臍橙缺鉬癥的診斷及光合生理響應

陸芃希，張 峻，肖本木，衣 萌，王 平，李 延，吳良泉*

1. 福建農林大學資源與環境學院/福建省土壤環境健康與調控重點實驗室，福建福州 350002；2. 湖北省陽新縣農業農村局，湖北黃石 435000；3. 福建農林大學園藝學院，福建福州 350002

鉬是植物生長發育所必需的微量元素，其作用主要通過鉬與蛋白質或蝶呤結合形成含鉬輔因子（molybdenum cofactor, Moco）的鉬酶來實現[1]。存在于高等植物體內的鉬酶有硝酸鹽還原酶（nitrate reductase, NR）、醛氧化酶（aldehyde oxidase, AO）、黃嘌呤脫氫酶（xanthine dehydrogenase, XDH）、亞硫酸鹽氧化酶（sulfite oxidase,SO）和線粒體氨肟還原蛋白（mitochondrial amidoxime reducing component，mARC）[2]。MENDEL等[3]研究發現，當Moco缺失時，煙草、大麥和水稻的NR、AO、XDH酶活性均喪失。小麥缺鉬會降低TaCnx1轉錄，抑制Moco的生物合成，使NR、SO、AO、XDH酶活性顯著降低[4]。鉬酶調控植物體內氮、碳、激素和活性氧代謝等多種生理過程，與植物低溫[5]、干旱[6]、鹽害[7]等非生物脅迫的抗性均有關。柑橘是我國種植面積最大、產量最高的果樹，2019年我國柑橘種植面積和產量分別為261.73萬 hm2和4584.5萬t[8]。鉬是柑橘生長發育所必需的營養元素，目前柑橘鉬營養的研究集中于土壤、葉片鉬含量測定和鉬肥施用效果方面，陶夢銘等[9]對湖南、湖北柑橘主產區225個果園土壤有效鉬含量的測定結果表明，橘園土壤有效鉬的含量范圍為0.002~1.326 mg/kg，土壤有效鉬含量缺乏（<0.05 mg/kg）橘園的占比為23.5%，葉片鉬含量缺乏（<0.05 mg/kg）的比例為20.4%。馬小川等[10]測定了湖南省147個溫州蜜柑園的土壤有效鉬含量，結果顯示，有11.5%的果園土壤有效鉬含量缺乏（<0.05 mg/kg）。廖育林等[11]在河沙土發育椪柑園上的試驗表明，與對照相比較，噴施鉬酸銨處理的株產提高了11.8%，椪柑果實維生素C、全酸和可溶性固形物含量均有不同程度增加。文向榮[12]研究發現，謝花后噴施鉬酸銨可提高柑橘的著果率、單果重和株產，增加果實的可溶性固形物含量、降低果皮厚度。上述研究表明，柑橘園土壤和樹體存在鉬素營養不足的問題，施鉬可提高柑橘的產量和品質。由于柑橘樹體的鉬含量僅為微量元素銅、硼、錳、鋅、鐵的1/100~1/800[13]，因此，缺鉬癥在柑橘生產上極為罕見，缺鉬對柑橘光合生理的研究則未見報道。光合作用是決定柑橘產量和品質的基礎，果樹干物質的90.0%以上來自于葉片光合產物[14]，本研究通過田間調查，結合形態診斷、葉片分析診斷以及田間鉬酸銨噴施試驗，開展臍橙鉬缺乏癥狀的診斷，研究缺鉬對臍橙光合生理的影響，旨在為柑橘科學施用鉬肥提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臍橙葉片黃化癥調查 2020年5月下旬，位于湖北省黃石市陽新縣浮屠鎮下李村沁園家庭農場（29°51′18″N，115°2′49″E）的部分柑橘出現葉片黃化，該果園為2019年3月種植、以枸橘作為砧木的九月紅臍橙園，土壤類型為山地紅壤，柑橘沿緩坡地等高線種植，株行距為2 m×4 m，園地面積約3 hm2。現場調查發現，園區內臍橙葉片黃化的現象呈零星發生，癥狀發生與否、癥狀嚴重程度與果樹種植地形（坡度、坡向、坡位）的關系并無明顯規律可循。現場咨詢結合癥狀出現前2個月的農事記錄查閱，顯示該果園并未遭遇低溫、干旱等不良氣候，可以排除低溫、干旱等不良氣候的危害。全園柑橘的農事管理措施一致，所施用的肥料有尿素、水溶性肥料（N-P2O5-K2O配比為8-4-45，Fe、Mn、Cu、B、Zn含量分別為260、320、75、100、230 mg/kg），噴施的農藥有阿維菌素、噻螨酮、呋蟲胺、咪鮮胺，從肥料、農藥的使用方法和葉片黃化出現的時間分析，可以排除因肥料、農藥不合理使用而造成肥害或藥害的可能。

