中藥結腸透析治療慢性腎臟病3～4期濕濁證患者的臨床效果及作用機制研究

鄭 鑫 鄧躍毅 嚴夢婷 歸楚瀅 林 釤

(1 上海市中西醫結合醫院,上海,200082; 2 上海中醫藥大學,上海,200032)

NICHOLSON等[1]最早于1999年首次提出了代謝組學概念。代謝組學技術主要是通過利用生物組織和體液的磁共振成像波譜提供生物體內全部小分子代謝物信息,而后對生物組織和體液進行系統分析及檢測,將代謝信息與生理病理過程中的某些生物學事件相互聯系,以確定發生變化的靶器官及作用位點,最后確定具有特異型的生物標志物。代謝組學近年來在國內外受到廣泛而密切的關注,并已成為疾病研究的熱點,對于疾病的生理病理變化、診斷的精確度、疾病療效的判定、藥理作用機制及中醫中藥研究等多領域的探索具有重要的意義[2]。目前有關中醫藥干預慢性腎臟病的代謝組學研究已經進展了一部分,本研究運用氣相色譜-飛行時間質譜聯用(Gas Chromatography-time-of-flight/Mass Spectrometry,GC-TOF/MS)技術分析中藥結腸透析治療前后的慢性腎臟病3～4期濕濁證患者血清樣本代謝物的變化,通過對代謝組的定性定量結果進行單變量統計分析和多元變量統計分析,篩選出顯著差異的代謝物;在基礎數據分析的基礎上,對顯著差異的代謝物進行一系列生物信息學的分析。評估中藥結腸透析對體內代謝異常調節作用,更好地為臨床療效機制判定提供依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年8月1日至2021年1月31日上海中醫藥大學附屬龍華醫院腎病科門診或住院就診的慢性腎臟病(Chronic Kidney Disease,CKD)3～4期濕濁證患者60例;健康組10例來源于本院健康體檢者。本研究獲得上海中醫藥大學附屬龍華醫院醫學倫理委員會批準實施(倫理審批號:2018LCSY026)。采用Excel軟件生成隨機數字表,由隨機數字表按時間順序給入組病患編號,0號患者編入對照組,奇數號患者編入觀察組。對照組30例,觀察組30例。另外,收集10例健康空白組體檢人員進行血清代謝組學分析。2組一般資料比較,差異無統計學意義(P>0.05),具有可比性。見表1。

表1 60例CKD3～4期濕濁證患者一般資料

1.2 診斷標準

1.2.1 西醫診斷標準 CKD診斷標準參照K/DIGO(Kidney Disease:Improving Global Outcomes)指南[3]。指任何原因所致的腎臟病理學異常或血、尿、影像學檢查異?；蚰I小球濾過率[流行病學協作(Epidemiology Collaboration,EPI)公式]:估算腎小球濾過率(Estimated Glomerular Filtration Rate,eGFR)<60 mL/(min·1.73 m2),并持續3個月,包括各類腎小球、腎小管間質或腎血管疾病。

分期標準:CKD1期:eGFR≥90 mL/(min·1.73 m2);CKD2期:eGFR 60～89 mL/(min·1.73 m2);CKD3期:eGFR 30～59 mL/(min·1.73 m2);CKD4期:eGFR 15～29 mL/(min·1.73 m2);CKD5期:eGFR<15 mL/(min·1.73 m2)或透析。

1.2.2 中醫辨證標準 參照《中藥新藥臨床研究指導原則》中慢性腎衰的診斷標準[4]。濕濁證:主癥為惡心嘔吐,肢體困重,食少納呆;次癥為脘腹脹滿,口中黏膩,舌苔厚膩。

1.3 納入標準 1)符合CKD的診斷標準者;2)年齡18～65歲者;3)CKD3～4期,eGFR 15～59 mL/(min·1.73 m2);4)符合中醫辨證,屬慢性腎衰濕濁證者;5)患者對該研究知情,簽署知情同意書者。健康空白組納入標準:1)年齡18～60歲,無心、腦、肝和造血系統等嚴重原發性疾病者;2)無乙肝、結核等傳染病史,無高血壓、糖尿病、冠心病、慢性支氣管炎等慢性疾病史者;3)無輸血史者。

