基于單細胞測序數據的骨肉瘤預后相關細胞亞群特征分析

王勝濤 朱浩然 徐淑娟 貴鵬 陳明洲 李朝旭

基金項目：廣西醫療衛生重點培育學科建設項目（桂衛教科發〔2022〕4號）

摘要：目的? 通過分析不同骨肉瘤患者腫瘤組織的細胞組成，探究與骨肉瘤預后相關的細胞亞群及特征。方法? 下載不同患者骨肉瘤單細胞測序數據及bulk測序數據，提取細胞樣本信息進行降維、注釋、細胞功能分析，明確與骨肉瘤預后相關的細胞種類，鑒定骨肉瘤預后相關細胞特征。分析具有預后意義的巨噬細胞發育軌跡，根據分化空間差異基因構建骨肉瘤預后模型。結果? 不同骨肉瘤患者的細胞組成存在異質性。骨肉瘤中浸潤的單核巨噬細胞具有顯著預后意義（P=0.003）。4類巨噬細胞組成關鍵預后單核巨噬細胞亞群，其特征性轉錄調控因子包括RUNX3（+）、ETS1（+）、HOXD11（+）、ZNF281（+）、PRRX1（+）。巨噬細胞亞群的預后能力隨骨肉瘤的惡性進展而增強，其中Prog_Macro2及Prog_Macro4亞群巨噬細胞位于發育軌跡終端。基于巨噬細胞分化差異基因的預后模型能夠有效區分不同風險骨肉瘤患者的生存率（P<0.001）。結論? 巨噬細胞亞群與骨肉瘤預后密切相關，可作為骨肉瘤免疫治療的關鍵靶細胞。

關鍵詞：骨肉瘤；單細胞測序；單核巨噬細胞系統；巨噬細胞；預后

中圖分類號： R738.1? 文獻標志碼： A? 文章編號：1000-503X（2023）05-0773-10

DOI：10.3881/j.issn.1000-503X.15573

Characterization of Cell Subsets Associated With Prognosis of Osteosarcoma Based on Single-Cell Sequencing Data

WANG Shengtao1，ZHU Haoran2，XU Shujuan3，GUI Peng4，CHEN Mingzhou1，LI Zhaoxu1

1Department of Joint Surgery and Sports Medicine，Nanxishan Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region，Guilin，Guangxi 541002，China

2Zonglian College，Xian Jiaotong University，Xian 710061，China

3Department of Hematology，Affiliated Hospital of Guilin Medical University，Guilin，Guangxi 541001，China

4Department of Trauma and Hand Surgery，Nanxishan Hospital of Guangxi Zhuang Autonomous Region，Guilin，Guangxi 541002，China[JZ）]

Corresponding author：LI Zhaoxu? Tel：0773-3830680，E-mail：lzxpds@126.com

ABSTRACT：Objective? To explore the cell subsets and characteristics related to the prognosis of osteosarcoma by analyzing the cellular composition of tumor tissue samples from different osteosarcoma patients.Methods? The single-cell sequencing data and bulk sequencing data of different osteosarcoma patients were downloaded.We extracted the information of cell samples for dimensionality reduction，annotation，and cell function analysis，so as to identify the cell subsets and clarify the cell characteristics related to the prognosis of osteosarcoma.The development trajectory of macrophages with prognostic significance was analyzed，and the prognostic model of osteosarcoma was established based on the differentially expressed genes of macrophage differentiation.Results? The cellular composition presented heterogeneity in the patients with osteosarcoma.The infiltration of mononuclear phagocytes in osteosarcoma had prognostic significance（P=0.003）.Four macrophage subsets were associated with prognosis，and their signature transcription factors included RUNX3（+），ETS1（+），HOXD11（+），ZNF281（+），and PRRX1（+）.Prog_Macro2 and Prog_Macro4 were located at the end of the developmental trajectory，and the prognostic ability of macrophage subsets increased with the progression of osteosarcoma.The prognostic model established based on the differentially expressed genes involved in macrophage differentiation can distinguish the survival rate of osteosarcoma patients with different risks（P<0.001）.Conclusion? Macrophage subsets are closely related to the prognosis of osteosarcoma and can be used as the key target cells for the immunotherapy of osteosarcoma.