1.1.2 樣品采集和測定 田間柑橘生理性病因診斷樣品的采集參照本團隊的方法[15]，于2020年6月在該片果園中選擇葉色正常、輕度黃化（新葉黃化部分的面積<1/3）和重度黃化（新葉黃化部分的面積>1/3）的臍橙幼樹各20株，對當年生春梢由上往下的第2片完全展開葉進行光合作用速率、葉綠素熒光參數、光合色素和光合產物含量、RUBP羧化酶活性的測定，光合作用速率、葉綠素熒光參數測定重復10次，其他項目重復4次。采集臍橙樹體中部、東南西北中5個方位、當年生春梢從上往下第1~3片完全展開葉，每株樹采集15片葉，每4株樹的60片葉混合為1個樣品，20株樹合計采集5個樣品，即5次重復。樣品經稀鹽酸擦拭、去離子水洗凈、烘干粉碎后用于養分含量測定。

1.1.3 鉬酸銨噴施試驗 2020年6月選擇重度黃化且生長一致的臍橙幼樹為供試樹體進行田間試驗，試驗前采集距樹干10 cm 處0~20 cm土層的土壤混合樣。經測定，土壤基本理化性狀為pH 5.23、有機質11.61 g/kg、堿解氮331.02 mg/kg、有效磷16.77 mg/kg、速效鉀337.81 mg/kg、交換性鈣620.00 mg/kg、交換性鎂50.15 mg/kg、有效鋅2.19 mg/kg、水溶性硼0.95 mg/kg、有效鉬0.14 mg/kg。試驗設置噴施0.05%鉬酸銨（分析純試劑）和噴施等量清水2個處理，噴施2次，每次間隔7 d，單株重復，每個處理均重復10次。試驗前和試驗處理后第15天分別采集當年生春梢由上往下第1~3片完全展開葉用于鉬含量的測定。

1.2 方法

1.2.1 土壤和葉片養分含量 參照《土壤農業化學分析方法》[16]，采用電位法測定土壤pH（水土比2.5:1）；外加熱、重鉻酸鉀氧化法測定有機質；堿解擴散法測定堿解氮；碳酸氫鈉浸提、鉬銻抗比色法測定有效磷；醋酸銨浸提、火焰光度法測定速效鉀；醋酸銨浸提、原子吸收分光光度法測定交換性鈣、交換性鎂；姜黃素比色測定土壤有效硼。葉片氮采用硫酸-過氧化氫消煮、微量滴定法測定；鉀、鈣、鎂、鋅用鹽酸浸提、原子吸收分光光度法測定；硼用姜黃素比色法測定。土壤有效鉬用草酸-草酸銨浸提、ICP-MS測定[17]，葉片鉬含量用硝酸-鹽酸-氫氟酸-高氯酸消解、ICP-MS測定[18]。為保證測定結果的準確性，測定過程中采用國家標準樣品（柑橘葉片GBW10020，紅壤GBW07416a）進行質量控制，葉片養分含量均以干重為單位表示。

1.2.2 光合速率 采用CIRAS-2型便攜式光合儀（英國PP Systems公司生產）測定凈光合速率（Pn），測定時間為8：00~12：00，通過內置可調CO2供氣系統和人工光源，將測定條件設置為CO2濃度（Ca）350±10 μL/L，有效光合輻射(PAR)1000 μmol/(m2·s)，儀器同時讀取氣孔導度（Gs）和胞間CO2濃度（Ci）。

1.2.3 光合色素含量 采用混合提取劑提取[19]、UV-1801型紫外分光光度計測定葉綠素a（Chla）、葉綠素b（Chlb）和類胡蘿卜素（Car）的含量，為避免葉片樣品因水分含量不同而帶來的誤差，光合色素含量以葉面積為單位（μg/cm2）表示。

