絲瓜POD基因家族鑒定及鹽脅迫下表達分析

駱彩霞，張 涵,，劉樟揚，趙鋼軍，喻 敏，劉敏敏**，吳海濱,3**

1. 佛山科學技術學院，廣東佛山 528225；2. 廣東省蔬菜新技術研究重點實驗室/廣東省農業科學院蔬菜研究所，廣東廣州 510640；3. 嶺南現代農業科學與技術廣東省實驗室，廣東廣州 510000

絲瓜為葫蘆科（Cucurbitaceae）絲瓜屬（Luffaspp.）一年生攀援性草本植物，共有9個種，栽培種為有棱絲瓜（L. acutangulaRoxb.）和普通絲瓜（Luffa. cylindricaRoem.）[1]。絲瓜果實富含賴氨酸、苯丙氨酸等人體必需氨基酸、維生素B1/B2/C等抗氧化物質，是一種重要的藥食兼用的多功能蔬菜[2-3]。

植物受到如高溫、干旱、鹽漬、寒冷等非生物脅迫或者病、蟲、機械損傷等生物脅迫時，細胞代謝平衡被破壞，導致植物體內活性氧（reactive oxygen species, ROS）累積造成氧化脅迫（oxidative stress），使膜損傷、蛋白質變性、脂質過氧化、DNA損傷等，嚴重損害生物系統的穩定性[4-5]。植物細胞通過酶促活性氧清除系統和非酶活性氧清除系統清除或者降低ROS含量[5-6]。過氧化物酶（peroxidase, POD）可以還原植物細胞體內的ROS，生成H2O和O2，是植物酶促活性氧清除系統重要的組成部分[7-9]。

在多個物種中已經鑒定出POD家族成員，包括擬南芥[10]，水稻[11]、大豆[12]、茶樹[13-14]、蘋果[15]等。研究發現，擬南芥過氧化物酶RCI3受冷脅迫誘導，正調節擬南芥耐滲透脅迫和鹽脅迫[16]。大豆中23個POD家族基因在耐旱系和干旱敏感系間顯著差異表達，其中GsPOD40通過增強干旱脅迫下大豆的光合作用和抗氧化酶活性，從而減輕ROS誘導的氧化損傷，增強大豆的耐旱性[12]。蘋果中，大部分POD基因受ABA、PEG、NaCl脅迫誘導表達，其中超表達MdPOD15，可緩解非生物脅迫對蘋果愈傷組織的損傷[15]。朱海生等[17]利用RACE（rapid-amplification of cDNA ends）方法擴增了1個絲瓜POD基因，并表示其可能與絲瓜果肉褐化有關。

然而，到目前為止，從基因組層面鑒定絲瓜POD家族基因，及其對鹽脅迫響應研究鮮有報道。本研究利用生物信息學方法鑒定絲瓜POD家族成員，并對其基因結構、理化性質、系統進化、順式作用元件及其在鹽脅迫下表達模式分析，為探究POD基因家族調控絲瓜鹽脅迫時的功能提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

供試絲瓜品種為廣東省農業科學院蔬菜研究所培育的高代自交系S1174。

1.2 方法

1.2.1 絲瓜POD家族成員鑒定 從Pfam（http://pfam.xfam.org/）下載POD家族的保守結構域PF00141，利用TBtools[18]檢索本課題組裝的有棱絲瓜基因組（未發表）的蛋白序列，得到絲瓜POD家族成員的候選序列。為保證候選序列的準確性，在NCBI-CDD數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）手動檢索，去除不含有POD家族保守域的序列。利用ProtProm（http://web.expasy.org/protparam/）網站預測POD家族成員的分子量、等電點和親水性等理化性質。

1.2.2 POD家族成員染色體定位、系統進化、基序、基因結構、啟動子順式作用元件分析 使用在線軟件MG2C（http://mg2c.iask.in/mg2c_v2.0/）進行染色體定位可視化分析。利用MEGA 7.0軟件的鄰接法構建絲瓜和擬南芥POD蛋白的系統進化樹（Bootstrap=1000）。利用TBtools軟件[18]進行染色體共線性分析。利用在線軟件MEME Suite（https://meme-suite.org/meme/tools/meme）進行氨基酸序列基序分析。使用在線軟件GSDS 2.0（http://gsds.cbi.pku.edu.cn/）分析絲瓜POD家族成員的基因結構。使用在線軟件PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plant care/html/）進行基因啟動子的順式元件分析。