Key words：osteosarcoma；single-cell sequencing；mononuclear phagocyte system；macrophage；prognosis

Acta Acad Med Sin，2023，45（5）：773-782

骨肉瘤多起源于四肢長骨，是兒童和青少年群體最常見的原發惡性骨腫瘤［1］。不同病理亞型骨肉瘤的治療方式及預后完全不同［2］，了解骨肉瘤組織細胞組成特征及其特異性功能是臨床防治工作開展的重要基礎。骨肉瘤組織中的腫瘤細胞、各類免疫細胞以及細胞外基質共同形成骨肉瘤微環境，參與癌變后免疫機制以及骨肉瘤的發生發展，并直接影響患者的診斷治療及預后［3］。單細胞測序技術能夠對癌細胞基因組、轉錄組進行全面且精準的分析［4］，已應用于胃癌［5］、肺癌［6］、乳腺癌［7］等多種腫瘤中。結合R語言等生物信息學分析技術，單細胞測序技術能夠捕獲不同腫瘤的細胞組成，揭示腫瘤微環境的異質性［8］。然而，目前缺乏單細胞水平的關于骨肉瘤浸潤細胞及特征的相關研究。本研究旨在利用單細胞轉錄測序數據，對骨肉瘤浸潤細胞中具有預后意義的細胞群體進行鑒定與分析，以期為臨床骨肉瘤防治工作的開展提供理論依據。

資料和方法

資料來源? 骨肉瘤單細胞數據集來源于GSE152048［9］，共計納入11例樣本。骨肉瘤bulk RNA測序數據集從TARGET數據庫（https：//ocg.cancer.gov/programs/target）下載，使用R軟件TCGAbiolinks包進行分析處理。骨肉瘤樣本生存數據從UCSC Xena數據庫（http：//xena.ucsc.edu/）下載。

數據處理? 使用R軟件Seurat包［10］篩選出骨肉瘤單細胞數據集中線粒體基因比例<20%的細胞，為避免骨肉瘤中癌變細胞的差異在數據整合中被消除，分析過程并未去除樣本的批次效應。

降維聚類? 使用RunPCA函數及RunUMAP函數對細胞進行降維聚類，設置dims為1∶50。

細胞注釋? 結合CellTypist數據庫（https：//www.celltypist.org/）及R軟件SingleR包［11］對篩選后的細胞群進行注釋。

R軟件工具包? 調用R軟件Scissor包［12］整合骨肉瘤的bulk測序數據、對應的生存數據以及單細胞數據，檢測單細胞樣本中對預后具有影響的細胞。調用R軟件BayesPrism包［13］，將單細胞數據投射到bulk測序數據中以觀測每一個bulk測序樣本中細胞的組成以及比例差異，同時調用R軟件Survival包結合bulk測序樣本的細胞比例以及生存數據分析具有預后意義的細胞群。調用R軟件pyscenic包［14］分析不同巨噬細胞亞群中轉錄調控因子的富集差異，從而確定具有顯著預后意義的巨噬細胞亞群所具有的轉錄調控因子富集特征。Monocle3［15］和CytoTRACE包［16］被用來探究骨肉瘤中巨噬細胞的發育軌跡及在細胞發育過程中起關鍵作用的基因。

預后模型的構建? 提取Monocle3計算的在巨噬細胞的UMAP降維圖中按照莫蘭指數排位前40的基因，采用LASSO回歸法構建風險預后模型。將TARGET數據庫的85例骨肉瘤組織的bulk測序數據分為訓練集（n=43）和測試集（n=42），基于風險得分將患者分為高風險組和低風險組，采用Log-rank檢驗比較高低風險組患者的生存差異，受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線可視化風險模型對患者生存的預測效能。

結果

骨肉瘤單細胞樣本中細胞的分布與特征? 11例骨肉瘤單細胞測序數據經質控、整合、歸一化處理后對篩選細胞進行降維聚類，結果顯示不同骨肉瘤患者的腫瘤組織中存在多種細胞群，不同細胞群位置離散（圖1A）；不同骨肉瘤單細胞樣本中細胞的組成及比例有著較大差異（圖1B）。11例骨肉瘤樣本中共鑒定出16種細胞類型（圖1C），主要包括成骨細胞、單核巨噬細胞、T細胞、周細胞、成纖維細胞等（圖1D）。使用R軟件Scissor包對單細胞數據和bulk測序數據聯合分析，將具有預后意義的細胞標注在UMAP降維圖中，結果顯示具有較差預后意義的細胞多為癌變的成骨細胞，而具有較好預后意義的細胞多為單核巨噬細胞（圖1E）。