1.2.4 葉綠素熒光參數 采用便攜式植物效率分析儀（Handy PEA，英國Hansatech公司生產）測定。

1.2.5 光合產物含量 采用蒽酮比色法[20]測定葉片可溶性糖、蔗糖和淀粉含量。

1.2.6 RUBP羧化酶活性 用蘇州科銘生物技術有限公司生產的二磷酸核酮糖羧化酶（Rubisco）試劑盒測定，測定方法按試劑盒說明書，RUBP羧化酶活性單位為每分鐘、每毫克蛋白氧化1 nmol NADH的量來表示。

1.3 數據處理

采用SPSS 19.0單因素方差分析，Ducan’s多重檢驗方法分析試驗數據。

2 結果與分析

2.1 臍橙葉片黃化的病因診斷

2.1.1 形態診斷 九月紅臍橙葉片黃化時間開始于2020年5月底，黃化癥狀始見于當年抽生春梢的新葉（圖1A），黃化部位多見于葉片中脈兩側，開始時癥狀表現為葉脈間出現圓形或橢圓形色澤鮮黃的水漬狀小圓斑（圖1B），隨著癥狀的發展，黃斑變大、顏色加深，相鄰黃斑融合形成黃色斑塊，黃化部位的葉色除葉肉褪綠外，葉脈也褪綠（圖1C）。癥狀葉在黃化部位或近黃化部位處發生扭曲，葉緣向上、向內抱合，黃化葉片變小、變薄（圖1D），癥狀葉不易脫落。

圖1 臍橙葉片的黃化癥狀Fig. 1 Cholorisis symptoms of navel orange leaves

迄今，田間柑橘可見缺鉬癥狀的文獻僅見STEWART等[21]的報道，九月紅臍橙的黃斑表現形式與STEWART等描述的缺鉬“黃斑病”一致，所不同的是，九月紅臍橙癥狀葉的葉背上未見有褐色膠狀物質，而STEWART等的報道中則沒有柑橘缺鉬后葉片扭曲、抱合的癥狀。九月紅臍橙葉片的癥狀特征與柑橘缺鈣的新葉葉尖黃化、缺硫的新葉均勻黃化、缺鋅缺錳的斑駁狀黃化、缺鐵的“脈間失綠、漂白”、缺硼的“葉脈開裂、黃化”[22]有明顯不同，也與具有相似黃化癥狀的柑橘始葉螨（黃蜘蛛）危害和脂點黃斑病有明顯區別，始葉螨（黃蜘蛛）危害會造成葉背凹陷、葉面凸起，脂點黃斑病會導致葉片出現皰疹狀突起[23]，與九月紅臍橙癥狀葉的葉面和葉背表面整潔、光滑（圖1E、圖1F），加之，癥狀出現前果園有噴施可防治始葉螨（黃蜘蛛）危害的阿維菌素、噻螨酮，噴施可防治脂點黃斑病的咪鮮胺，因此，可以排除這2種病蟲害危害的可能。形態診斷可初步判斷九月紅臍橙葉片黃化的病因是缺鉬。

2.1.2 葉片分析診斷 如圖2所示，臍橙葉片鉬含量隨黃化程度的加重而降低，正常、輕度黃化、重度黃化葉片的鉬含量的平均值分別為0.12、0.08、0.05 mg/kg，其中輕度黃化、重度黃化葉片的鉬含量分別較正常葉片降低了33.3%、58.3%，差異均達極顯著。一般認為，葉片鉬含量低于0.10 mg/kg會造成柑橘鉬的缺乏[24]，而黃化臍橙葉片的鉬含量均低于此值。

圖2 不同黃化程度臍橙葉片的鉬含量Fig. 2 Molybdenum content in navel orange leaves with different degrees of cholorisis

氮、鉀、鈣、鎂、鋅和硼的缺乏也會導致柑橘葉片黃化，測定結果表明（圖3），正常、輕度黃化、重度黃化葉片的氮、鉀、鎂和硼含量分別為2.92~3.08%、1.77~1.83%、0.26~0.31%和37.00~47.23 mg/kg，均處于柑橘生長適宜養分含量范圍[25]。葉片鉀、鈣、硼、鋅含量在3種葉片間均無顯著差異；氮、鎂含量表現為輕度黃化、重度黃化葉片顯著高于正常葉片，其原因可能與后者干物質積累較多所致的“稀釋效應”有關；正常、輕度黃化、重度黃化葉片的鈣含量（2.13%~2.29%）均處于缺乏水平（Ca<2.5%），鋅含量（18.30~18.61 mg/kg）均處于缺乏水平（Zn<20 mg/kg）[25]，但樣品之間無明顯差異，說明臍橙葉片黃化不是上述元素缺乏所致。

圖3 不同黃化程度臍橙葉片的氮、鉀、鈣、鎂、硼和鋅含量Fig. 3 N, K, Ca, Mg, B and Zn content in navel orange leaves with different degrees of cholorisis

