橡膠樹樹皮細胞木質素顯示方法的比較分析

史敏晶，張世鑫，丁 歡，蔣 毅,2，田維敏*

1. 中國熱帶農業科學院橡膠研究所/農業農村部橡膠樹生物學與遺傳資源利用重點實驗室/省部共建國家重點實驗室培育基地-海南省熱帶作物栽培生理學重點實驗室，海南海口 571101；2. 西藏農牧學院，西藏林芝 860000

巴西橡膠樹（Hevea brasiliensisMuell. Arg.，以下簡稱橡膠樹）是最重要的人工栽培多年生產膠植物，為世界所需天然橡膠的主要來源[1]。橡膠樹樹皮中的乳管作為天然橡膠合成和儲存的特異組織，與天然橡膠的生產息息相關。割膠是當前從橡膠樹乳管組織中獲取天然橡膠的唯一途徑，割膠后橡膠樹乳管的排膠速度和排膠時間直接決定著膠乳的產量。因此，割膠后的排膠機理一直受到研究者的極大重視[2-5]。

橡膠樹成熟乳管的封閉性結構和特殊的內含物導致了完整的乳管內部存在極高的膨壓，高達10~15個大氣壓[6-7]，割膠后開放的割口壓力與外界大氣壓相同，因此由外到內逐步增加形成一個壓力梯度，這一壓力梯度驅動膠乳向外涌流，形成了膠乳外排初始階段的主動力。可見，橡膠樹的膨壓與排膠密切相關。已有研究表明，細胞壁的彈性在維持細胞膨壓中具有重要作用[8-9]，彈性越好能維持的膨壓也越高；細胞壁的硬度和剛性越大，則膨壓越低[10-11]，而細胞壁的結構特征決定其彈性和剛性、硬度。細胞壁作為植物細胞最重要的特征結構，也是最早被觀察到的細胞結構，在很長的一段時間內被認為是一成不變的簡單結構，隨著科學的發展其作為一個高度動態變化的復雜網絡結構才被認識到[12]。植物化學分析表明，纖維素、半纖維素、果膠質和木質素等構成了細胞壁的主要成分，并在不同物種、組織、細胞類型中含量和結構都有差別[13]。木質素作為植物體中僅次于纖維素的第二大有機物質，其在細胞壁中含量的高低被證明對植物木材細胞的彈性和硬度有顯著影響[14]，進而影響膨壓[15]。晁金泉等[16]研究發現排膠通暢的橡膠樹無性系RY8-79的樹皮內層木質素的含量低于排膠凝滯的無性系PR107，而AN等[17]證明RY8-79的膨壓明顯高于PR107，可見在橡膠樹樹皮中木質素含量的高低與膨壓之間存在關聯。目前，對橡膠樹樹皮組織木質素的定位研究缺乏，尋找一種簡單、直觀顯示樹皮中木質素的方法對于分析其膨壓的高低，以及比較不同品系木質素含量差異與排膠特性之間的關系都具有重要的意義。

植物木質素的顯示方法目前主要有組織化學染色、熒光顯微鏡技術、共聚焦拉曼顯微鏡以及透射電鏡等[18-24]，其中組織化學染色簡單、快捷，所以在木質素定位分析中應用較為廣泛[25]。本研究以RY8-79和PR107成齡橡膠樹樹皮為研究材料，采用石蠟切片結合木質素組織化學染色，比較分析了Wiesner反應方法（間苯三酚法）、M?ule反應方法（高錳酸鉀染色法）以及番紅染色結合熒光顯示木質素的方法，旨在探尋一種適合定位分析橡膠樹樹皮木質素的方法，為研究橡膠樹排膠膨壓以及種質鑒定分析提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 選取種植于中國熱帶農業科學院儋州南辰農場（海南儋州寶島新村）7年生的RY8-79和PR107成齡健康橡膠樹各3株，于樹高1.5 m處用打孔器采集樹皮，單面刀片分割成0.5 cm×1.0 cm左右的組織小塊，80%（V/V）酒精固定備用。

