基于網絡藥理學研究四物湯對阿爾茨海默病的作用機制及實驗驗證

張秀文 魏明清 倪敬年 李 婷 時 晶 田金洲

(北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院,北京,100700)

阿爾茨海默病(Alzheimer′s Disease,AD)是一種慢性進行性的神經退行性疾病,是導致癡呆的最常見的原因,占癡呆患者總數的60%～80%[1]。2019年國際阿爾茨海默病協(xié)會估計:全世界有超過5 000萬的癡呆癥患者,到2050年將增加到1.52億[2]。隨著老齡化社會的到來,預測2030年我國的患病人數將超過2 000萬[3]。這將給社會、醫(yī)療和家庭帶來沉重的負擔。同時,AD的發(fā)病機制尚未完全明確,目前已知的發(fā)病機制有β淀粉樣蛋白(Amyloid β-protein,Aβ)異常沉積、tau蛋白過度磷酸化導致的神經纖維纏結(Neurofibrillary Tangles,NFTs)、神經炎癥反應、線粒體功能障礙、氧化應激以及細胞凋亡等[4]。但不幸的是,針對單一發(fā)病機制的一系列藥物研究在臨床試驗階段都沒有獲得很好的臨床效果[5-7]。故而目前認為AD是由多因素共同作用引起的,治療也應當針對多種因素進行多靶點治療。

中醫(yī)以整體觀念和辨證論治為基本特點,是一種多靶點治療的方法,隨著近年來國外藥物研究的失敗,中醫(yī)療法受到了廣大醫(yī)務工作者的關注。阿爾茨海默病是由髓減腦消、神機失用所導致的神智異常疾病,屬于中醫(yī)學的“癡呆病”,臨床以呆傻愚笨、智力低下、善忘等為主要表現[8],病性為本虛標實,本虛在于腎精不足,標實在于痰濁、瘀血蒙蔽腦竅[9]。《阿爾茨海默病的中醫(yī)診療共識》指出AD早期以腎虛為主;中期痰、瘀、火并現;晚期為痰、瘀、火日久而化生毒濁所致,治療方面當遵循補腎原則,分期辨證治療[10]。四物湯,出自宋代的《太平惠民和劑局方》,主要記載用于婦產科疾病,主要作用為補血和活血,由熟地黃、白芍、當歸、川芎等中藥組成,逐漸被后世醫(yī)家認為“可治一切血證”“血證立法”。基于現代藥理研究和臨床應用研究,基于“虛”“瘀”的病機,四物湯被認為可用于多類病的治療[11]。

本文探析從“血”論治AD的理論依據,并利用網絡藥理學方法對“調理一切血證”的四物湯用于AD的作用機制進行全面研究[12],為后續(xù)研究的開展提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 人神經母細胞瘤細胞系(SH-SY5Y細胞株)(由北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院實驗室提供)。

1.1.2 藥品 四物顆粒(吉泰安,批號:Z20020016);鹽酸多奈哌齊片(安理申,批號:H20050978)。

1.1.3 試劑與儀器 人工合成Amyloid Peptide 25-35(Aβ25-35)(萬生昊天,型號:C-PT0104220301),高糖培養(yǎng)基(Dulbecco′s Modification of Eagle′s Medium,DMEM)(HyClone,美國,貨號:SH40007.01),澳洲胎牛血清(Gibco,美國,貨號:10099-141),青-鏈霉素溶液(Gibco,美國,貨號:15140-122),BCA試劑盒(碧云天,貨號:P0012),CCK-8檢測試劑盒(日本同仁化工,日本,貨號:CK04),聚偏二氟乙烯膜(Polyvinylidene Fluoride,PVDF)(Millipore,美國,貨號:IPFL00010),B細胞淋巴瘤-2(B-cell Lymphoma-2,Bcl-2)抗體(ABclonal,貨號:WH260030),二抗(Abcam,美國,貨號:ab6702),CO2恒濕培養(yǎng)箱(Esco,新加坡,型號:170L),離心機(Eppendorf,德國,型號:5804),倒置顯微鏡(Olympus,日本,型號:CKX41),多功能酶標儀(BioTek,美國,型號:SYNERGY H1)。

1.2 方法

1.2.1 四物湯活性成分篩選 使用中藥系統(tǒng)藥理學數據庫與分析平臺(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP)檢索四物湯中白芍、熟地黃、當歸、川芎四味中藥的所有活性成分。篩選標準為口服生物利用度(Oral Bioavailability,OB)≥30和類藥性(Drug Likeness,DL)≥0.18[13],同時查閱文獻,對四物湯的活性成分進行補充。

