一株臨滄覆土栽培蓋囊菇高溫品種可控環境因子優化研究

洪 鵬，和 敏，周會明，張焱珍，卯明娟，王 瑞，馬凱云，鄧 云

滇西科技師范學院生物技術與工程學院，云南臨滄 677000

蓋囊菇（Pleurotus cystidiosusO.K. Mill.）又名蓋囊側耳、泡囊側耳，是側耳科、側耳屬真菌，多分布于中國臺灣、云南、浙江等地，是一種高溫木腐菌，其肉質肥嫩可口，菌柄粗壯，含有多種氨基酸和維生素，除包括人體必需的8種氨基酸外，還含有維生素B1、維生素B2、煙酸等[1]，頗受消費者喜愛。因此，蓋囊菇具有重要的經濟價值，對該菇進行馴化研究對其開發利用意義較大。關于蓋囊菇的相關文獻報道較少，主要研究在種質資源馴化栽培[2-4]、活性化學成分開發[5]、原生質體融合[6]、系統發育分析[7-8]、生物活性[9-12]等方面，與其他市場常見人工栽培食用菌相比，該菇具有地域性強、栽培技術不完善以及生長環境特殊等特點，導致其大規模推廣滯后且受到嚴重的阻礙，培育地域性品種成為該菇商品化的發展趨勢。

生理特性的研究是大型真菌馴化栽培的前提，本研究以一株采集于云南省臨滄市的覆土栽培蓋囊菇高溫品種為材料，從該菇的可控環境條件入手，基于單因素試驗的基礎上采用正交優化試驗的方法研究不同溫度、瓊脂濃度、酸堿度、氧氣、光照等因素對蓋囊菇菌絲體生長及孢梗束形成的影響，為后續該菇在本市及其它地域的覆土栽培品種林下推廣提供一定理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 覆土栽培蓋囊菇高溫品種菌株由滇西科技師范學院食用菌課題組提供。

1.1.2 PSA培養基 馬鈴薯20%，蔗糖2%，瓊脂1.5%，水1 L，pH自然。

1.2 方法

1.2.1 菌株活化與接菌 將蓋囊菇菌絲試管從冰箱中取出放入室溫中培養7 d左右，然后轉接至活化培養基中（菌塊直徑為5 mm[13]，下同），在25 ℃下培養。待長滿后轉接至PSA平板培養基中，25 ℃下培養觀察并記錄。

1.2.2 生物學特性 （1）溫度試驗。以PSA為基礎培養基，第一次先設置0、5、10、15、20、25、30、35、40 ℃的溫度梯度進行試驗，并測定培養基滅菌前后的pH。在第一次溫度梯度的基礎上縮小溫度梯度進行第二次試驗，設置19、21、23、25、27、29 ℃的溫度梯度。2次試驗中每個溫度梯度均設置4個重復，培養皿型號為70 mm。接菌后，記錄菌絲萌發時間（d）、孢梗束形成時間（d）以及培養時間（d），待菌絲長至培養皿總面積約2/3時，采用十字交叉法測量菌落直徑，計算生長速度（mm/d）[14]，記錄菌落顏色、菌落生長勢（“+++”表示濃密健壯，“++”表示較濃密，“+”表示生長“-”表示不生長）[15-16]、孢梗束形成數量（個）、下同。

（2）瓊脂濃度試驗。以PSA為基礎培養基，通過控制瓊脂濃度來控制含水量，設置0.2%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%的瓊脂濃度梯度進行試驗，每個梯度設置4個重復，在最適溫度下培養。

（3）酸堿度試驗。以最適瓊脂濃度PSA為基礎培養基，設置pH為4.00、4.50、5.00、5.20、5.40、5.60、5.80、6.00、6.20、6.40、6.60、6.80、7.00、7.50、8.00、8.50、9.00、9.50、10.00的梯度進行試驗[17]。用0.1%氫氧化鈉溶液和0.1%氯化氫溶液調節培養基的pH，每個梯度設置4個重復，在最適培養溫度下培養。

（4）氧氣試驗。以最適瓊脂濃度、酸堿度的PSA為基礎培養基，通過控制培養皿的直徑來控制含氧量。試驗中共設置培養基型號為60、70、90、100 mm的4個梯度，每個梯度設置4個重復，在最適溫度和光照下培養。

（5）光照試驗。以最適瓊脂濃度和酸堿度PSA作為基礎培養基，設置24 h光照、12 h光照、24 h黑暗的梯度進行試驗[18]，使用功率為5 w的白色燈管在37 cm×50 cm×15 cm的空間內進行照射，且照射距離為15 cm；每個梯度設置4個重復，在最適溫度下培養。

