10.35±2.42)%;Z=-3.241,P=0.013]。細(xì)胞的儲(chǔ)存時(shí)間(CST),病例組時(shí)間長于對(duì)照組[(10.21±8.43)個(gè)月與(8.26±5.11)個(gè)月;Z=-8.120,P<0.001]。在9個(gè)NER基因中,病例組的XPA的表達(dá)水平均顯著低于對(duì)照組(Z=-2.316,P=0.022)。不同部位腫瘤的DRC、XPA水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;XPA mRNA的表達(dá)水平與DRC水平具有相關(guān)性(r=-0.096,P=0.031)。

表2 兩組DRC及CST水平比較

表3 兩組NER mRNA表達(dá)水平比較

表4 不同部位腫瘤的DRC、XPA表達(dá)水平比較

表5 NER基因 mRNA表達(dá)水平與DRC水平的相關(guān)性

2.3 通過整合DRC和NER mRNA表達(dá)預(yù)測HNSCC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn) 通過ROC曲線計(jì)算AUC面積,構(gòu)建四個(gè)水平對(duì)DRC和NER mRNA相對(duì)表達(dá)對(duì)HNSCC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測的可靠性進(jìn)行評(píng)價(jià)。相比于不包含DRC的基礎(chǔ)水平,DRC水平中ROC曲線中AUC面積顯著增加(P=0.043)。用整合水平來評(píng)估DRC與NER mRNA這兩種生物標(biāo)志物對(duì)HNSCC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測的診斷價(jià)值,與單一的DRC水平相比,整合了DRC與XPA表達(dá)水平的ROC曲線中AUC顯著增加(P=0.032);此外,與單一的NER基因水平(XPA)相比,整合兩種標(biāo)志物的水平ROC曲線中AUC也得到了改善(P=0.037)。

3 討 論

既往研究發(fā)現(xiàn)HNSCC患者的DRC或NER mRNA水平明顯低于健康對(duì)照組,這表明在中國人群中兩者水平的降低可以分別作為一個(gè)獨(dú)立的生物標(biāo)志物來預(yù)測HNSCC的易感性[15-18]。由于單一的生物標(biāo)志物在預(yù)測HNSCC易感性上具有局限性,因此我們將NER基因mRNA表達(dá)水平也加入到ROC曲線中作為整合水平來預(yù)測HNSCC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。結(jié)果顯示相比于只含有單一NER表型的水平,整合水平對(duì)于HNSCC的易感性的預(yù)測效能更高。

DNA修復(fù)在多種生物過程中發(fā)揮著重要作用,DNA修復(fù)通路的功能障礙會(huì)導(dǎo)致不同類型癌癥的發(fā)生[19]。此外,許多吸煙相關(guān)癌癥的分子流行病學(xué)研究都包括DNA修復(fù)通路的遺傳易感性,其中單核苷酸多態(tài)性(SNPs)和基因突變已被廣泛研究[20]。然而,既往文獻(xiàn)關(guān)于此的流行病學(xué)研究結(jié)果一直不確定。表型的生物標(biāo)志物,比如DRC,可以檢測由同一途徑中不同基因的少數(shù)遺傳變異決定的功能差異。事實(shí)上,已經(jīng)有研究者提議將DRC作為包括HNSCC在內(nèi)的幾種癌癥的易感性生物標(biāo)志物[15,21]。

在非西班牙裔的白種人的研究中,DRC低水平的患者患HNSCC的風(fēng)險(xiǎn)是DRC高水平患者的1.91倍[15]。DRC表型可能體現(xiàn)了參與DNA修復(fù)通路的各種酶的一般活性,這表明,在相關(guān)分析中,特定DRC水平的評(píng)估比使用單個(gè)SNP或一個(gè)基因中的一組SNP具有一些優(yōu)勢[15]。然而,在本研究中,HPV狀態(tài)未進(jìn)行檢測,這可能對(duì)DRC有一定影響。此外,在一個(gè)種族群體中發(fā)現(xiàn)的生物標(biāo)志物在另一個(gè)種族群體中可能沒有相同的用處;因此,這種關(guān)聯(lián)需要在另一個(gè)種族組中進(jìn)行驗(yàn)證。在本研究中,我們證實(shí)了在中國人群中DRC降低與HNSCC易感性增加具有相關(guān)性。

既往研究表明,在包括DRC水平中,ROC曲線下AUC顯著改善[15]。更重要的是,我們?cè)贒RC水平中加入了NER基因表達(dá)作為一個(gè)新的整合水平,與僅包含DRC或NER基因表達(dá)的水平相比,包含DRC水平和NER基因表達(dá)水平能夠顯著提高ROC曲線下AUC。進(jìn)一步表明,結(jié)合NER通路的DRC以及mRNA表達(dá)水平可以顯著提高NER表型HNSCC風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測的效能。

目前的流行病學(xué)研究是第一個(gè)整合DRC及NER表型來分析兩者與HNSCC發(fā)表風(fēng)險(xiǎn)之間的相關(guān)性研究。雖然單個(gè)NER表型(即mRNA表達(dá))的分析很容易進(jìn)行,但該數(shù)據(jù)在預(yù)測HNSCC的風(fēng)險(xiǎn)時(shí)可能存在不可靠因素,因?yàn)镻CR檢測的結(jié)果可能隨著不同的細(xì)胞階段而波動(dòng)。因此,為了提高預(yù)測的準(zhǔn)確性,有必要整合另一個(gè)相關(guān)表型來預(yù)測HNSCC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。ROC曲線的AUC分析表明,在中國人群中,整合DRC水平和NER基因mRNA表達(dá)可以顯著提高預(yù)測HNSCC發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的效能。

此外,本研究存在一些局限性。首先,在病例與對(duì)照研究中,盡管我們?cè)谡心疾±蛯?duì)照時(shí)應(yīng)用了嚴(yán)格的頻數(shù)匹配策略,以控制潛在的混雜變量,但是遺傳選擇偏倚仍然無法避免。第二,目前的研究沒有包括任何遺傳易感性的信息,雖然DNA修復(fù)基因的突變和SNP也可能影響個(gè)體的DRC,但DNA修復(fù)表型的測量在很大程度上已經(jīng)反映了所有可能的遺傳變異的以及其全部功能。第三,盡管我們?cè)谀壳暗难芯恐信懦薍PV陽性受試者及其可能帶來的影響,但是在HPV陽性受試者中是否會(huì)有相同的結(jié)果尚未知,因此在未來我們的研究結(jié)果應(yīng)該在更多HPV陽性病例的研究中進(jìn)行驗(yàn)證。