1.2.2 四物湯“成分-靶點”網絡構建 TCMSP數據庫獲取四物湯中各個中藥的活性成分對應的作用靶點信息。通過Pubchem數據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)得到四味中藥的有效活性成分的標準SMILE號,導入Swiss Target Prediction數據庫(http://www.swisstargetprediction.ch/index.php)進行靶點預測,選取Probability≥50%的作用靶點。整合2個數據庫所收集到的所有靶點信息并進行去重。通過Uniprot數據庫(https://www.uniprot.org/)查詢標準化靶點蛋白名稱及對應的人類基因名稱,物種選擇為“human”。將活性成分和靶點導入Cytoscape 3.7.2軟件,構建藥物-活性成分-靶點網絡。

1.2.3 疾病靶點獲取及關鍵靶點篩選 在GeneCards數據庫(https://www.genecards.org/)和Omim數據庫(https://omim.org)中以“Alzheimer′s Disease”為關鍵詞進行檢索,在GeneCards數據庫檢索結果中選擇關聯(lián)分數(Relevance Score)>20的疾病靶點,對最終獲得2個數據庫中的疾病靶點進行整合并去重。最后通過Uniprot數據庫(https://www.uniprot.org/)查詢標準化靶點蛋白名稱及對應的人類基因名稱。通過微生信(http://www.bioinformatics.com.cn/)繪制四物湯活性成分靶點和阿爾茨海默病靶點的韋恩圖。

1.2.4 蛋白質蛋白質相互作用(Protein-Protein Interaction,PPI)網絡構建 將四物湯與AD的共同靶點導入STRING數據庫(https://string-db.org/),使用“Multiple Proteins”,物種選擇“Homo Sapiens”,最低相互作用評價閾值選擇“Medium Confidence(0.400)”,并隱藏網絡中沒有鏈接的節(jié)點,獲得潛在靶點的PPI網絡。再將獲得結果導入Cytoscape 3.7.2軟件進行拓撲學分析并構建核心靶點(Degree值前20)的PPI網絡。

1.2.5 基因本體(Gene Ontology,GO)與京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析 利用David(https://david.ncifcrf.gov/)對獲得的潛在靶點進行GO富集分析和KEGG通路富集分析,進一步說明四物湯對應的潛在靶點在基因功能和通路中的作用,導出富集分析結果并繪制barplot柱狀圖和dotplot點圖。

1.2.6 分組與模型制備 20 μmol/LAβ25-35干預24 h建立細胞損傷模型,分為對照組(DMEM)、模型組(20 μmol/LAβ25-35)、四物顆粒組(20 μmol/LAβ25-35+四物顆粒1 μg/mL)和多奈哌齊組(20 μmol/LAβ25-35+多奈哌齊100 ng/mL)4組。

1.2.7 干預方法 使用DMEM培養(yǎng)基將四物顆粒與鹽酸多奈哌齊片分別稀釋為1 μg/mL和100 ng/mL,細胞貼壁后更換為含四物顆粒或鹽酸多奈哌齊+20 μmol/LAβ25-35的培養(yǎng)基,干預24 h。

1.2.8 檢測指標與方法

1.2.8.1 CCK-8活力檢測 取對數生長期的細胞按6 000/孔接種于96孔板中,過夜貼壁后進行分組干預,24 h后每孔加入10 μL的CCK-8試劑,放置于37 ℃恒溫,5%CO2恒濕的培養(yǎng)箱中避光孵育1～2 h,使用酶標儀于450 nm波長處讀取每孔的吸光度(Optical Density,OD)。

1.2.8.2 蛋白質免疫印跡法檢測 細胞中裂解得到的勻漿,置于4 ℃,18 800×g離心20 min,取上清,經BCA試劑盒定量。用12.5%的凝膠電泳(160 V,60 min)分離蛋白,200 mA,80 min轉移至PVDF膜,使用快速封閉液封閉1 h,然后在4 ℃與特異性一抗孵育過夜:B細胞淋巴瘤(B cell Lymphoma Protein-2,Bcl-2,1∶1 000。隨后使用含吐溫1%的TBST清洗3次,10 min/次,然后與二抗(1∶5 000)室溫下孵育1 h,然后免疫反應條帶可視化,使用分析軟件(Bio-Rad)進行分析。

2 結果

2.1 四物湯活性成分篩選 借助TCMSP數據庫和查閱文獻共搜集白芍化合物13個,熟地黃化合物2個,當歸化合物2個,川芎化合物7個,去重后共得19個。見表1。

表1 四物湯各藥物活性成分

2.2 藥物-活性成分-靶點網絡構建 最終獲得活性成分靶點269個、白芍138個、熟地黃37個、當歸59個、川芎35個,構建藥物-活性成分-靶點網絡,主要活性成分有植物甾醇、山柰酚和β-谷甾醇等,節(jié)點面積越大,Degree值越大。見圖1。