1.4 排除標準 1)慢性腎臟病已經開始腎臟替代治療者;2)診斷為急性腎損傷者;3)合并心、腦、肝和造血系統等嚴重原發性疾病者;4)腸道內及肛區腫瘤、炎癥、出血、腹瀉或肛裂者;5)有嚴重的心力衰竭及合并感染者;6)無法合作,依從性差者,如精神病者;7)妊娠或哺乳期婦女。

1.5 脫落與剔除標準 1)病例不符合納入標準。2)未曾進行試驗干預。3)在入組后無任何試驗數據。數據統計分析前,由課題負責人及主要研究者判定病例是否予以剔除。

1.6 治療方法

1.6.1 對照組 1)基礎治療。飲食與營養:參照中國《慢性腎臟病蛋白質營養療法專家共識》,蛋白質攝入量為0.6～0.8 g/(kg·d),其中高生物價蛋白質>50%。使用低蛋白飲食時,熱量攝入應保持在30～35 kcal/(kg·d)?？刂蒲獕?對血壓增高者,參照JNCⅤⅡ和腎臟疾病質量倡議(Kidney Disease Outcomes Quality Initiative,KDOQI)K/DOQI推薦標準,根據尿蛋白情況,盡量將血壓降至130/80 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)或125/75 mm Hg以下。降壓藥物首先應用血管緊張素轉化酶抑制劑(Angiotensin Converting Enzyme Inhibitor,ACEI)或血管緊張素受體拮抗劑(Angiotensin Receptor Blocker,ARB)類,在應用該類藥物仍不能將血壓控制到靶目標者,則加用鈣離子拮抗劑類或其他降壓藥物。另外:若初診時血肌酐高于250 μmol/L時,腎臟灌注不足者,慎用ACEI或ARB類降壓藥物,謹防高血鉀癥及急性腎損傷的發生,密切關注患者容量及肌酐升高幅度;控制血脂:對血脂增高者,參照1997年我國血脂防治建議和美國2001年5月公布的美國膽固醇教育計劃成人觀察組第三次報告(National Cholesterol Education Program Third Report of the Adult Treatment Group,NCEP ATPⅢ)標準,使總膽固醇(Total Cholesterol,TC)<5.72 mmol/L,低密度脂蛋白(Low Density Lipoprotein,LDL)<3.64 mmol/L,三酰甘油<2.26 mmol/L。調脂藥物首選他汀類降脂藥。控制血糖:對糖尿病的患者,參照2013年中國2型糖尿病防治指南的標準,空腹血糖(Fasting Plasma Glucose,FPG)控制在7.0 mmol/L以下,隨機血糖控制在10.0 mmol/L以下,糖化血紅蛋白(Glycosylated Hemoglobin,HbA1c)控制在7.0%以下。老年患者可適當放寬控制標準,謹防出現低血糖所導致的腎功能急劇惡化。

2)中醫辨證論治療:根據本虛證采用中醫辨證治療,口服中藥辨證湯劑,每日1劑,分早晚2次服。脾腎氣虛證:上海中醫藥大學附屬龍華醫院腎內科協定方尿C方(黃芪、黃精、杜仲、寄生、葛根)等。有陽虛癥狀加附子、桂枝等;有陰虛癥狀加熟地黃、生地黃、山茱萸等;有氣虛癥狀加黨參、白術、茯苓、山藥等。有濕熱癥狀加黃芩、黃連等。有瘀血癥狀加當歸、川芎、紅花等。

1.6.2 觀察組 在對照組慢腎衰一體化基礎治療上加用中藥結腸透析治療。慢腎衰灌腸方:上海中醫藥大學附屬龍華醫院腎病科經驗方,由生大黃30 g、生龍骨30 g、生牡蠣30 g、蒲公英30 g、六月雪30 g、當歸15 g組成,煎成200 mL的灌腸液進行中藥常規保留灌腸。