骨肉瘤組織中預后相關細胞群的鑒定? 采用R軟件BayesPrism包將單細胞的注釋結果投射到bulk測序數據中，顯示不同bulk測序樣本中系細胞比例（圖2A）。采用R軟件survival包分析不同占比細胞的預后差異，篩選骨肉瘤微環境中具有預后意義的細胞群，生存分析結果顯示高浸潤比例的單核巨噬細胞（P=0.003）、周細胞（P=0.003）與增殖性成骨細胞（P=0.014）與較好的預后相關（圖2B～2D）。

骨肉瘤單核巨噬細胞亞群的組成及鑒定? 將單核巨噬細胞降維聚類分為9個亞群（圖3A），根據已知單核巨噬細胞marker鑒定細胞亞群類別，氣泡圖注釋浸潤單核巨噬細胞亞群標志基因的表達水平（圖3B）。調用R軟件Scissor包分析單核巨噬細胞群中具有預后意義的細胞，結果顯示除背景細胞外單核巨噬細胞均具有較好預后意義（圖3C），其中具有較強預后意義的細胞亞群主要為巨噬細胞，以0、1、2、6亞群最為顯著（圖3D）。對巨噬細胞0、1、2、6亞群重新進行降維聚類，采用Prog_Macro1～4命名（圖3E），結果顯示Prog_Macro1亞群的特征基因為CTSK、MMP9、CCL2；Prog_Macro2亞群的特征基因為HLA-C、HLA-DRA、HLA-DRB1；Prog_Macro3亞群的特征基因為RNASE1、TREM2、AP1S2；Prog_Macro4的特征基因為MT-ND5、PTGDS、FCGBP（圖3F）。

不同巨噬細胞亞群中特征轉錄調控因子富集分析? 采用pyscenic算法對巨噬細胞的轉錄調控因子進行富集分析（圖4A），在每種巨噬細胞亞群中，挑選出差異富集程度排位前5的轉錄調控因子作為該細胞亞群的特征轉錄調控因子（圖4B）。具有較強預后意義的1、2、6巨噬細胞亞群（Prog_Macro2～4）均差異富集RUNX3（+）和ETS1（+），而0亞群（Prog_Macro1）則差異富集ZNF281（+），同時，可采用PRRX1（+）和HOXD11（+）將0亞群和無預后意義的9亞群區分開（圖4C～4E）。

骨肉瘤浸潤巨噬細胞亞群的發育軌跡? CytoTRACE預測結果顯示，骨肉瘤中無預后意義的巨噬細胞亞群的分化潛能大于有預后意義的巨噬細胞亞群，其中Prog_Macro4分化潛能最低（圖5A、5B）。Monocle3計算結果顯示，巨噬細胞群可能由無預后意義的細胞群開始分化，并逐漸形成有預后意義的細胞群。同時，代表Prog_Macro2和Prog_Macro4的細胞亞群位于發育軌跡的終端，與CytoTRACE的預測結果一致（圖5C、5D）。

基于巨噬細胞分化空間差異基因的預后模型構建? 基于最小絕對收縮和選擇算子Cox回歸算法篩選出的7個特征基因構建風險評估模型，公式為風險評分=PLIN2×（-1.448）+FTL×（-1.274）+HAPLN1×（-0.584）+SLAMF9×0.895+ACKR3×0.516+RPS20×2.777+VEGFA×0.826，生存曲線顯示高風險患者的預后更差（P均<0.01）（圖6A），模型對1、3和5年患者生存率具有較好的區分度，曲線下面積大于0.75（圖6B）。

討論

骨肉瘤是最常見的原發性惡性骨腫瘤，具有惡性度高、生長迅速、早期轉移等特點［17］，其預后是患者及臨床醫生的關注焦點。然而目前缺乏有效指標預測骨肉瘤的預后進展。本研究基于單細胞測序數據，從單細胞水平對骨肉瘤組織浸潤細胞的組成與特征展開探究，揭示骨肉瘤預后相關細胞亞群，為臨床治療提供新的思路。