1.1.2 主要試劑和儀器 制備石蠟切片所需的乙醇、正丁醇、冰醋酸、二甲苯為國產分析純；高錳酸鉀購自國藥集團；木質素染色液（間苯三酚法）購自上海源葉生物科技有限公司；石蠟為生物組織切片專用，光學顯微鏡為德國Leica DMLB型。

1.2 方法

1.2.1 光學顯微切片的制備 用于木質素染色的樹皮材料分割后經80%（V/V）酒精固定24 h，乙醇梯度脫水，正丁醇透明，石蠟包埋，具體方法參照常規石蠟切片方法。用于顯示乳管的樹皮材料則經80%（V/V）酒精固定24 h，乙醇梯度脫水后，需碘-溴冰醋酸試劑60 ℃處理36 h，然后乙醇脫水后經正丁醇透明并石蠟包埋，具體方法參見史自強等[26]的方法并稍作修改。石蠟切片厚度10~20 μm。

1.2.2 Wiesner反應 即鹽酸-間苯三酚染色法，染色步驟主要是：切片材料經二甲苯脫蠟和酒精梯度復水后，滴加溶于95%乙醇的2%間苯三酚（A液）數滴，孵育幾分鐘后加入等量的12%鹽酸（B液），封片，在顯微鏡可見光下觀察拍照。

1.2.3 M?ule反應 即高錳酸鉀（KMnO4）染色法，染色步驟主要是：切片材料經二甲苯脫蠟和酒精梯度復水后，用0.5% KMnO4（W/V，水劑）染色5 min，蒸餾水漂洗后加入12%鹽酸（V/V）浸泡1 min，然后用29%氨水（V/V）封片，顯微鏡可見光下觀察拍照。

1.2.4 番紅染色反應 切片材料二甲苯脫蠟后酒精梯度復水，1%番紅水溶液（W/V，水劑）染色2 h，蒸餾水漂洗5 min，75%酒精漂洗5 min，50%甘油封片。熒光顯微鏡下，分別于可見光和546 nm綠色熒光激發光源下觀察成像。

1.2.5 固綠染色 經碘-溴染色處理后的切片材料二甲苯脫蠟后固綠染色1 h，中性樹膠封片，光學顯微鏡Leica DMLB下觀察乳管的位置并成像。

2 結果與分析

2.1 橡膠樹無性系PR107樹皮不同染色方法木質素定位分析

橡膠樹無性系PR107的樹皮組織在不同的木質素染色方法下顯示結果有差異。Wiesner正反應顏色為紅色，但在橡膠樹PR107的樹皮組織中顯色不明顯，尤其在形成層區、水囊皮和黃皮層這些軟樹皮中呈現紅色的木質素基本不可見，僅在靠近形成層和水囊皮的中部有2列顏色相對較深的區域，但也無紅色顯示（圖1A）。對顏色較重的區域放大觀察，也未見明顯的紅色呈現（圖1B）。這些結果表明，Wiesner顯色反應對橡膠樹樹皮薄壁組織的染色效果較差，同時也說明這些部位木質素沉積較少。M?ule染色木質素正反應為姜黃色，樹皮中在靠近形成層和水囊皮中部有2列顏色相對較深的區域，主要表現為黃褐色（圖1C）。由放大圖可知，不同類型細胞染色有一定的區別，同一細胞內染色深的部位主要定位在細胞角隅處，除了細胞壁外，細胞的內含物也有染色；射線作為典型的薄壁細胞，染色相較有次生加厚的篩管更為明顯（圖1D）。可見，在橡膠樹中這種染色方法的特異性不是很強，其他物質也能被染色從而對木質素的定位存在干擾。另外，M?ule染色導致細胞結構不清晰，可能是染色過程中使用的強酸和強氧化劑對細胞組織存在破壞作用。番紅染色的明場觀察，切片中有少許部位被染成淡紫紅色，在靠近形成層和水囊皮中部有2列顏色相對較深的區域（圖1E）。局部放大結果表明，這2列相對深色區域在細胞壁尤其是角隅處有較明顯的紫紅色（圖1F）。番紅染色后利用綠光激發，在熒光顯微鏡下觀察到清晰的紅色熒光，紅色熒光分布的強弱與可見光下3種方法染色深淺部位基本一致，且不同類型細胞紅色熒光區分明顯（圖1G~圖 1H）。在低倍鏡和高倍鏡下形成層區域紅色熒光都極弱，基本為背景色；射線細胞的熒光明顯弱于篩管等維管組織；石細胞中含大量木質素，熒光極強，符合已知細胞類型對應的木質素含量的常識。熒光顯示的結果中，具有明顯熒光的部位均為細胞壁，尤其是角隅處，細胞內含物中無染色干擾，可見番紅結合熒光顯示效果好且特異性好。