1.2.3 NaCl處理 挑選飽滿種子，催芽后，將露白種子播種于光照培養箱，培養2周后，分別進行200、500 mmol/L NaCl脅迫處理，對照加等量清水，每個處理8株，3個生物學重復。脅迫處理7 d后，取葉片，快速用ddH2O清洗2遍，液氮速凍，存入超低溫冰箱備用。

1.2.4 POD活性測定 利用POD活性測定試劑盒（索萊寶，北京）測定絲瓜葉片POD活性。主要步驟如下：稱取液氮研磨的粉末樣品0.1 g，加入1 mL提取液，冰浴勻漿，離心取上清。于EP管中按次序分別加入試劑一120 μL、試劑二30 μL、試劑三30 μL、蒸餾水60 μL、樣本5 μL，立即混勻并計時，取200 μL于酶標板中，記錄470 nm下30 s時的吸光值A1和1 min 30 s時的吸光值A2，計算△A=A2-A1。計算POD活性：POD（U/g）=9800×△A/W，W：樣品質量。

1.2.5 RNA提取及表達分析 使用Primer Premier 5在基因非保守區域設計特異性引物。使用RNA提取試劑盒（全式金，北京）提取樣品的總RNA，使用TransScript?II Green Two-Step qRT-PCR SuperMix（全式金，北京）反轉錄成cDNA，并進行qPCR擴增。反應體系20 μL：2 μL cDNA，上下游引物（10 μmol/L）各0.4 μL，10 μL 2×prefectStart Green qPCR SuperMix，7.2 μL ddH2O。反應程序：94 ℃預變性30 s；94 ℃變性5 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸20 s，循環40次；3次技術重復。采用2-ΔΔCT方法計算基因的表達量。對差異表達基因在OmicShare平臺（https://www.omicshare.com/tools/）進行表達趨勢分析，設定模塊數量為20，P為0.01，獲得顯著性和非顯著性基因表達模式。

1.3 數據處理

采用Microsoft Excel 2019和SPSS 22.0軟件對數據進行整理、統計分析。

2 結果與分析

2.1 絲瓜POD基因家族成員鑒定及其蛋白的理化性質分析

通過TBtools比對篩選，結合CDD工具檢測保守結構域，最終從絲瓜中鑒定出94個POD家族基因。最長的POD蛋白（Lac05g017090）含有688個氨基酸殘基，最短的（Lac05g003440）含有89個氨基酸殘基，平均為309個；分子質量最大為75 617.64（Lac05g017090），最小為10 276.5（Lac 05g003440）；理論等電點（pI）介于4.58（Lac02g 012390）~10.34（Lac00g002910）之間。其中pI>7的POD蛋白有57個，達60.64%，表明絲瓜POD蛋白家族大部分富含堿性氨基酸；其中82個蛋白具有親水性，12個蛋白不具有親水性（表1）。94個POD家族成員不均勻地分布在絲瓜13條染色體，其中，7號染色體分布的最多，為20個；12號最少，為1個（圖1）。

圖1 絲瓜4、7、12號染色體上的POD家族成員Fig. 1 POD family members on chromosome 4, 7 and 12

表1 絲瓜POD基因家族成員信息Tab. 1 The POD gene family identified from luffa genome

2.2 POD家族成員進化分析

利用MEGA 7軟件對94個絲瓜POD家族成員和73個擬南芥POD家族成員的氨基序列構建系統進化樹（圖2）。2個物種的POD家族成員分成了3個類群Group I、Group Ⅱ、Group Ⅲ，其中Group I只有1個POD蛋白家族成員（Lac10g 028260），Group Ⅲ成員最多，包含6個亞組，共161個成員。Group Ⅲ-A全部為擬南芥家族成員，Group Ⅲ-F的成員最多（45個），包括30個絲瓜、15個擬南芥POD家族成員。

圖2 絲瓜和擬南芥POD家族成員進化分析Fig. 2 Evolution analysis of POD family members in Luffa and Arabidopsis