具體操作步驟:采用結腸透析機進行序貫式高位結腸透析,分為3個步驟:腸道清洗-結腸透析-中藥高位保留灌腸。首先使用干凈的溫水重復整個腸道的灌洗,直到洗脫液澄清且沒有糞便,然后將結腸透析液添加到結腸中透析,充分透析后停止,約1 h后拔管。指導患者排便,排盡腸中剩余水分,然后將制備好的中藥湯劑通過結腸透析治療機注入高位結腸,然后拔出肛管。指導患者盡可能長時間腸內保留慢腎衰灌腸方中藥湯劑。觀察組患者進行中藥結腸透析頻率:隔日1次,共25次,治療8周。女性月經期暫停中藥結腸透析。

1.7 觀察指標 1)生物學指標、診斷性指標于治療前后檢測觀察并記錄。2)主要療效指標及中醫證候積分共檢查3次。采集時間點:治療前,36 d,60 d。次要療效指標(代謝組學)于治療前后各檢查1次,采集時間點:治療前,60 d。3)安全性指標:糞隱血于每次訪視時間點均檢查1次,采集時間點:治療前,36 d,60 d。4)終點事件:進入腎臟替代治療,具體包括血液透析、腹膜透析、腎移植。

1.8 血清代謝組學研究方案

1.8.1 取材 空白健康組于2020年12月30日清晨,空腹采集全血樣品。收集的血樣品于室溫,3 000 r/min,離心15 min,離心半徑15 cm,離心后提取3 mL血清,分別裝于1.5 mL Ep管中于-80 ℃冰箱中儲存。檢測前,樣品于冰水中解凍,在室溫下3 000 r/min,離心15 min,離心半徑15 cm,取上層血清供檢測。

1.8.2 試劑與儀器 樣本檢測于上海百趣生物醫學科技有限公司,氣相色譜儀器(Agilent公司,美國,型號:7890A),質譜儀(LECO公司,美國,型號:PEGASUS HT),色譜柱[Agilent公司,美國,型號:DB-5MS(30 m×250 μm×0.25 μm)],離心機(Thermo Fisher Scientific公司,德國,型號:Heraeus Fresco17),超低溫冰箱(Thermo Fisher Scientific公司,德國,型號:Forma 900 series),烘箱(上海一恒科學儀器有限公司,型號:DHG-9023A),干燥儀(太倉市華美生化儀器廠,型號:LNG-T98)。本實驗中所用試劑:甲氧銨鹽(Adamas公司,貨號:M0343),核糖醇(Adamas公司,貨號:C10046500),吡啶(Adamas公司,貨號:P111511),甲醇(Adamas公司,貨號:4.000306.4000),氯仿(Adamas公司,貨號:10071631)。實驗由上海百趣生物醫學科技有限公司完成。

1.8.3 代謝物提取 取樣本50 μL于1.5 mL EP管中,后加入200 μL預冷甲醇及5 μL核糖醇,離心30 s(血清),有效離心半徑16 cm;超聲10 min;再將樣本4 ℃,12 000 r/min,離心15 min,離心半徑15 cm;移取180 μL上清液于1.5 mL EP管中,每個樣本各取50 μL混合成質控樣本;后干燥提取物;再向代謝物中加入50 μL甲氧胺鹽試劑,混勻后,80 ℃孵育30 min;將每個樣品中加入70 μL BSTFA,將混合物70 ℃孵育1.5 h;冷卻至室溫后,向混合的樣本中添加5 μL FAMEs;最后進行上機檢測。

1.8.4 上機檢測 檢測條件:進流量1 μL,Splitless Mode分流,3 mL/min隔墊吹掃流速。色譜柱:DB-5MS(30 m×250 μm×0.25 μm),1 mL/min柱流速,柱箱升溫50 ℃ 1 min,升至310 ℃(升高10 ℃/min)保持8 min,前進樣口溫度、傳輸線溫度均為280 ℃,電壓-70 eV,掃描速率:12.5 spectra/s。溶劑延遲：4.8 min(血清)。離子源溫度：250 ℃。質量范圍：m/z：50～500。為確保本次實驗研究的精確性，此次研究進行全程數據質控、過程質控、系統質控，從3個方面對檢測方法進行驗證。結果顯示，系統穩定性：良好。實驗方法：良好。樣本質量：良好。