2.2 橡膠樹無性系RY8-79不同染色方法木質素定位分析

橡膠樹無性系RY8-79的樹皮組織在Wiesner中顯色不明顯，在形成層區、水囊皮和黃皮層等軟樹皮中未觀察到明顯的木質素陽性染色（圖2A）。對顏色略重的區域放大觀察，不同的細胞類型之間未見明顯的染色差異（圖2B），這些結果表明RY8-79的樹皮組織對Wiesner的顯色反應較差且木質素沉積少。M?ule染色后軟樹皮中有幾列黃褐色顏色相對較深的區域（圖 2C），但放大后未觀察到細胞壁等處有明顯染色（圖2D）。另外，細胞內含物也有強烈染色，從而對木質素的定位存在干擾。番紅染色可見光觀察發現，切片中染色極淺（圖2E），局部放大結果表明，組織細胞壁及其角隅處均無明顯的紫紅色（圖2F）。相同的組織切片經綠光激發后，在熒光顯微鏡下可觀察到有強弱區分的紅色熒光，其紅色熒光強的位置與可見光下3種方法染色較深的部位基本一致（圖2G~圖2H）。

圖2 RY8-79樹皮不同木質素染色方法比較分析Fig. 2 Comparison of different staining methods for lignin in bark of RY8-79

由可見光明場下3種木質素顯示方法的結果可知，無論PR107還是RY8-79，染色深的部位在不同顯色方法中基本一致，表明該區域的確是木質素含量較高的組織。但染色整體都偏淺淡，不同類型細胞差異不明顯，表明在橡膠樹樹皮薄壁細胞中木質素含量不高。強熒光的組織部位與可見光下染色深的部位基本一致，但熒光下不同類型細胞之間可以觀察到較明顯的差異，且熒光清晰，能很好地顯示木質素在不同位置的含量高低，結合其良好的特異性，番紅染色后熒光觀察是最適合橡膠樹樹皮組織細胞的木質素定位的方法。

PR107和RY8-79是2種具有不同排膠特性的種質，木質素熒光在PR107中明顯強于RY8-79，可見PR107的木質素含量明顯高于RY8-79。

2.3 橡膠樹無性系PR107和RY8-79中乳管列的分布

經碘-溴染色后，次生乳管列中的天然橡膠顯示為黑褐色，與其他組織細胞存在明顯區別（圖3）。PR107樹皮組織中可以觀察到形成層外側一列明顯的乳管，水囊皮中也有一列乳管，黃皮層中的一列連貫性略差的乳管，其他靠近砂皮層的乳管因分散而不能形成明顯的列狀；石細胞較多，形成石細胞列（圖3A）。RY8-79在形成層外側僅見一小段乳管列，水囊皮中有2列乳管，黃皮層中乳管較多，但排列較雜亂；石細胞數量少（圖3B）。將PR107和RY8-79中乳管列的分布與木質素的定位進行比較分析，發現乳管列所在的區域木質素含量較高，二者表現出高度的重合。在每個乳管列分布的區域，PR107通常有多層細胞表現出較強木質素熒光（圖1H），而RY8-79普遍僅一列細胞表現較強熒光（圖2H）。

圖3 PR107和RY8-79樹皮中的次生乳管細胞分析Fig. 3 Analysis of secondary laticifer in bark of PR107 and RY8-79

