黑龍江省水稻穗腐病致病菌(Alternaria spp.)的鑒定及生物學特性分析

李 雪, 孫宇佳, 劉 瑞, 付忠舉, 靳學慧, 華麗霞, 張亞玲

(1.黑龍江八一農墾大學/黑龍江省植物抗性研究中心,黑龍江大慶 163319; 2.四川省農業科學院經濟作物育種栽培研究所,四川成都 610300)

水稻穗腐病(rice spikelet rot disease,簡稱RSRD)是一種由多種真菌引起的水稻穗部病害[1],該病在水稻種植區均有不同程度的發生,嚴重地塊發病率可達100%,受害稻穗結實率下降,千粒質量降低,減產5%～10%,嚴重可達30%以上,甚至絕收[2]。國內外研究學者認為,造成水稻穗腐病的主要病原菌有多種,如鐮孢菌屬(Fusariumsp.)、鏈格孢菌屬(Alternariasp.)、彎孢菌屬(Curvulariasp.)、蠕孢菌屬(Bipolarissp.)[3-6]。張俊華等于2018年對黑龍江省穗腐病病原進行鑒定,從水稻穗腐病樣本上分離純化得到119個菌株,其中鏈格孢屬有112株,認為該菌屬為主要致病菌,經ITS鑒定為鏈格孢[7]。研究表明,不同區域的鏈格孢屬優勢致病菌有差異,費丹等將安徽省穗腐病病原菌鑒定為細交鏈格孢菌[8];胡頌平等將江西省穗腐病病原菌鑒定為細交鏈格孢菌[9]。

黑龍江省是我國水稻主產區,水稻穗腐病每年都有不同程度的發生,且有逐年加重的趨勢。雖然前人研究表明,黑龍江省水稻穗腐病的病原菌主要是以鏈格孢菌為主[10-11],但前人對鏈格孢屬菌株的鑒定大部分基于形態學鑒定或者是單一菌株的ITS分子鑒定,關于黑龍江省水稻穗腐病致病菌鏈格孢屬的多樣性尚未見報道,對于鏈格孢屬致病機制亦研究較少。

有研究報道,當病菌侵染菌絲通過組織的細胞侵入時,會產生一些細胞壁降解酶降解植物組織,使病菌在細胞間迅速擴展,病菌侵入組織后,需要大量的能源,病原菌產生的纖維素酶、淀粉酶、蛋白酶和其他酶類在致病過程中通過分解細胞壁和細胞內含物為病原菌提供了豐富的碳氮源,相關外泌酶在病原菌致病過程中起重要作用[12-13]。本研究旨在分析黑龍江省水稻主產區水稻穗腐病致病菌鏈格孢屬的多樣性,明確不同類型鏈格孢屬真菌的生物學特性,同時對各菌株的外泌酶產生情況進行比較分析,以此初步探索鏈格孢菌屬各類菌種的致病機制,為該病的防控提供理論依據。

1 材料與方法

試驗于2021年9月至2022年11月于黑龍江八一農墾大學植物抗性研究中心實驗室與四川省農業科學院經濟作物育種栽培研究所完成。

1.1 試驗材料

水稻穗腐病病樣采集于黑龍江省水稻主產區建三江科研所水稻實驗田、綏化市北林區、慶安縣、通河縣、綏濱縣等5個地區。接種鑒定供試水稻品種為龍粳31。

1.2 病原菌的分離與純化

采用組織分離法[14]對病原菌進行分離和純化。采集得到的具有水稻穗腐病癥狀的稻谷用自來水反復沖洗干凈放在濾紙上晾干,將其內外穎殼分離,用滅菌剪刀在病健交界處剪取2 mm×2 mm的病組織,先經乙醇消毒5 s后經漂白粉溶液(水溶液與漂白粉比例為14 mL ∶1 g)浸泡5 min進行表面消毒, 再用無菌水漂洗3次,置于無菌濾紙上吸干水分,呈“品”字形轉接于PDA培養基上,于28 ℃在黑暗條件下培養。待菌落長出后,進行初次鏡檢,用單孢分離法[15]從菌落上挑取單個孢子,移至PDA培養基上進一步培養,將獲得的純化菌株用濾紙片法[16]保存備用。