絲瓜和擬南芥的POD家族基因之間的共線性分析結果顯示（圖3），2個物種之間有12對共線性基因，絲瓜中有33個POD家族基因與擬南芥的37個POD家族基因存在共線性關系。其中，AT1G24110基因在絲瓜中有4個共線性基因Lac03g015670、Lac06g003720、Lac09g002650、Lac09g018070。而AT1G05240、AT1G30870、AT2G 18140、AT2G37130、AT3G21770、AT3G50990、AT4G35000、AT4G36430、AT5G58390、AT5G66390在絲瓜中分別有2個共線性基因。Lac04g020260和Lac11g009150基因在擬南芥中分別有4個共線性基因AT2G18140、AT3G50990、AT4G36430、AT5G 66390和AT2G18140、AT3G50990、AT4G36430、AT5G66390。以上結果表明絲瓜中POD家族基因發生了擴張。

圖3 絲瓜和擬南芥POD家族成員共線性分析Fig. 3 Collinearity analysis of orthologous POD gene pairs between Luffa and Arabidopsis

2.3 絲瓜POD家族基因結構、蛋白保守結構域和保守基序分析

利用GSDS在線軟件對POD家族成員的基因結構進行分析。結果表明，POD基因家族具有相似的基因結構，外顯子數量介于1~14個之間，大多數含有3個或者4個外顯子。

蛋白保守結構域分析表明，絲瓜POD家族成員都含有plant peroxidases保守結構域，其中Lac01g005270和Lac05g017090含有2個plant peroxidases保守結構域（圖4）。保守基序分析表明，不同的絲瓜POD家族成員含有的基序數量不同，其中Lac09g020210只含有1個基序，Lac01g005270和Lac05g017090含有20個基序（圖5）。

圖4 絲瓜POD家族成員保守結構域分析Fig. 4 Analysis of conserved domains of POD family members in Luffa

圖5 絲瓜POD家族成員保守基序分析Fig. 5 Analysis of motifs of POD family members in Luffa

2.4 絲瓜POD家族成員的順式作用元件分析

對絲瓜POD家族成員啟動子序列順式作用元件分析發現，POD基因普遍存在與植物激素響應和脅迫響應相關的順式元件（圖6）。植物激素響應元件包括脫落酸響應元件（ABRE，236個），生長素響應元件（AuxRE，66個），赤霉素響應元件（GARE，82個），乙烯響應元件（ERE，154個），水楊酸響應元件（SARE，45個），茉莉酸甲酯響應元件（MeJRE，264個）。脅迫響應元件包括低溫響應元件（LTR，53個），低氧脅迫響應元件（ARE，264個），光響應元件（LRE，1054個），干旱響應元件（104個）包括參與干旱誘導的MYB結合位點（MBS）和脫水反應元件（DRE），防御和脅迫響應元件（DSRE，56個）。

圖6 絲瓜POD家族成員啟動子順式元件分析Fig. 6 Analysis of cis-elements in promoters of POD family members in Luffa

2.5 鹽脅迫處理后絲瓜葉片POD活性升高

為了研究POD在絲瓜幼苗受鹽脅迫時的作用，本研究測定了鹽脅迫后絲瓜葉片中POD活性的變化。結果表明，在受到鹽脅迫后，絲瓜葉片中POD活性升高，隨著鹽處理濃度的增加，POD活性增加，達到極顯著水平（圖7）。

圖7 鹽脅迫后絲瓜葉片POD活性Fig. 7 POD activity of Luffa leaves after salt stress

2.6 絲瓜POD家族成員鹽脅迫表達分析

采用qRT-PCR技術對絲瓜POD家族成員在不同濃度鹽脅迫下的表達進行分析。結果表明，在200、500 mmol/L NaCl溶液處理下，56個基因受NaCl脅迫誘導表達，包括6個基因（Lac07 g019770、Lac08g017630、Lac08g017630、Lac09g 021570、Lac10g006770、Lac11g002020）在200、500 mmol/L脅迫處理下極度上調表達（>100倍），另外有14個基因在絲瓜葉片中不表達（圖8）。對80個檢測到的基因進行表達趨勢分析，獲得8種基因表達趨勢模式，有2種顯著的基因表達趨勢模式（P<0.01）（圖9）。其中profile7模式中，17個基因在200、500 mmol/L脅迫處理下表達量依次升高，profile6模式中，18個基因受鹽脅迫后表達量升高，且在200、500 mmol/L脅迫處理下表達量相似（圖9）。另外，11個基因只在500 mmol/L脅迫處理時表達量上升（profile4），10個基因只在200 mmol/L脅迫處理下表達量上升（profile5），8個基因在200 mmol/L脅迫處理下無變化，而在500 mmol/L脅迫處理下表達量下降（profile3）。