1.9 統計學方法 基于氣相色譜-飛行時間質譜(Gas Chromatography-time-of-flight Mass Spectrometry,GC-TOFMS)的代謝組學項目數據分析部分進行基礎數據分析,是對代謝組的定性定量結果進行單變量統計分析和多元變量統計分析,數據分析內容主要包括:單變量統計分析:t檢驗。多元變量統計分析:主成分分析(Principal Component Analysis,PCA)、正交偏最小二乘法-判別分析(Orthogonal Partial Least Squares Discriminant Analysis,OPLS-DA)、差異代謝物篩選和鑒定、差異代謝物的層次聚類分析、差異代謝物的代謝通路分析。

2 結果

2.1 2組患者治療前后中醫證候積分比較 2組患者治療后改善中醫證候均優于治療前,差異均有統計學意義(均P<0.05);2組患者治療后組間中醫證候積分,差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 2組患者CKD3～4期濕濁證患者治療前后中醫證候積分比較分)

2.2 2組患者臨床療效比較 治療后,2組患者總有效率比較,差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 2組患者CKD3～4期濕濁證患者治療前后有效率比較

2.3 2組患者治療前后血肌酐、尿素氮、尿酸比較 觀察組治療后血清肌酐及尿素氮均較治療前降低,eGFR較治療前升高,差異有統計學意義(P<0.05)。2組患者治療后肌酐、尿素氮、eGRF比較,差異均有統計學意義(均P<0.05)。見表4。

表4 2組患者CKD3～4期濕濁證患者治療前后腎功能比較

2.4 2組患者治療后糞隱血比較 2組患者治療后糞隱血比較,差異無統計學意義(P>0.05)。見表5。

表5 2組患者CKD3～4期濕濁證患者治療后糞隱血比較

2.5 代謝組學結果

2.5.1 樣本信息 人血清樣本共5組,分別為空白組,觀察組治療前組,觀察組治療后組,對照組治療前組和對照組治療后組,各組對應的生物學重復分別為10例、30例、30例、30例和30例,進行基于GC-TOFMS的代謝組學分析,共計130例樣本。

2.5.2 數據分析信息

2.5.2.1 統計分析的對比信息 共進行6組對比,分別為觀察組治療前組對觀察組治療后組,對照組治療前組對對照組治療后組,觀察組治療前組對對照組治療前組,觀察組治療后組對對照組治療后組,觀察組治療前組對空白組和對照組治療前組對空白組。

2.5.2.2 PCA 全部樣本均分布于95%置信區間內。見圖1～2。

圖1 全部樣本(包括QC樣本)的PCA得分散點圖注:k為空白組;jbb為觀察組治療前;jba為觀察組治療后;dbb為對照組治療前;dba為對照組治療后;QC為全部樣本組

圖2 空白組、觀察組治療前、觀察組治療后的PCA得分散點圖注:k為空白組;jbb為觀察組治療前,jba為觀察組治療后

2.5.2.3 OPLS-DA得分散點圖 空白組、觀察組治療前后組的OPLS-DA模型得分散點圖。從OPLS-DA得分圖的結果可以看出,3組樣本區分非常顯著,樣本處于95%置信區間內。見圖3。

圖3 觀察組治療前后、空白組的OPLS-DA模型得分散點圖注:k為空白組;jbb為觀察組治療前;jba為觀察組治療后

2.5.2.4 差異代謝物的篩選 試驗中對差異性代謝物的篩選標準:PCA中的P值小于0.05,同時滿足OPLS-DA中VIP值大于1。CKD3～4期濕濁證差異性代謝物為:丙酮酸、琥珀酸半醛、富馬酸、檸檬酸、蘋果酸及α-酮戊二酸。見表6。

表6 差異性代謝物的篩選

2.5.2.5 差異代謝物層次聚類分析 上述得到的差異性代謝物,在經過中藥結腸透析后在生物學上存在組間的變化差異。此處以觀察組治療前后對比健康空白組,共70例樣本進行分析。結果提示:琥珀酸半醛、蘋果酸、富馬酸、檸檬酸、α-酮戊二酸及丙酮酸相對表達量均較治療前下降。見圖4。