1.2.3 正交優化試驗 根據蓋囊菇菌絲的溫度、瓊脂濃度、酸堿度、氧氣、光照單因素試驗結果，設置L16(45)以菌絲體生長速度為指標的正交試驗因素與水平（表1），以孢梗束形成數量為指標的正交試驗因素與水平（表2）。

表1 正交試驗因素與水平（菌絲體）Tab. 1 Orthogonal test factor and level (mycelium)

表2 正交試驗因素與水平（孢梗束）Tab. 2 Orthogonal test factor and level (coremium)

1.3 數據處理

所有數據采用十字交叉法進行測量，所得結果均為3次重復，采用SPSS 19.0統計軟件Duncan’s法進行數據統計分析[19]。

2 結果與分析

2.1 溫度對蓋囊菇菌絲體生長與孢梗束形成的影響

2.1.1 5 ℃溫度梯度試驗 由表3可知，蓋囊菇在10~30 ℃下菌絲均能生長且顏色均為白色（圖1）。在溫度范圍10~25 ℃，其菌絲生長速度隨溫度的升高而加快，25 ℃時，蓋囊菇的菌絲生長速度最快，為(3.84±0.15)mm/d，且菌絲長勢最好，與其他溫度處理相比在0.05和0.01水平上有極顯著差異。其次是20 ℃和30 ℃溫度處理，而30 ℃時菌絲長勢比20 ℃濃密（圖1）。蓋囊菇孢梗束在15~30 ℃內均能形成，在溫度范圍15~25 ℃，其孢梗束形成數量隨溫度的升高而增多，25 ℃時，形成數量最多，為(39.50±2.38)個/皿，且與其他溫度處理相比在0.05和0.01水平上有極顯著差異。

圖1 5 ℃溫度梯度下蓋囊菇菌株在PSA平板中的培養情況Fig. 1 Cultivation of P. cystidiosus strains in PSA plate under 5 ℃ temperature gradient

表3 5 ℃溫度梯度下菌絲體生長與孢梗束形成Tab. 3 Mycelium development and coremium formation under 5 ℃ temperature gradient

2.1.2 2 ℃溫度梯度試驗 由表4可知，當溫度在25 ℃時，蓋囊菇的生長速度最快，為(3.25± 0.36)mm/d，在25 ℃和27 ℃的菌落直徑和菌絲生長速度與其他溫度處理相比在0.05和0.01水平上有極顯著差異。蓋囊菇孢梗束在27 ℃時，形成數量最多（圖2），為(11.75±2.08)個/皿，且與其他溫度處理相比在0.05水平上有顯著差異。

圖2 2 ℃溫度梯度下蓋囊菇菌株在PSA平板中的培養情況Fig. 2 Cultivation of P. cystidiosus strains in PSA plate under 2 ℃ temperature gradient

表4 2 ℃溫度梯度下菌絲體生長與孢梗束形成Tab. 4 Mycelium development and coremium formation under 2 ℃ temperature gradient

2.2 瓊脂濃度對蓋囊菇菌絲體生長與孢梗束形成的影響

由表5可知，蓋囊菇菌絲體在瓊脂濃度為0.5%~3.0%的范圍內均能生長，在該范圍內瓊脂濃度與菌絲生長速度成正比，在3.0%時菌絲生長速度最快，為(2.96±0.16)mm/d，相比于其他瓊脂濃度有極顯著的差異，且菌絲健狀濃密（圖3）；其孢梗束在0.5%~3.0%內均能形成，在2.0%時，孢梗束數量最多，為(29.75±0.96)個/皿，與其他處理相比在0.05和0.01水平上有極顯著差異。

圖3 不同瓊脂濃度下蓋囊菇菌株在PSA平板中的培養情況Fig. 3 Cultivation of P. cystidiosus strains in PSA plate under different agar concentration

表5 不同瓊脂濃度下菌絲體生長與孢梗束形成Tab. 5 Mycelium development and coremium formation under different agar concentration

2.3 酸堿度對蓋囊菇菌絲體生長與孢梗束形成的影響

由表6可知，蓋囊菇在pH為4.00~10.00下菌絲均能生長，在4.00~6.00范圍內，其菌絲生長速度隨pH的增加而增加，當pH增加到5.40時，菌絲生長速度趨于平緩，當pH大于7.00時，菌絲生長速度開始下降。在pH為5.80時菌絲生長速度最快，為(3.50±0.16)mm/d，pH為5.80在0.05和0.01水平上相較于其他pH有顯著差異；其孢梗束在pH范圍為4.00~10.00均能形成，在pH為8.0時，孢梗束數量最大（圖4），為(20.75±1.71)個/皿，與其他處理相比在0.05和0.01水平上相較于其他pH有極顯著差異。