3 討論

木質素是構成植物細胞壁的主要成分之一，其在細胞壁中含量的高低被證明與植物細胞的彈性和硬度有關，并影響膨壓[14-15]。橡膠樹乳管內部膨壓高達10~15個大氣壓，割膠后由外到內形成的壓力梯度是膠乳外排的初始主動力。膨壓對于橡膠樹排膠至關重要，但目前橡膠樹中關于膨壓的研究較少，而膨壓大小與木質素含量高低的關系目前尚不清楚。晁金泉等[16]通過乙酰溴法測定得出RY8-79樹皮內層木質素含量低于PR107，而AN等[17]證明RY8-79的膨壓高于PR107，由此推測橡膠樹樹皮中木質素含量的高低與膨壓大小可能呈負相關。乙酰溴法測定木質素含量需要用到高氯酸等危化管制試劑，并且方法比較繁瑣，利用染色方法對橡膠樹樹皮組織中的木質素進行定位研究則能更為直觀地顯示樹皮中木質素含量的高低，但目前缺乏這方面的研究。

通過比較Wiesner反應方法（間苯三酚法）、M?ule反應方法（高錳酸鉀染色法）以及番紅染色結合熒光顯示木質素等幾種組織化學染色方法，發現橡膠樹樹皮染色較深的部位在幾種方法中是一致的，表明這些位置木質素的含量的確高于其他的部位。整體來看，橡膠樹軟樹皮中細胞木質素染色是很淺的，表明在軟樹皮中木質素總體含量不高。針對木質素含量不高的這些薄壁組織，染色方法的靈敏度對于區分不同組織或者不同種質木質素含量高低顯得尤為重要。本研究結果表明番紅染色結合熒光定位木質素的效果是最好的，不同組織之間能觀察到明顯的差異。其中，形成層區作為分生組織，細胞正在分化發育中，次生細胞壁的合成弱，木質素含量應最低，在熒光下觀察，形成層區的確熒光最弱。PR107中木質素的熒光明顯強于RY8-79，表明PR107中的木質素含量高于RY8-79，這一結果與晁金泉等[16]測定的結果一致。另外，Wiesner反應方法（間苯三酚法）和M?ule反應方法（高錳酸鉀染色法）相較番紅染色，染色過程中需要用到管制藥品間苯三酚和強氧化劑KMnO4，以及具有腐蝕性的強酸試劑鹽酸和刺激性試劑氨水，這些試劑不僅對操作人員有毒副作用，而且對顯微鏡尤其是物鏡鏡頭也有一定的損傷。經比較分析，番紅染色結合熒光顯示木質素是目前適合橡膠樹樹皮組織分析的一種簡便、安全的方法。本方法的建立不僅有利于通過研究木質素含量差異從而分析橡膠樹的排膠特性，對于橡膠樹種質的鑒定也有參考價值。

本研究通過比較樹皮中乳管列的位置和強木質素熒光的部位，首次發現木質素含量高的位置與乳管列分布的位置高度吻合，這一特征在PR107和RY8-79中都存在，由此推測在軟樹皮中主要是乳管細胞及其周圍的細胞木質素含量較高，這可能與保護高膨壓的乳管有關。相對PR107，RY8-79中膨壓更高，但周圍細胞木質素含量偏低，這也可能是生產中RY8-79更容易爆皮流膠的原因之一。

橡膠樹樹皮中分布大量石細胞[1,27]，作為一種典型的木質化加厚的厚壁組織，史敏晶等[27]研究認為石細胞的分布具有品系特征，且發現PR107的石細胞分布明顯高于RY8-79，而本研究的定位分析表明軟樹皮中PR107的木質素分布也高于RY8-79，薄壁細胞中的木質素含量高低是否與石細胞多少之間有對應關系也值得進一步分析。石細胞由于其特殊的結構特征，容易識別，如果能建立石細胞數量和木質素含量之間的相關關系，那么，通過石細胞的多少間接分析木質素含量高低對于大規模、快速鑒定和篩選木質素含量高低的品系則具有重要的意義。