圖4 觀察組治療前后差異性代謝物與空白組層次聚類分析注:jba為觀察組治療后;jbb為觀察組治療前;k空白組;橫坐標代表試驗分組,縱坐標代差異性代謝物,不同位置的色塊顏色代表對應代謝物在本組樣本中的相對表達量

2.5.2.6 差異代謝物的代謝通路分析 差異性代謝物具體參與的代謝通路主要包括:三羧酸循環及丙氨酸,天冬氨酸和谷氨酸代謝。見圖5。代謝通路見圖6～7。

圖5 觀察組治療前組對觀察組治療后組的通路分析注:氣泡圖可以說明通過此次中藥結腸透析后,代謝物主要參與的代謝通路分析,圖中橫坐標表明代謝通路的拓撲分析,距離原點距離越遠,影響因子越大;縱坐標表明富集分析的P值,氣泡離坐標原點的距離越遠,表明差異性代謝物通路在中藥結腸透析中越關鍵

圖6 三羧酸循環代謝注:圖中亮藍色表示下調

圖7 丙氨酸,天冬氨酸和谷氨酸代謝注:圖中亮藍色表示下調

3 討論

3.1 CKD與腸道微生態的關系 近些年來,隨著對腸道微生態的深入研究,許多專家意識到腸道微生態與慢性腎臟病之間存在一定的相關性[5]。數以百萬億計的腸道微生物成了影響慢性腎臟病發生、發展、預后及轉歸的重要原因。CKD患者大多存在腸道內環境及上皮屏障的變化,最終導致腸道菌群明顯異于常人[6]。而腸道菌群失調及其所導致的腸源性尿毒癥毒素的積蓄,又進一步加快了CKD的疾病進展,由此調節腸道微生態環境平衡用于CKD的治療,成為控制疾病進展的新方法[7]。

3.2 中藥保留灌腸的組方和藥理分析 此次中藥保留灌腸的方藥由生大黃、生龍骨、生牡蠣、蒲公英、六月雪、當歸組成,本方具有通腹泄濁,解毒化瘀的功效。生大黃的主要功效包括:瀉下攻積,清熱瀉火,解毒,活血祛瘀等。動物試驗證實:從大黃中提取物半乳糖原花青素可以降低膽固醇在體內的合成[8]。大黃的衍生物可以抑制腎小球系膜細胞的增殖,預防健全的腎小球硬化[9]。試驗證實,大黃可以增加腸道毒素的排泄(包括血肌酐、尿素氮等)[10]。生龍骨、生牡蠣的主要功效包括:軟堅散結,平肝潛陽,收斂固澀等?，F代藥理發現,生牡蠣與生大黃聯合使用可以有效降低生大黃由于過度泄下而導致體內腎臟灌注不足的不良反應[11]。生龍骨、生牡蠣聯合使用還具有類似碳酸鈣、磷酸鈣及硫酸鈣的作用[12],可以增加灌腸液的滲透壓,進而增加宿主中的毒素向腸道的分泌,從而有利于宿主中毒素的排泄[13]。蒲公英的主要功效包括:清熱解毒,利濕通淋,涼血消腫。早在元代就有醫家提出蒲公英可化熱毒、散滯氣、解食毒。研究證實,蒲公英具有抑菌扶正,提高人體免疫力等作用[14],并且可以抗感染、抗氧化[15]。六月雪具有清熱利濕,疏風解表,活血通絡等功效。在臨床對于降低血肌酐、尿素氮等指標上有很好的效果[16]?，F代藥理研究證實,六月雪中含有鞣質、苷類、生物堿、植物甾醇、糖肪酸等有效成分[17],可以增加體液免疫及細胞免疫功能[18]。朱秋萍等[19]研究證實,六月雪提取物可以明顯增加小鼠食欲,促進小鼠生長發育,提升胸腺重量及體質量。此外,六月雪還可以提升腎血流量,促進纖維物質的吸收,使荒廢的腎小球得以修復,進而達到降低尿蛋白的作用。當歸具有補血活血,潤腸通便,調經止痛等功效。研究證實:腎小球硬化及間質纖維化是CKD共同的特征[20]。隨著健全腎小球數目的減少及腎臟纖維化的增加,加劇了腎功能的降低。其機制為早期腎小球“三高”狀態的出現,血流動力學發生變化,脂代謝失衡,細胞外基質過度的沉積,從而在腎臟形成“癥瘕”[21]。動物試驗證實,當歸可以減輕腎小管上皮細胞凋亡,降低腎臟缺血再灌注,延緩腎間質纖維化的過程[22]。研究證實,當歸還可以改善血流變學的指標,進一步改善血液微循環,提升腎小球濾過率,進而保護腎功能,延緩疾病進展[23]。