1.3 病原菌致病性驗證

將供試水稻種植于直徑為27 cm的花盆內,待水稻長至孕穗期時,制備濃度為1×105個/mL的新鮮孢子懸浮液,使用2 mL的醫用注射器將孢懸液注入穗苞上部,直至注射部位有3～5滴菌液溢出[17],接種后的水稻放置于溫室內28 ℃保濕培養24 h,光—暗周期為12 h—12 h,對照組注射無菌水。6 d后觀察植株發病情況。取發病谷粒,重新分離純化,將分離純化得到的菌株與原接種菌株進行形態學比較,驗證是否與原接種病原菌相同,從而完成柯赫氏法則驗證病原菌的致病性。

1.4 病原菌鑒定

1.4.1 形態鑒定 將菌株接種于PDA培養基上,28 ℃恒溫培養5 d后觀察菌落形態,用無菌接種刀刮取菌絲,制作臨時玻片,使用ECLIPSE 80i顯微鏡觀察各菌株分生孢子形態。

1.4.2 分子生物學鑒定 采用CTAB法[18]提取病原菌的基因組DNA,利用5.8S rDNA核糖體內轉錄間隔區(internal transcribed spacers,ITS)引物對菌株DNA進行擴增,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,引物序列為ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)[19]。

擴增體系：正反引物各1.00 μL,9.00 μL ddH2O,1.50 μL DNA 模板,12.50 μL 2×EsTaqMaster Mix (Dye),總體積25.00 μL。

擴增程序：94 ℃預變性2 min;94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共35個循環;72 ℃延伸10 min后4 ℃保存。擴增產物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序,將測序結果在NCBI GenBank(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)中進行BLAST比對。選擇相關鏈格孢種菌株的ITS序列與供試菌株ITS序列作BLASTn對比分析,用MEGA 7.0軟件中的Neighbor-Joining(NJ)法構建系統發育樹進行系統演化分析,檢驗重復次數(Bootstrap test)為1 000次。供試菌株的核酸序列數據NMDCN0001CE1-NMDCN0001CE8存儲在國家微生物科學數據中心(NMDC),鏈接為https://nmdc.cn/resource/genomics/sequence/detail/ NMDCXXXX XXXX。根據分析結果確定病原菌的分類學種名。

1.5 鏈格孢菌屬不同菌株的生物學特性分析

1.5.1 測定不同培養基、溫度、pH值對菌絲生長的影響 從培養5 d的菌落邊緣取直徑為5 mm的菌餅,接種于以下條件進行培養：(1) 培養基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養基、馬鈴薯蔗糖瓊脂(PSA)培養基、米糠培養基和查氏(Czapek)培養基,28 ℃恒溫培養;(2)溫度選用15、20、26、28、30、32 ℃,進行恒溫培養;(3)選用pH值為5、6、7、8、9、10、11和12的PDA培養基,28 ℃恒溫培養。每個處理重復3次,5 d 后采用十字交叉法[20]測量菌落直徑。

1.5.2 測定不同碳、氮源對菌絲生長的影響 以Czapek培養基[21]為基礎培養基,將直徑為5 mm 的菌餅分別接種于8種不同的碳源培養基：葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、乳糖、可溶性淀粉、甘油、甘露醇及6種不同的氮源培養基：牛肉膏、蛋白胨、尿素、硝酸銨、硝酸鈉、氨基乙酸[7],28 ℃恒溫培養,每個處理重復3次,測定方法同“1.5.1”節。