本研究所采用的測序數據來源于TARGET和GEO數據庫。11例樣本數據降維分析結果顯示，不同骨肉瘤患者組織浸潤的細胞類型包括成骨細胞、單核巨噬細胞、破骨細胞、T細胞、間充質細胞、內皮細胞、骨髓基質干細胞、周細胞和成纖維細胞等，不同患者腫瘤組織浸潤細胞異質性較高。其中，成骨細胞亞群種類較多，包括MT1X/MT1G+、PCP4+、IBSP+、PTGDS/EGFL6+等不同標志亞群，提示成骨細胞在骨肉瘤中的廣泛分化與特異性作用。現有文獻報道骨肉瘤中成骨細胞的分化與臨床進展密切相關［18］，研究顯示骨鈣素是目前成骨細胞較好的特異性標志物，高表達骨鈣素的骨肉瘤患者生存率較高［19］。本研究更詳盡地描述了骨肉瘤中成骨細胞的分化特征，并確定了MT1X/MT1G、PCP4、IBSP、PTGDS/EGFL6等基因為其主要的差異表達基因。

免疫治療是目前腫瘤臨床治療的新型手段。研究表明增強人體的免疫功能可能改善骨肉瘤患者的預后［20］。

通常免疫系統能夠識別人體癌變的組織和細胞［21］，然而腫瘤細胞的免疫逃逸機制使免疫系統失靈，因此，腫瘤免疫治療旨在通過激活體內失效的免疫系統，進而達到殺傷腫瘤細胞的目的［22］。CD8+和CD4+ T細胞是殺傷腫瘤細胞的主要效應細胞，也是針對腫瘤微環境進行免疫治療的主要細胞靶點［23］。然而，本研究發現骨肉瘤組織中雖然有大量T細胞浸潤，然而其表達水平與預后無相關性。但骨肉瘤組織中浸潤的單核巨噬細胞以及周細胞和增殖性成骨細胞與患者預后呈顯著正相關。為進一步探究單核巨噬細胞在骨肉瘤中的重要作用，本研究根據細胞標志基因表達差異將單核巨噬細胞分為9個不同亞群，其中巨噬細胞與預后關聯最顯著。研究表明腫瘤浸潤的單核巨噬細胞在腫瘤微環境中既承擔主要抗原提呈細胞的功能，也是腫瘤發生發展的關鍵調節因子［24］。雖然多項靶向單核巨噬細胞的治療策略已經進入臨床前試驗階段［25-26］，然而由于缺乏對腫瘤微環境復雜性的了解，單核巨噬細胞在腫瘤中的關鍵作用機制尚不清楚。本研究發現巨噬細胞在骨肉瘤預后中的關鍵作用，并對其特征進行了進一步標注。9種單核巨噬細胞亞群中，3、7亞群細胞經鑒定為樹突狀細胞和未知細胞，0、1、2、6亞群細胞為不同特征的巨噬細胞（命名為Prog_Macro1～4），且均能提示較好的骨肉瘤預后。本文通過分析上述細胞亞群的轉錄調控因子對細胞進行鑒別標志。結果顯示，1、2、6亞群為RUNX3（+）+、ETS1（+）+、HOXD11（+）-巨噬細胞群，0亞群為ZNF281（+）+、PRRX1（+）-巨噬細胞群。這些巨噬細胞亞群對骨肉瘤均具有關鍵的預后價值。此外，巨噬細胞發育分析軌跡表明，巨噬細胞并非從腫瘤初始階段即存在預后效應，而是隨著骨肉瘤的不斷進展，持續分化的巨噬細胞才具有預測預后的價值。在具有預后意義的巨噬細胞群體中，Prog_Macro2和Prog_Macro4細胞亞群位于發育終端，且空間差異表達基因的表達下調。使用這些差異基因構建模型能夠對骨肉瘤預后及風險進行有效預測。而無預后意義的巨噬細胞的具體作用及特征有待進一步研究。