圖1 四物湯-活性成分-靶點網絡注:BS-白芍,CX-川芎,SD-熟地黃,DG-當歸;A1-白芍、川芎、熟地黃共有活性成分,A2-白芍、當歸共有活性成分,D1-當歸、熟地黃共有活性成分

2.3 疾病靶點獲取及與四物湯靶點交集預測 獲得四物湯靶點151個。獲得疾病靶點980個。其中,疾病靶點934個,四物湯作用靶點105個,共有靶點46個。見圖2。

圖2 四物湯靶點與疾病靶點的韋恩圖

2.4 PPI網絡構建 共有相互作用連線306條,節(jié)點46個,其中淺藍色線表示從已知數據庫得來的,紫色線代表經拓撲學分析獲得Degree值前20的核心靶點信息。見圖3。其中蛋白激酶B1(V-akt Murine Thymoma Viral Oncogene Homolog 1,AKT1)、胱天蛋白酶3(Caspase-3,CASP3)、JUN原癌基因(JUN Proto-oncogene,JUN)、腫瘤壞死因子(Tumour Necrosis Factor,TNF)、前列腺素內過氧化物合酶2(Prostaglandin-endoperoxide Synthases 2,PTGS2)為Degree值前5位。見表2、圖4。

圖3 四物湯和阿爾茨海默病潛在靶點PPI網絡

圖4 PPI網絡核心靶點(Top20)注:由上至下為Degree值由大至小

表2 Degree值前20的核心靶點

2.5 GO富集分析 經富集分析,生物過程(Biological Progress,BP)顯著富集在藥物反應、雌二醇反應、脂多糖介導的信號通路、神經元凋亡過程的正調控、一氧化氮合成過程的正調控等。見圖5。細胞組分(Cellular Component,CC)顯著富集在細胞質、小凹、線粒體、細胞膜、軸突、神經元胞體、細胞核、神經元投射等。見圖6。分子功能(Molecular Function,MF)顯著富集在酶結合、蛋白質同源二聚化活性、血紅素結合、激酶活性、藥物結合、蛋白復合物結合、蛋白結合、蛋白激酶活性、類固醇激素受體活性、半胱氨酸型內肽酶活性參與凋亡過程等。見圖7。

圖6 四物湯GO富集分析細胞組分注:顏色代表P值,紅色表示P值顯著

圖7 四物湯GO富集分析分子功能注:顏色代表P值,紅色表示P值顯著

2.6 KEGG通路富集分析 與AD密切相關的通路57個,包括TNF信號通路、多巴胺能神經突觸、促分裂原活化的蛋白激酶(Mitogen-activated Protein Kinases,MAPK)信號通路、血管內皮生長因子(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF)信號通路、T細胞受體信號通路、細胞凋亡、Toll樣受體(Toll-like Receptor,TLRs)信號通路等。見圖8。

圖8 四物湯KEGG通路富集dotplot點圖注:圓點大小代表基因數,圓點面積越大,基因越多;顏色代表P值,紅色表示P顯著

2.7 四物顆粒對Aβ25-35致SH-SY5Y細胞活力的影響 與Aβ25-3520 μmol/L組比較,其余3組的細胞活力OD值差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),四物顆粒組與多奈哌齊組與對照組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖9。

圖9 四物顆粒對Aβ誘導的SH-SY5Y細胞活力的影響(n=6)注:SWKL四物顆粒;Donepezil多奈哌齊;與對照組比較,△P<0.05;與Aβ25-3520 μmol/L比較,*P<0.05

2.8 四物顆粒對Aβ25-35致SH-SY5Y細胞Bcl-2的影響 與Aβ25-3520 μmol/L組比較,四物顆粒顯著增加Bcl-2的表達(P<0.05),與對照組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖10。

圖10 四物顆粒對對Aβ誘導的SH-SY5Y細胞Bcl-2表達的影響(n=3)注:SWKL四物顆粒;Donepezil多奈哌齊;A.Bcl-2/β-actin量化分析;B.Bcl-2和β-actin代表性蛋白免疫印跡;與對照組比較,△P<0.05;與Aβ25-3520 μmol/L比較,*P<0.05