綜上所述,中藥保留灌腸是為了加強毒素從腸道的排泄,清除體內毒素的積蓄,為排泄人體內所殘留的毒素尋找他路。

3.3 結腸透析在慢性腎臟病CKD3～4期中應用的機制 結腸具有分泌與吸收功能,尤其在后半結腸,對部分無機鹽、水分以及各種維生素都具有非常強大的吸收功能,這與結腸的解剖結構及生理特性是有關的[24]。從解剖結構上說,結腸屬于大腸的一部分,由升結腸、橫結腸、降結腸及乙狀結腸4部分組成,全長大約125 cm[25]。從結腸的生理結構來說,結腸壁上有很多囊狀突起,構成了結腸所獨特擁有結構——“結腸袋”,一定程度上增大了腸黏膜的接觸面積。從結腸的運動形式上說,結腸袋在大腸蠕動中有著至關重要的作用,通過袋狀往返運動及分節推進這2種特殊的運動方式,使腸內容物在腸道內停留,并得到充分結合,增加了結腸的吸收作用[26]。從血管分布來說,腸黏膜的下層內含有非常豐富的淋巴管網及毛細血管網,直腸周圍分布著極為豐富的靜脈血管叢直接匯入直腸靜脈叢,最后注入髂內靜脈及腸系膜下靜脈,然后繞過了肝臟,最終進入人體血液循環系統[27]。

綜上所述,結腸豐富的血管條件、廣泛的腸黏膜接觸面積、特殊的運動形式及結構特點,為無機鹽、水分及各類維生素的吸收創造了優越的條件。

結腸透析法通過模仿腹膜透析原理,采用滲透、彌散及吸收等跨膜轉運的機制。其本質上就是利用細胞內外不同濃度差進行跨膜物質轉運[28]。結腸透析液與人體血液均包含某些相同物質的小分子,但二者由于濃度不同,因此結腸內外形成不同的濃度差[29],進而促使透析液中某些有用的離子及必要的小分子進入血液循環中,同時血液中的毒素通過腸壁的滲透壓進入腸腔,最終由透析液排出體外。另外,結腸上分布的結腸袋增加了腸黏膜的接觸面積,更利于透析液的貯存及與黏膜充分的接觸,延長有效的吸收時間,從而提高體內毒素的排泄。從中藥湯劑的吸收角度上看,其與靜脈給藥類似,湯劑以腸黏膜為屏障,大約3/4以上的部分經肛管靜脈及直腸內膜下靜脈直接進入人體血液循環,繞過肝臟,更好地避免了首過效應,提高了藥物在體內的吸收濃度[30]。

3.4 中藥結腸透析治療CKD3～4期濕濁證患者潛在生物標志物及其代謝途徑

本研究提示,中藥結腸透析治療CKD3～4期濕濁證患者的代謝途徑主要包括:三羧酸循環及丙氨酸,天冬氨酸和谷氨酸代謝。潛在生物標志物代謝途徑分析如下。

3.4.1 三羧酸循環代謝 三羧酸循環是能量代謝的中心環節,同時也是脂類、糖類、氨基酸的最終代謝通路,又是3類物質代謝聯系的樞紐[31]。各種物質代謝異常最終都會影響能量代謝[32]。因此,患者血液中的三羧酸循環中代謝物水平發生改變,在慢性腎臟病中這種表現尤為突出。