近年來有多項研究通過單細胞測序技術揭示了骨肉瘤微環境的異質性以及浸潤的免疫細胞對患者預后的影響。Liu等［27］研究表明骨肉瘤組織中以CD83+、CCR7+、LAMP3+為標志物的成熟調節性樹突狀細胞可通過募集Treg細胞促進腫瘤免疫耐受，進而影響患者的預后。Tu等［28］以及He等［29］研究結果提示骨肉瘤微環境中浸潤的C1Q+和LPAR5+巨噬細胞具有較好的預后意義。這些研究主要根據CIBERSORTx算法推斷bulk測序樣本中免疫細胞富集程度，并以此為依據將收集樣本劃分為高低浸潤組，跟據生存情況計算高低浸潤組生存結局及差異。然而，這種方法僅對推斷異質性較強的細胞亞型有效。骨肉瘤中浸潤的巨噬細胞各亞型間基因表達譜相似，CIBERSORTx算法難以獲得足夠的特征基因標志，進而丟失部分細胞對于患者預后的影響。本研究所采用的Scissor算法可以避免細胞亞型間的基因表達譜過于相似對推斷結果造成的干擾，進而對骨肉瘤組織中影響患者預后的巨噬細胞亞群進行更準確推斷。同時，結合擬時序算法monocle3以及細胞干性算法CytoTrace對具有不同預后意義的巨噬細胞亞群出現的先后進行推測，分析了骨肉瘤浸潤巨噬細胞在不同的分化階段對患者預后影響的差異。Zhou等［9］雖然也對骨肉瘤微環境中浸潤的巨噬細胞進行了系統分析，但只做了傳統的M1、M2以及脂肪酸結合蛋白4+腫瘤相關巨噬細胞分型，同時，也缺乏骨肉瘤浸潤巨噬細胞對于患者預后影響的分析。而本研究進一步完善了骨肉瘤中巨噬細胞群的不同分型及其對于患者預后的影響。

綜上，本研究結果表明，巨噬細胞亞群與骨肉瘤預后密切相關，可作為骨肉瘤免疫治療的關鍵靶細胞。然而本研究未針對不同病理亞型的骨肉瘤患者的細胞組成及預后情況進行分析，未來應擴大樣本類型進行更深入的研究；同時，應關注無預后意義的巨噬細胞群體在骨肉瘤中所起到的潛在作用。

參考文獻

［1］Czarnecka AM，Synoradzki K，Firlej W，et al.Molecular biology of osteosarcoma[J].Cancers，2020，12（8）：2130.DOI：10.3390/cancers12082130.

［2］Gill J，Gorlick R.Advancing therapy for osteosarcoma[J].Nat Rev Clin Oncol，2021，18（10）：609-624.DOI：10.1038/s41571-021-00519-8.

［3］Yang C，Tian Y，Zhao F，et al.Bone microenvironment and osteosarcoma metastasis[J].Int J Mol Sci，2020，21（19）：6985.DOI：10.3390/ijms21196985.

［4］Tang X，Huang Y，Lei J，et al.The single-cell sequencing：new developments and medical applications[J].Cell Biosci，2019，9（1）：1-9.DOI：10.1186/s13578-019-0314-y.

［5］Sathe A，Grimes SM，Lau BT，et al.Single-cell genomic characterization reveals the cellular reprogramming of the gastric tumor microenvironment[J].Clin Cancer Res，2020，26（11）：2640-2653.DOI：10.1158/1078-0432.CCR-19-3231.

［6］Maynard A，McCoach CE，Rotow JK，et al.Therapy-induced evolution of human lung cancer revealed by single-cell RNA sequencing[J].Cell，2020，182（5）：1232-1251.e22.DOI：10.1016/j.cell.2020.07.017.

［7］Grosselin K，Durand A，Marsolier J，et al.High-throughput single-cell ChIP-seq identifies heterogeneity of chromatin states in breast cancer[J].Nat Genet，2019，51（6）：1060-1066.DOI：10.1016/j.cell.2020.07.017.

［8］Levitin HM，Yuan J，Sims PA.Single-cell transcriptomic analysis of tumor heterogeneity[J].Trends Cancer，2018，4（4）：264-268.DOI：10.1016/j.trecan.2018.02.003.

［9］Zhou Y，Yang D，Yang Q，et al.Single-cell RNA landscape of intratumoral heterogeneity and immunosuppressive microenvironment in advanced osteosarcoma[J].Nat Commun，2020，11（1）：6322.DOI：10.1038/s41467-020-20059-6.

［10］Stuart T，Butler A，Hoffman P，et al.Comprehensive integration of single-cell data[J].Cell，2019，177（7）：1888-1902.e21.DOI：10.1016/j.cell.2019.05.031.

［11］Aran D，Looney AP，Liu L，et al.Reference-based analysis of lung single-cell sequencing reveals a transitional profibrotic macrophage[J].Nat Immunol，2019，20（2）：163-172.DOI：10.1038/s41590-018-0276-y.

［12］Sun D，Guan X，Moran AE，et al.Identifying phenotype-associated subpopulations by integrating bulk and single-cell sequencing data[J].Nat Biotechnol，2022，40（4）：527-538.DOI：10.1038/s41587-021-01091-3.