1.6 外分泌酶活性檢測

參考賈熙超等的方法[22]將直徑為5 mm的菌餅接種于蛋白酶檢測培養基上,28 ℃恒溫培養,每個處理重復3次,培養3 d,觀察是否產生透明水解圈;纖維素酶與淀粉酶的檢測分別參考張荷花、蔡鴻杰等的方法[23-24]并在其基礎上加以改進,如圖1所示在相應檢測培養基上鋪1層邊長為6 cm 的正方形無菌干燥濾紙片,再將直徑為5 mm的菌餅接種于濾紙片中心,28 ℃恒溫培養,每個處理重復3次,培養3 d,揭掉濾紙片進行染色觀察。纖維素酶檢測使用0.10%剛果紅染液對培養基進行染色,染色 10 min,用1 mol/L NaCL溶液脫色2～3次,觀察是否產生黃色透明的水解圈,淀粉酶檢測使用碘液進行染色, 觀察是否產生明顯的水解圈。通過測定水解圈大小與菌落直徑的關系,確定各菌株對蛋白質、纖維素和淀粉的分解效率。分解效率=水解圈直徑/菌落直徑×100%[24]。

2 結果與分析

2.1 病原菌分離與形態比較

對采集到的39個樣本進行分離純化,共獲得181個菌株,根據分生孢子形態鑒定到鏈格孢屬菌株151個,占83.43%。選取其中37個菌株進行形態學比較,根據菌落形態,劃分為8個類型,分別記錄為 A1～A8。

由圖2可知,8個類型的菌株在PDA培養基上菌落生長狀態和顏色各不相同,A1為綠色,A2為深棕色,A3為棕色,A4為灰綠色,A5中心淺綠色邊緣大部分為白色,A6為白色,A7為深綠色,A8為淺綠色。A1、A2、A3、A6在PDA平板上菌落表面平整,邊緣整齊,菌絲埋生;A4、A5、A7、A8在PDA平板上菌落平展,棉絮狀,氣生菌絲發達;8個類型的分生孢子均為淡褐色或褐色,有橫隔和縱隔,在孢子形態上有差異,A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7分生孢子呈棍棒狀或倒梨形,具有橫隔1～6個,縱隔1～5個,分隔處有縊縮,頂端喙狀細胞較短,圓柱形或錐形;A8分生孢子呈倒棍棒狀,具有橫隔4～8個,縱隔 1～4個,橫隔分隔處有縊縮,短喙柱形。

2.2 致病力驗證

從8個類型中分別選取1個代表性菌株進行致病力驗證,接種結果表明,8株分離菌株均可使水稻表現出和田間水稻病害相同或相近的癥狀(圖3),穎殼上有鐵銹色圓形或不規則狀的斑點。再次分離收集接種感病稻谷,和初次分離純化病原菌的方法一樣。再次分離純化均得到與初接菌株相同的分離物,符合柯赫氏法則,證實8株分離菌株均為引起水稻穗腐病的致病菌。

2.3 分子生物學鑒定

利用真菌通用引物ITS1/ITS4對37個菌株進行分子鑒定,同源性比對結果表明,18個菌株的ITS序列與細交鏈格孢菌(Alternariatenuissima)同源性高達99.82%,可確定為細交鏈格孢菌,記為Ⅰ類菌;18個菌株與鏈格孢菌(Alternariaalternata)同源性高達99.45%,確定為鏈格孢菌,記為Ⅱ類菌;僅1個菌株與蕓薹鏈格孢菌(Alternariabrassicae)同源性高達100.00%,確定為蕓薹鏈格孢菌,記為Ⅲ類菌。其中,上述接種驗證的8個菌株,A1～A4分子鑒定為細交鏈格孢菌,屬于Ⅰ類菌,A5～A7為鏈格孢菌,屬于Ⅱ類菌,A8為蕓薹鏈格孢菌,屬于Ⅲ類菌,這8個致病菌與已報道的鏈格孢菌屬的親緣關系見圖4。

2.4 不同類型鏈格孢屬菌株的生物學特性比較

以A1～A8這8個致病菌作為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類菌的代表菌,比較不同鏈格孢屬菌株的生物學特性。