2.1.3 施肥診斷 參照莊伊美[25]的柑橘土壤養分分級標準，試驗地土壤的有效鉬含量屬于低量水平（<0.15 mg/kg）。田間觀察發現，噴施0.05%鉬酸銨可使臍橙葉片黃化癥狀明顯減輕，這與STEWART等[21]的研究結論一致，處理后第15天的采樣分析結果表明（圖4），噴施鉬酸銨處理的葉片鉬含量（0.408 mg/kg）較試驗前（0.046 mg/kg）提高787.0%，較噴施清水處理（0.066 mg/kg）提高518.2%，差異均達極顯著水平。噴施清水處理的葉片鉬含量與試驗前并無顯著差異，可排除噴施鉬酸銨處理的柑橘因氣溫升高，帶來土壤供鉬能力和柑橘根系鉬吸收能力提高，而使葉片黃化癥狀“自愈”的可能。2021年6月對試驗果樹進行再次觀察，發現噴施鉬酸銨處理的葉色正常，而噴施清水處理的春梢新葉仍有缺鉬黃化癥，這一方面證明九月紅臍橙的黃化癥為缺鉬所致，另一方面說明噴施鉬肥具有較長的后效。

圖4 噴施鉬酸銨對臍橙葉片鉬含量的影響Fig. 4 Effect of ammonium molybdate spraying on molybdenum content of navel orange leaves

2.2 缺鉬對臍橙光合生理的影響

2.2.1 光合色素含量 缺鉬導致臍橙葉片光合色素含量降低（表1），與正常葉片相比較，輕度黃化和重度黃化葉片的Chla、Chlb、Chl(a+b)和Car含量分別降低44.1%、47.8%、37.3%、44.9%和63.6%、65.4%、56.2%、64.0%，差異均達極顯著。輕度黃化和重度黃化葉片的Chla/b比值較正常葉片分別提高10.0%和6.2%，表明缺鉬對臍橙葉片Chlb的影響大于Chla。

表1 缺鉬對臍橙葉片光合色素含量的影響Tab. 1 Effect of molybdenum deficiency on photosynthetic pigments content of navel orange leaves

2.2.2 葉綠素熒光參數 TRo/RC、ETo/RC、Fv/Fo、Fv/Fm、ETo/CSm分別反映PSII捕獲電子、傳遞電子的能力、PSII潛在活性、最大光化學效率和電子傳遞的量子產額[26]，由表2可知，輕度黃化葉片的TRo/RC、ETo/RC較正常葉片無顯著差異，Fv/Fo、Fv/Fm、ETo/CSm均顯著或極顯著降低，反應中心的熱耗散系數DIo/RC顯著提高；除TRo/RC外，重度黃化葉片的ETo/RC、Fv/Fo、Fv/Fm、ETo/CSm均顯著或極顯著低于正常葉片，DIo/RC較正常葉片極顯著提高，說明缺鉬會使臍橙葉片PSII反應中心的電子傳遞受抑、光化學效率降低，吸收的光能更多以熱耗散的形式損失，導致光能轉化效率的下降。

表2 缺鉬對臍橙葉片葉綠素熒光參數的影響Tab. 2 Effect of molybdenum deficiency on chlorophyll fluorescence parameters of navel orange leaves

2.2.3 RUBP羧化酶活性 臍橙葉片RUBP羧化酶活性隨缺鉬程度的增加而降低（圖5），與正常葉片相比較，輕度黃化和重度黃化葉片的RUBP羧化酶活性分別降低28.6%、40.7%，差異均達極顯著。

圖5 缺鉬對臍橙葉片RUBP羧化酶活力的影響Fig. 5 Effect of molybdenum deficiency on the activity of RUBP carboxylase in navel orange leaves

2.2.4 光合作用速率 缺鉬導致臍橙葉片的Pn、Gs、Tr降低，Ci升高（表3）。與正常臍橙葉片相比較，輕度黃化葉片和重度黃化葉片的Pn、Gs、Tr分別降低了52.8%、28.6%、46.8%和67.4%、49.2%、60.0%，Ci分別提高22.8%和49.0%，差異均達顯著或極顯著。Gs降低、Ci提高表明缺鉬導致臍橙葉片光合速率降低的原因既有氣孔因素又有非氣孔因素。

表3 缺鉬對臍橙葉片光合作用的影響Tab. 3 Effect of molybdenum deficiency on photosynthesis rate of navel orange leaves