表6 不同pH下菌絲體生長與孢梗束形成Tab. 6 Mycelium development and coremium formation under different pH

2.4 氧氣對蓋囊菇菌絲體生長與孢梗束形成的影響

由表7可知，蓋囊菇在培養皿直徑為60~100 mm內，其菌絲體均能生長且孢梗束均能形成（圖5）。當培養皿規格為100 mm時，菌絲生長速度最快，孢梗束數量最多，分別達到(3.31±0.40)mm/d、(24.50±2.08)個/皿，與其他處理相比在0.05水平上均有顯著差異，且菌絲健狀濃密。

圖5 不同含氧量下蓋囊菇菌株在PSA平板中的培養情況Fig. 5 Cultivation of P. cystidiosus strains in PSA plate under different oxygen content

表7 不同含氧量下菌絲體生長與孢梗束形成Tab. 7 Mycelium development and coremium formation under different oxygen content

2.5 光照對蓋囊菇菌絲體生長與孢梗束形成的影響

由表8可知，蓋囊菇在光照時間為0~24 h內菌絲均能生長，其菌絲生長速度隨光照時長的增加而減小，當光照時長為0 h連續黑暗時，蓋囊菇的菌絲生長速度最快，為(2.79±0.15)mm/d，與其他光照處理相比在0.05和0.01水平上有極顯著差異，且菌絲健壯濃密（圖6）；蓋囊菇孢梗束在0~24 h內均能形成，其孢梗束數量隨光照時長的增加而增加，在24 h連續光照時，形成數量最多，為(19.67±1.15)個/皿，且與其他光照處理相比在0.05和0.01水平上有極顯著差異，但菌絲較稀疏。

圖6 不同光照時間下蓋囊菇菌株在PSA平板中的培養情況Fig. 6 Cultivation of P. cystidiosus strains in PSA plate under different light duration

表8 不同光照時間下菌絲體生長與孢梗束形成Tab. 8 Mycelium development and coremium formation under different light duration

2.6 正交試驗結果

2.6.1 以菌絲體生長速度為指標的正交試驗 （1）正交組合對菌絲體生長與孢梗束形成的影響。由表9可知，蓋囊菇在所有的正交組合上菌絲均能生長，在正交組合15上，蓋囊菇的菌絲生長速度最快，為(3.56±0.62)mm/d（表10），與其他處理相比在0.05和0.01水平上有極顯著差異，且菌絲健壯濃密（圖7）。蓋囊菇孢梗束在所有的正交組合上均能形成，在正交組合5上，形成數量最多，為(21.50±2.08)個/皿（表9），與其他處理相比在0.05和0.01水平上有極顯著差異。

圖7 不同正交組合下蓋囊菇菌株在PSA平板中的菌絲體生長情況Fig. 7 Mycelium growth of P. cystidiosus strains in PSA plate under different orthogonal combinations

表9 正交組合下菌絲體生長與孢梗束形成Tab. 9 Mycelium development and coremium formation under orthogonal combinations

表10 以菌絲體生長速度為指標的極差分析Tab. 10 Range analysis table with mycelium growth rate as index

（2）極差分析與驗證試驗。由表10極差R值可知，溫度、瓊脂濃度、酸堿度、氧氣、光照5個因素對蓋囊菇菌絲生長速度的影響順序為：光照>溫度>瓊脂濃度>酸堿度>氧氣，極差分析（A4B3C2D4E1，A4B3C2D2E1）與顯著性分析（A4B3C2D4E1）最優組合結果不一致。經驗證試驗，該菌在組合A4B3C2D4E1培養基上其菌絲生長速度最大，達到(4.14±0.51)mm/d，其余參數結果均相同。因此，最優組合為A4B3C2D4E1，即瓊脂濃度為3.0%、pH為5.80、溫度為25 ℃、培養皿大小為100 mm、光照時長為0 h。