圖8 絲瓜POD家族成員鹽脅迫表達分析Fig. 8 Gene expression levels of POD family members after salt stress in Luffa

3 討論

POD是一種對環境條件十分敏感的氧化酶類，其主要作用是清除氧代謝中產生的活性氧，是植物在逆境條件下酶促防御系統的關鍵酶之一[8-9]。植物在受到逆境脅迫時，導致ROS累積，隨后過氧化物酶活性升高，增強植物清除活性氧的能力，降低ROS對細胞功能的傷害[5,19]。油棕幼苗經過緩慢低溫脅迫可以提高POD活性，進而提高油棕幼苗抗寒性[20]。在抗病木薯種質受到細菌性萎蔫病侵染后，POD活性顯著高于感病品種，POD與多酚氧化酶和苯丙氨酸解氨酶活性可作為木薯抗病性鑒定的輔助指標[21]。本研究中，絲瓜受到鹽脅迫后，POD活性增強，并且隨NaCl濃度升高而活性增強，其可能參與絲瓜鹽脅迫下活性氧的清除，降低活性氧對細胞的傷害，增強絲瓜對鹽脅迫的抵抗能力。本研究進一步從絲瓜基因組層面，鑒定到94個POD家族成員，全面分析了POD家族成員的理化性質、系統發育、染色體定位、基因共線性、基因結構、順式元件，以及對NaCl脅迫的響應，為進一步研究POD家族成員生物功能奠定基礎。

理化性質分析表明，絲瓜POD家族成員大部分為親水性蛋白（82/94）；一半富含酸性氨基酸，一半富含堿性氨基酸，這與茶樹[13]、石榴[22]、大豆[12]研究相似。基因結構和保守基序分析發現，所有的絲瓜POD家族成員都含有典型的過氧化物酶結構域，以及大部分成員含有全部的10個基序（66/94），推測其可能在維持細胞內ROS平衡起功能，不同的蛋白基序可能決定了其參與不同的調控途徑，執行不同的生物學功能[23-24]。

基因復制是基因組進化和功能分化的關鍵動力之一[25]。在進化歷史過程中，大多數高等植物都經歷了多倍體化，是植物提高環境適應性的普遍現象[26]。在棉花[27]、二穗短柄草[28]、葡萄[23]中POD家族基因進化過程中，發生基因串聯重復或者片段重復，是POD家族基因演化的主要驅動力之一。本研究中，在絲瓜7號染色體上有連續16個POD家族基因，5號染色體上有連續7個POD家族基因，表明POD家族基因在絲瓜中存在物種特異性擴張。基因共線性分析表明絲瓜和擬南芥物種之間存在12對共線性基因，其中部分擬南芥POD基因在絲瓜中存在多個同源基因，表明絲瓜POD家族存在串聯重復基因或者片段重復基因。

許多研究表明，植物過氧化物酶參與植物生長和發育過程中的各種細胞過程，以及植物對非生物和生物脅迫的響應。玉米中根中的膜結合過氧化物酶（pmPOX1、pmPOX2a、pmPOX2b和pmPOX3）受茉莉酸甲酯、水楊酸和病原體誘導表達[29]。葡萄中，30個POD基因受NaCl、drought、和ABA誘導表達[29]。蘋果中，超過94.1%（48/51）POD基因受ABA、PEG、NaCl脅迫誘導表達[15]，谷子中POD家族成員受干旱和ABA誘導表達[30]。通過對基因啟動子順式作用元件分析表明，絲瓜POD家族成員啟動子含有大量的與激素誘導、非生物脅迫相關的順式作用元件，表明其可能受非生物脅迫誘導表達。對絲瓜POD家族成員鹽脅迫后基因表達分析發現，56個基因受鹽脅迫誘導表達，其中6個基因極度上調表達（>100倍），可能這些基因參與絲瓜受到鹽脅迫后的過氧化物酶的合成，進而參與細胞ROS的清除。

綜上所述，本研究首次從絲瓜基因組鑒定出94個絲瓜POD家族成員，并對其進行理化性質、基因結構、基因定位、基因共線性分析以及鹽脅迫響應分析。其中56個POD基因受鹽脅迫誘導表達，其可能參與絲瓜對鹽脅迫響應。本研究為更深入研究絲瓜POD基因家族的生物學功能奠定基礎。