本研究在三羧酸循環代謝途徑中檢測出包括蘋果酸、富馬酸、檸檬酸、丙酮酸及α-酮戊二酸5種物質的變化較治療前降低,差異有統計學意義。

蘋果酸是三羧酸循環的中間體,對血管內皮細胞的損傷起到抵抗作用,同時蘋果酸還可以為機體提供能量,消除人體疲勞感,提高患者免疫力,由于慢性腎臟病患者后期同時伴隨免疫功能的低下,感染風險提升,感染又同時會加速疾病的進展,由此惡性循環,故蘋果酸鹽在維持患者免疫功能中起到重要的作用[33-36]。

通過對CKD合并糖尿病患者與健康對照者的血液行靶向GC-MS分析,結果顯示CKD合并糖尿病患者中與線粒體代謝相關的代謝物明顯增加,提示該類患者存在線粒體功能的破壞,這些血液代謝物可作為評價腎功能的新型生物標志物[37]。此外,利用代謝組學技術對動物模型進行研究證實[38],CKD引起血液中三羧酸循環代謝物濃度升高,其中包括:檸檬酸鹽、富馬酸、琥珀酸、蘋果酸鹽。以上研究結果提示,三羧酸循環可能與CKD的發病關系密切,其代謝產物可作為CKD診斷的早期生物標志物。繼而對富馬酸作用機制的進一步分析結果提示,還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4通過特異性下調腎皮質中富馬酸酶的表達,進而導致體內富馬酸水平升高。富馬酸通過競爭性抑制缺氧誘導因子-1α脯氨酸羥基化,從而抑制缺氧誘導因子-1蛋白的降解;同時富馬酸還可以共價修飾半胱氨酸的殘基,形成富馬酸-谷胱甘肽加合物,從而影響細胞抗氧化反應。研究證實,富馬酸鹽在體內的積蓄是導致機體氧化應激反應的原因之一[39]。

檸檬酸是在三羧酸循環中由草酰乙酸羧和乙酰輔酶A合成,參與機體蛋白質代謝、糖代謝和脂肪代謝[40]。檸檬酸進入細胞壁,使細菌內部及外部出現pH梯度差,抑制細菌繁殖[41]。檸檬酸使胃腸道內pH下降,腸道內的益生菌得到良好的生長環境,從而維持機體腸道菌群的平衡[42]。此外,檸檬酸同樣可以提升免疫機制,使機體處于相對良好的免疫狀態,預防感染風險;將檸檬酸鹽與抗氧化劑同時配合使用,可提高機體抗氧化效果,阻止CKD后期氧化應激反應[43]。

丙酮酸是非常重要的A-氧代羧酸之一,其不僅在機體能量代謝中起到至關重要的作用,而且還是許多營養物質的前體,丙酮酸在醫藥領域中具有廣泛的用途[44]。丙酮酸是對機體能量代謝具有很大影響的物質,是糖酵解的終產物,也是檸檬酸循環的起始物質,通過檸檬酸循環氧化,同時伴隨著異化和同化作用,是物質代謝中關鍵的支點[45]。通過切斷或減弱丙酮酸進一步代謝的支路,可以增加其在體內的大量積蓄,加速丙酮酸的合成,去除代謝產物的反饋抑制及反饋阻遏。研究證實,飲食中適當添加含有丙酮酸鹽的氧化劑,可以加快脂肪代謝速度,還可以降低因低脂飲食造成的蛋白質的無故流失[46],此外,丙酮酸對于人體的不良反應很少,許多發達國家利用丙酮酸的這一特性,研制出新型的丙酮酸鈣鹽,作為降脂和補鈣的醫療藥品[47]。研究證實,丙酮酸鈣鹽具有降低膽固醇及血脂的作用[48]。STANKO等[49]通過在高脂血癥患者的飲食中添加適當丙酮酸鈣鹽,服用后發現:LDL下降5%,TC下降4%。丙酮酸鈣同樣是非常好的鈣劑,補充體內所需鈣的同時,不會加重肝臟、腎臟的壓力,且無不良反應[50]。此外,丙酮酸作為一種抗氧化劑,可以有效預防缺血再灌注,刺激黏膜組織的修復,并且促進自由基清除[51]。