2.6.2 以孢梗束形成數量為指標的正交試驗 （1）正交組合對孢梗束形成數量的影響。由表11可知，蓋囊菇在瓊脂濃度為1.5%~3.0%、pH為7.50~9.00、溫度為25~31 ℃、培養皿大小為60~100 mm、光照時長為0~24 h時菌絲均能生長，當為3.0%、pH為8.50、24 h黑暗、培養皿大小為100 mm時，蓋囊菇的菌絲生長速度最快，為(3.65±0.52)mm/d，與其他處理相比在0.05和0.01水平上有極顯著差異，且菌絲健壯濃密（圖8）。蓋囊菇孢梗束在瓊脂濃度為1.5%~3.0%、pH為7.50~9.00、溫度為25~31 ℃、培養皿大小為60~100 mm、光照時長為0~24 h內均能形成，在瓊脂濃度為2.0%、pH為5.4、溫度為25 ℃、24 h光照、培養皿大小為90 mm時，形成數量最多，為(48.75±8.18)個/皿（表12），與其他處理相比在0.05和0.01水平上有極顯著差異。

圖8 不同正交組合下蓋囊菇菌株在PSA平板中的培養情況Fig. 8 Cultivation of P. cystidiosus strains in PSA plate under different orthogonal combinations

表11 正交組合下菌絲體生長與孢梗束形成Tab. 11 Mycelium development and coremium formation under orthogonal combinations

表12 以孢梗束形成數量為指標的極差分析Tab. 12 Range analysis table with number of coremium formation as index

（2）極差分析與驗證試驗。由表12極差分析可知，溫度、瓊脂濃度、酸堿度、氧氣、光照5個因素對蓋囊菇孢梗束形成的影響順序為：溫度>氧氣>瓊脂濃度>光照>酸堿度，極差分析（A4B2C1D4E2）與顯著性分析最優組合6（A2B2C1D4E3）不同，經進一步驗證試驗，該菌在組合A4B2C1D4E2培養基上孢梗束形成數量最大，達到(49.00±3.46)個/皿，但在組合A2B2C1D4E3上其生長速度最大[(3.26±0.45)mm/d]，其余參數結果均相同。因此，最優組合為A4B2C1D4E2，即瓊脂濃度2.0%、pH為8.00、溫度25 ℃、培養皿直徑為100 mm、光照時長為14 h。

3 討論

本試驗用平板固體培養的方式，采用單因素和正交優化試驗來探究5種可控環境因子對一株臨滄覆土栽培蓋囊菇高溫品種菌絲體生長和發育及原基分化的影響。

結果顯示，蓋囊菇菌絲體生長與孢梗束形成的溫度范圍分別為10~30 ℃、15~30 ℃，二者在所有瓊脂濃度、pH、氧氣、光照處理上也均發育，其中單因素試驗二者最適環境因子除氧氣（培養皿直徑100 mm）相同外，溫度（25、27 ℃）、瓊脂濃度（3.0%、2.0%）、pH(5.80、8.00)、光照（0、24 h）各不相同，正交優化試驗組合除溫度均為25 ℃外、其他環境因子與單因素結果完全一致。

上述蓋囊菇菌絲生長的溫度范圍與郭禧淑等[2]、嚴澤湘[20]、賀新生等[21]研究結果一致。該菇菌絲生長最適溫度與DAWIDOWICZ等[22]研究結果相同，但與HOA等[23]（28 ℃）的與李蝶等[3]（27.5 ℃）的不符。該菇菌絲生長pH的范圍與李蝶的研究結果一致，其最適pH與賀新生研究結果相同，而與DULAY等[24]（7.00）、郭禧淑等（6.00~6.50）、嚴澤湘（6.00~6.50）等研究結果不同。氧氣濃度與蓋囊菇菌絲生長速度成正比，黑暗情況下更有利于菌絲生長，該結果與賀新生的研究相同。目前，蓋囊菇孢梗束的研究極少且仍處于形態學觀察階段，其它方面未見報道，環境條件對其影響較大。

因此，本試驗結果與前人的研究存在部分差異，導致出現上述結果極有可能與菌株的遺傳多樣性有關，同一品種但不同來源其生物學特性存在一定的差異，如和耀威等[25]與陳緒濤等[26]分別對不同來源的黑木耳、皺環球蓋菇菌株均開展了溫度試驗，在不同的溫度梯度下菌株間溫度的變化趨勢與最適溫度均存在不同程度的差異。此外，培養基質種類、試驗設備型號、人員操作技術等因素均可能引起試驗結果的差異。

總之，在摸清臨滄覆土栽培蓋囊菇高溫品種可控環境條件的基礎上，一方面，繼續采用本試驗的培養方式，有必要對該菇的營養生理[27]、不同生育階段酶活[28]、液體發酵技術[29]等進行系統的研究；另一方面，采用培養料培養方式，對該菇進行不可控環境條件[30]、栽培[31]、產品加工[32]、孢梗束形成機理等方面的研究，為該菇的林下推廣與應用鑒定基礎。