2.4.1 不同培養基、溫度、pH值對菌絲生長的影響 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類菌均能在PDA、米糠、Czapek、PSA等4種培養基上生長,但生長速率不同(圖5)。Ⅰ類菌的最適生長培養基為PDA或米糠培養基,在Czapek培養基上的生長速度最慢;Ⅱ類菌和Ⅲ類菌的最適培養基同為米糠培養基,Ⅱ類菌在PSA培養基上菌絲生長最弱;Czapek培養基不利于Ⅲ類菌的菌絲生長。

Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類菌均能在15～32 ℃與pH值范圍為5～12時生長,但生長速率有差異(圖6)。Ⅰ類菌A1、A2的菌絲最適生長溫度為26 ℃,最適pH值為7,A3的最適生長溫度范圍為26～30 ℃,最適pH值范圍為7～10,A4的最適生長溫度范圍為28～30 ℃,pH值為9;Ⅱ類菌中A5和A7的最適生長溫度范圍為26～30 ℃,最適pH值分別為7、8,A6、A8的最適生長溫度范圍同為28～30 ℃,最適pH值范圍分別為8～10、8～9。

同一菌種的不同菌株同樣存在生物學特性差異(表1)。Ⅰ類菌中的4個菌株在PDA培養基上的生長速度存在顯著性差異,Ⅱ類菌中的3個菌株在最優生長培養基米糠培養基上的生長速度也具有顯著性差異;在最適生長溫度范圍26～30 ℃內,Ⅰ類菌的4個菌株在各個溫度條件下的生長速度均存在顯著性差異,Ⅱ類菌的3個菌株在溫度為28、30 ℃時的生長速度存在顯著性差異;Ⅰ類菌中的4個菌株在最適生長pH值范圍為8～10時的生長速度存在顯著性差異,Ⅱ類菌的3個菌株在最適生長pH值范圍為7～10時的生長速度存在顯著性差異。

表1 同一菌種不同菌株之間的生物學特性比較

2.4.2 不同碳、氮源對菌絲生長的影響 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類菌在不同的碳、氮源培養基上均可生長,但生長速率不同(圖7),Ⅰ類菌不同菌株對不同碳源的利用效率不同,A1在葡萄糖中生長最快,A2在葡萄糖、蔗糖、乳糖和麥芽糖中生長較快,無顯著性差異,A3的最適碳源為甘露醇,A4在葡萄糖、果糖和可溶性淀粉為碳源的培養基上菌絲生長最快,無顯著性差異。Ⅱ類菌中A5的最適碳源為可溶性淀粉,A6為葡萄糖、A7為甘露醇。Ⅲ類菌A8在以葡萄糖和可溶性淀粉為碳源的培養基上菌絲生長最快,菌落直徑最大。

Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類菌在以尿素為氮源的培養基上生長最差,A6在硝酸鈉和硝酸銨為氮源的培養上生長最好,其他菌株以牛肉膏和蛋白胨為氮源的培養基上菌絲生長最好。

2.4.3 外分泌酶檢測結果 在蛋白酶、纖維素酶和淀粉酶檢測培養基上均觀察到透明水解圈的產生(圖8),說明Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類菌均能產生蛋白酶、纖維素酶及淀粉酶分解利用蛋白質、纖維素和淀粉。菌株對3類物質分解效率的測定結果(表2)表明,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類菌對3類物質的分解能力存在差異,其中A1、A3、A5、A8對纖維素的分解效率最強,分別為169.14%、151.15%、165.23%、148.22%;A5對淀粉的分解效率最強,為169.38%,A1最差,為66.04%;A1對蛋白質的分解效率最強,為104.53%,A8最差,為83.19%。