α-酮戊二酸:α-酮戊二酸是戊二酸的2種帶酮基的衍生物中的其中一種,其可參與人體內三羧酸循環,并生成人體必需氨基酸,故可作為膳食補充品[52-53]。研究證實,α-酮戊二酸可以結合體內多余的氨,從而減少血液透析患者氨中毒的風險[54]。研究證實,α-酮戊二酸含機體所需的必要氨基酸和酮基類似物,可以及時補充患者體內缺乏的氨基酸,改善患者由于疾病控制飲食后的蛋白質代謝紊亂[55]。此外,α-酮戊二酸還可以提高酯酶活性,降低胰島素抵抗,進而改善患者糖脂代謝紊亂[56-57]。既往研究證實:α-酮戊二酸是腎小管損傷的重要標志物,腎功能不全患者后期腎小管萎縮,間質纖維化,腎小管重吸收能力下降,導致電解質紊亂及代謝性酸中毒不可避免[58-59]。所以,及時補充體內α-酮戊二酸可以緩解由于腎小管損傷所導致的一系列臨床癥狀。

3.4.2 丙氨酸、天冬氨酸,谷氨酸代謝 丙氨酸、谷氨酸與天冬氨酸從氨基酸合成關系分析:由于這3種氨基酸相比其他氨基酸更早地合成,因此,這3種酮酸在糖類、脂類、能量物質代謝等過程中具有重要的地位。

氨基酸代謝是人體重要的代謝途徑。通過蛋白質水解生成的氨基酸在機體內部代謝途徑包括:一是合成人體本身所特有的多肽、蛋白質及其他含氮物質;二是可以通過脫氨與轉氨作用,聯合脫羧或脫氨作用,分解為胺類、α-酮酸及CO2。氨基酸分解生成α-酮酸可以轉變為脂類、糖或其他人體內非必需氨基酸,也可以通過三羧酸循環生成水和CO2,并釋放能量[60]。既往研究證實:CKD由于腎功能下降,營養攝入不足,飲食控制,尿毒癥毒素在體內積蓄,機體代謝酶的數量及活力的下降,內分泌功能失調,腸道菌群紊亂等因素引起患者氨基酸代謝的紊亂[61]。此外,氨基酸代謝也會影響T細胞的活化、增殖和存活。氨基酸代謝對免疫細胞的分化與成熟也具有重要的作用。大多數氨基酸可以通過三羧酸循環代謝,而通過利用氨基酸或脂肪酸,幼稚的B細胞可以產生ATP,通過糖酵解而產生IgA的漿細胞可以進行三羧酸循環[62]。氨基酸還對巨噬細胞產生一氧化氮和細胞因子尤為重要;氨基酸的分解代謝還可以抑制病原體和T細胞的增殖。進而起到保護機體及提高免疫力的功效[63]。

本研究結果提示,通過中藥結腸透析治療后,患者血清中琥珀酸半醛、富馬酸、α-酮戊二酸、檸檬酸及丙酮酸水平較治療前降低,差異有統計學意義。

之前在三羧酸循環中,已詳細闡述了丙酮酸,富馬酸、檸檬酸及α-酮戊二酸在治療CKD3～4期濕濁證的作用。而丙氨酸、天冬氨酸,谷氨酸代謝中除了檢測出上述的4類代謝物較治療前后的變化具有統計學意義之外,還發現治療后在患者體內琥珀酸半醛的水平也較治療前下降,差異有統計學意義。

琥珀酸半醛的增多會導致4-羥基丁酸升高,從而影響多巴胺、γ-氨基丁酸、血清素、乙酰膽堿等多個神經遞質系統的破壞[64]。琥珀酸半醛是由α-酮戊二酸脫羧酶催化α-酮戊二酸所生成的,然后經過琥珀酸半醛脫氫酶催化使琥珀酸半醛轉化為琥珀酸,完成三羧酸循環[65]。本研究發現:通過降低琥珀酸半醛在體內的積蓄,進一步優化了三羧酸循環的平衡,使患者的能量代謝紊亂得到改善。

綜上所述,中藥結腸透析可以提升CKD3～4期濕濁證患者的腎小球濾過率,延緩疾病進展,改善臨床癥狀;其作用機制主要表現為:緩解機體氧化應激,增加能量代謝,平衡丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸代謝紊亂,提高機體免疫功能及維護腸道菌群平衡等。

利益沖突聲明:無。