2.2.5 光合產物含量 與正常葉片相比較，輕度黃化和重度黃化葉片的可溶性糖、蔗糖含量分別下降22.6%、39.1%和30.7%、36.3%，差異均達顯著水平（圖6）。輕度缺鉬葉片的淀粉含量與正常葉片無顯著差異，而重度缺鉬葉片的淀粉含量較正常葉片提高了59.3%，差異極顯著。武麗等[27]的研究結果顯示，缺鉬處理第20天的煙草葉片淀粉酶活性與施鉬處理無明顯差異，第30天時則較施鉬處理降低了8.2%，差異達顯著水平，說明缺鉬降低淀粉轉化為單糖的能力。

圖6 缺鉬對臍橙葉片光合產物含量的影響Fig. 6 Effect of molybdenum deficiency on photosynthetic product content in navel orange leaves

3 討論

有缺鉬癥狀的葡萄柚、臍橙葉片鉬含量變幅僅為0.03~0.08 mg/kg[21]，而葉片鉬含量≥0.10 mg/kg則表示柑橘鉬營養充足[24]，說明柑橘鉬缺乏和適宜含量的變幅很窄，這是柑橘缺鉬癥在生產上極為罕見、迄今國內尚未有柑橘缺鉬癥狀報道的原因。發生在九月紅臍橙上的缺鉬癥狀與STEWART等[21]描述的“黃斑病”癥狀一致，但前者未見葉背有褐色膠狀物質，后者則沒有葉片扭曲、抱合的癥狀，這或許與柑橘品種、癥狀嚴重程度等的不同有關。有研究表明，土壤鉬的生物有效性受土壤pH、有機質、質地、磷及硫含量等多種因素影響[26-27]，因此，對于土壤含量和柑橘需要量都極少的鉬元素而言，柑橘園局部土壤理化性質的差異會影響土壤鉬的生物有效性，這可能是調查果園缺鉬癥狀呈現零星發生的原因。除形態診斷技術外，本研究采用的葉片分析診斷和施肥診斷結果也進一步證實，發生在九月紅臍橙新葉的水漬狀黃斑、葉抱合癥狀為缺鉬所致。本研究結果表明，缺鉬導致臍橙葉片光合速率降低，其原因既有氣孔因素（Gs降低）也有非氣孔因素（Ci提高）。缺鉬造成柑橘光合作用下降的非氣孔因素可能為：（1）光合色素含量降低、RUBP酶活性下降，使光合固定CO2的能力減弱。δ-氨基酮戊酸（ALA）是葉綠素的前體[28]，ALA形成受ALA脫水酶（ALAD）和膽色素原脫氨酶（PBGD）調控[29]，缺鉬導致亞硫酸鹽氧化酶活性降低，抑制了含巰基的ALAD和PBGD的合成，導致葉綠素合成受阻[30]，RUBP羧化酶催化1，5-二磷酸核酮糖和CO2生成磷酸甘油酸，是光合碳同化的限速酶[31]。缺鉬脅迫導致合成RUBP羧化酶大亞基的蛋白表達量下降和酶合成受阻[31]，可能是RUBP羧化酶活性降低的原因。（2）葉綠體類囊體膜結構受損。由膜脂、蛋白和光合色素等組成的葉綠體類囊體膜是植物光合作用的場所，缺鉬一方面通過抑制無機態磷向有機態磷的轉化、降低蛋白質的合成影響葉綠體類囊體膜的形成[32]；另一方面，缺鉬降低了類胡蘿卜素（CAR）的含量，以及嘌呤代謝中由黃嘌呤脫氫酶（XDH）催化產生的酰脲（Ureides）的含量，已有研究表明，CAR[33]、Ureides[34]是活性氧的清除劑，其含量降低會增加自由基對膜脂的損傷，破壞葉綠體類囊體膜的結構[27]。（3）光合同化力下降。缺鉬脅迫下，臍橙葉片PSII反應中心潛在活性（Fv/Fo）、最大光化學效率（Fv/Fm）、電子傳遞能力（ETo/RC）以及量子產額（ETo/CSm）降低，由于光合電子傳遞是與合成ATP的光合磷酸化相偶聯，而且非環式電子傳遞又是以NADP+為最終電子受體，因此，光能轉化效率降低使缺鉬臍橙不能合成更多ATP和NADPH用于光合作用的碳同化。

4 結論

早春新梢新葉出現近圓形、鮮黃色水漬狀斑點或斑塊，葉扭曲、葉緣向上向內卷曲是診斷臍橙缺鉬的主要特征。缺鉬會導致臍橙光合色素含量、光能利用率和電子傳遞效率降低，光合作用受到抑制，柑橘生產過程中應重視含鉬肥料的施用。有關引發柑橘缺鉬的條件、柑橘不同品種以及不同砧穗組合的土壤和葉片鉬營養診斷標準還有待進一步研究。