［13］Chu T，Wang Z，Peer D，et al.Cell type and gene expression deconvolution with BayesPrism enables Bayesian integrative analysis across bulk and single-cell RNA sequencing in oncology[J].Nat Cancer，2022，3（4）：505-517.DOI：10.1038/s43018-022-00356-3.

［14］Aibar S，González-Blas CB，Moerman T，et al.SCENIC：single-cell regulatory network inference and clustering[J].Nat Methods，2017，14（11）：1083-1086.DOI：10.1038/nmeth.4463.

［15］Qiu X，Mao Q，Tang Y，et al.Reversed graph embedding resolves complex single-cell trajectories[J].Nat Methods，2017，14（10）：979-982.DOI：10.1038/nmeth.4402.

［16］Gulati GS，Sikandar SS，Wesche DJ，et al.Single-cell transcriptional diversity is a hallmark of developmental potential[J].Science，2020，367（6476）：405-411.DOI：10.1126/science.aax0249.

［17］Sadykova LR，Ntekim AI，Muyangwa-Semenova M，et al.Epidemiology and risk factors of osteosarcoma[J].Cancer Invest，2020，38（5）：259-269.DOI：10.1080/07357907.2020.1768401.

［18］Araki Y，Yamamoto N，Hayashi K，et al.The number of osteoclasts in a biopsy specimen can predict the efficacy of neoadjuvant chemotherapy for primary osteosarcoma[J].Sci Rep，2021，11（1）：1-9.DOI：10.1038/s41598-020-80504-w.

［19］Cascini C，Chiodoni C.The immune landscape of osteosarcoma：implications for prognosis and treatment response[J].Cells，2021，10（7）：1668.DOI：10.3390/cells10071668.

［20］Wang Z，Wang Z，Li B，et al.Innate immune cells：a potential and promising cell population for treating osteosarcoma[J].Front Immunol，2019，10：1114.DOI：10.3389/fimmu.2019.01114.

［21］Gonzalez H，Hagerling C，Werb Z.Roles of the immune system in cancer：from tumor initiation to metastatic progression[J].Gene Dev，2018，32（19-20）：1267-1284.DOI：10.1101/gad.314617.118.

［22］Binnewies M，Roberts EW，Kersten K，et al.Understanding the tumor immune microenvironment（TIME）for effective therapy[J].Nat Med，2018，24（5）：541-550.DOI：10.1038/s41591-018-0014-x.

［23］Waldman AD，Fritz JM，Lenardo MJ.A guide to cancer immunotherapy：from T cell basic science to clinical practice[J].Nat Rev Immunol，2020，20（11）：651-668.DOI：10.1038/s41577-020-0306-5.

［24］Luo ZW，Liu PP，Wang ZX，et al.Macrophages in osteosarcoma immune microenvironment：implications for immunotherapy[J].Front Oncol，2020，10：586580.DOI：10.3389/fonc.2020.586580.

［25］Goswami S，Anandhan S，Raychaudhuri D，et al.Myeloid cell-targeted therapies for solid tumours[J].Nat Rev Immunol，2022：1-15.DOI：10.1038/s41577-022-00737-w.

［26］Veglia F，Sanseviero E，Gabrilovich DI.Myeloid-derived suppressor cells in the era of increasing myeloid cell diversity[J].Nat Rev Immunol，2021，21（8）：485-498.DOI：10.1038/s41577-020-00490-y.

［27］Liu W，Hu H，Shao Z，et al.Characterizing the tumor microenvironment at the single-cell level reveals a novel immune evasion mechanism in osteosarcoma[J].Bone Res，2023，11（1）：4.DOI：10.1038/s41413-022-00237-6.

［28］Tu J，Wang D，Zheng XT，et al.Single-cell RNA datasets and bulk RNA datasets analysis demonstrated C1Q+ tumor-associated macrophage as a major and antitumor immune cell population in osteosarcoma[J].Front Immunol，2023，14：438.DOI：10.3389/fimmu.2023.911368.

［29］He Y，Zhou H，Huang X，et al.Infiltration of LPAR5+ macrophages in osteosarcoma tumor microenvironment predicts better outcomes[J].Front Immunol，2022，13：909932.DOI：10.3389/fimmu.2022.909932.

（收稿日期：2023-03-14）