3 討論

AD是癡呆最常見的原因之一,臨床以認知障礙為特征,記憶障礙最為突出[14]。隨著目前針對單一作用機制研發(fā)的藥物的失敗,越來越多的研究者認為AD為多因素共同作用的疾病,包括Aβ異常沉積、tau蛋白過度磷酸、神經炎癥反應、線粒體功能障礙、氧化應激以及細胞凋亡等[4]。因此,目前迫切需要尋找多靶點、多通路的治療方法。中醫(yī)的整體觀念在這一方面優(yōu)勢明顯,田金洲教授以補腎為主,分早(補腎精、益脾氣)、中(瀉火、祛瘀、化痰)、晚期(解毒通絡)辨證治療癡呆的方式取得了很好的臨床效果[15]。這顯示了中醫(yī)在防治AD領域的廣闊前景。四物湯是一切血證的立法方劑,活血而不傷血,補血而不滯血,實為AD患者見血虛血瘀證者的良方,研究顯示,鹽酸多奈哌齊聯(lián)合以四物湯為立法的養(yǎng)血清腦顆粒比單用鹽酸多奈哌齊能夠更好地改善患者的記憶力,尤其是在回憶、再認及背數方面,能更有效地提高簡易智能狀態(tài)評定表評分和神經精神癥狀問卷評分[16-17]。

本研究從TCMSP中得到的主要活性成分有芍藥苷、山柰酚、谷甾醇、β-谷甾醇、兒茶素、亞油酸乙酯、楊梅酮、川芎哚、洋川芎醌等。已有研究顯示,芍藥苷顯著抑制了Aβ25-35誘導的C6質細胞一氧化氮的產生并通過調節(jié)核因子κB通路抑制炎癥介質的產生[18],從而改善炎癥反應。山柰酚在中樞神經系統(tǒng)疾病中有抗氧化作用,并對Aβ的形成和聚集起調節(jié)作用[19];川芎哚及其類似物具有一定的降低血液黏度及改善血液流變學的作用[20]。

通過構建PPI網絡得到四物湯和AD的46個共同靶點基因,拓撲學分析Degree值前5位的有AKT1、CASP3、JUN、TNF、PTGS2。ARVANITAKIS等[21]研究顯示,腦AKT磷酸化與AD的神經病理和認知功能下降有關;CASP3已被確定為神經元細胞死亡的關鍵中介因子,并被認為是AD早期藥物治療的潛在靶點[22];TNF則是參與神經炎癥反應的主要炎癥介質;JUN蛋白連接到DNA上組成的JUNB參與細胞生長、細胞增殖、細胞調亡等多種細胞活動[23]。

GO富集分析表明藥物反應、絲氨酸肽基磷酸化、脂多糖介導的信號通路、神經元凋亡過程的正調控、一氧化氮合成過程的正調控等多個生物過程與四物湯作用于AD有關。KEGG通路富集分析發(fā)現作用靶點主要富集在TNF信號通路、多巴胺能神經突觸、MAPK信號通路、VEGF信號通路、T細胞受體信號通路、細胞凋亡、TLR信號通路等,這表明四物湯對AD的干預是多靶點、多通路的。TLRs和輔受體被激活可誘導Aβ攝取或炎癥反應,纖維性Aβ可與TLR2、TLR4和CD14直接作用,在AD開始階段可以促進對Aβ吞噬作用,但在后期增加或加速神經元凋亡[24],并有研究表明,神經干細胞移植能夠抑制APP/PS1轉基因小鼠小膠質細胞上TLR4介導的炎癥通路激活[25]。MAPK被激活后,可使核因子κB和其他蛋白激酶等多種底物磷酸化,在細胞凋亡過程中起重要作用[26]。黃德弘等[27]研究顯示,加味當歸芍藥散可抑制AD大鼠模型的炎癥介質及磷酸化MAPK信號分子的過表達,從而抑制腦內炎癥。經細胞實驗初步驗證顯示,四物顆粒能夠顯著增加Aβ25-35誘導的SH-SY5Y細胞模型的活力以及抗凋亡蛋白Bcl-2的表達。以上研究表明,四物湯可能通過多靶點介導的多個重要信號通路發(fā)揮對AD的治療作用。

本研究探討中醫(yī)“血證”理論防治阿爾茨海默病的理論基礎和現代理論依據,發(fā)現呆病本質仍是“虛”,瘀血是其不可忽視的主要病理因素之一,所以,虛瘀合證者,補血活血的四物湯是防治呆病的良方。此外,本研究通過網絡藥理學探索四物湯多成分、多靶點、多通路防治AD的作用機制,發(fā)現四物湯的活性成分可能通過抗氧化、抗細胞凋亡、減少炎癥反應和保護神經元細胞等機制發(fā)揮治療AD的作用。因此,對四物湯防治AD的深入研究是具有臨床意義的,后續(xù)需要進一步進行實驗驗證,為阿爾茨海默病的防治提供新的方法。

利益沖突聲明:無。