表2 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ類菌產生的外分泌酶的分解效率

3 討論

鏈格孢屬是引起水稻穗腐病的重要病原物,《中國真菌志 第十六卷 鏈格孢屬》[25]記錄有123個種及變種。目前對于鏈格孢屬真菌種的鑒定主要是以形態鑒定為主。本研究在相同條件下分離培養過程中發現8類不同生長狀態的菌體,通過孢子形態觀察其均符合鏈格孢屬形態特征,用通用引物ITS1/ITS4進行分子鑒定時,將其分為3類, 但是在構建系統發育樹時并沒有將3類菌完全分在不同分枝上,說明通過核糖體DNA-ITS序列分析來確定鏈格孢屬種間分類是有局限性的。

對于黑龍江省鏈格孢屬真菌引起的穗腐病多認為是由鏈格孢菌引起的[10],而胡頌平等研究發現新疆省、河南省和江西省水稻穗腐病是由細交鏈格孢菌引起[9,26-27]。本研究發現引起黑龍江省水稻穗腐病的鏈格孢屬有3種,分別為細交鏈格孢菌、鏈格孢菌和蕓薹鏈格孢菌,均是黑龍江省水稻穗腐病的致病菌。其中細交鏈格孢菌和鏈格孢菌為該病害主要致病菌,均占鏈格孢屬總數的48.65%,僅分離得到1株蕓薹鏈格孢菌。

本試驗將分屬于3類不同菌種的8個代表菌株進行生物學特性研究。結果表明,溫度、 pH值、培養基和碳、氮源等不同條件對3類菌的菌絲生長均有顯著影響。本研究還發現,同一類菌在同一條件下的生長情況不同,如Ⅰ類菌中A3和A4的最適生長溫度范圍分別為26～30 ℃、28～30 ℃,A1和A2的最適溫度為26 ℃,與黃世文等研究的細交鏈格孢菌最適溫度范圍為25～28 ℃[2]存在差異。Ⅰ類菌中A3的最適培養基為米糠培養基,其余3個菌株的最適培養基均是PDA和米糠培養基,這暗示著同一菌屬的不同菌種生物學特性存在差異。本研究還發現,同一菌種不同菌株在同一類型的培養基中生長速度存在顯著差異,且對pH值、溫度的需求亦存在差異,暗示著同一菌種不同菌株同樣存在生物學特性的差異,然而這種種間以及種內的生物學特性差異是否與致病力有相關性需進一步研究論證。8個菌株的最適碳源為葡萄糖和可溶性淀粉,氮源為牛肉膏和蛋白胨,這與胡頌平等報道的適合細交鏈格孢菌生長的碳源[9]一致,與其報道的最適氮源存在差異。

在與寄主互作過程中,病原微生物產生的外分泌酶對成功侵染寄主具有重要的作用[28]。纖維素是植物細胞壁的主要成分,是阻礙病原物侵染的第一道屏障[29-32]。淀粉是水稻籽粒重要的營養成份,水稻抽穗后進入灌漿期,這一時期穎殼內會產生大量的淀粉,從而為病原菌提供了良好的營養條件;候恩慶等研究發現,凡是這一時期利用淀粉進行繁殖的植物病原菌,幾乎都能使谷粒感病[33]。本研究發現,8個致病菌生長最佳碳源為可溶性淀粉,且均能產生淀粉酶和纖維素酶,這2種酶的產生可能是鏈格孢屬菌株重要的致病機制。本研究發現不同菌株產生的淀粉酶及纖維素酶總量或活性存在顯著差異,是否與致病力具有相關性需要進一步通過接種驗證。

有趣的是,本研究從水稻穗腐病病樣中分離得到1株致病菌蕓薹鏈格孢菌(A8),該菌種為十字花科黑斑病的主要致病菌[34],關于蕓薹鏈格孢菌侵染水稻的報道尚未見報道。A8經淀粉酶活性檢測發現能產生淀粉酶分解利用淀粉,這可能是因為蕓薹鏈格孢菌能利用淀粉進行繁殖從而使植株感病,后續將通過分離鑒定更多的鏈格孢屬菌株來驗證這一假設。

4 結論

黑龍江省水稻主產區穗腐病的致病菌為鏈格孢屬菌株,其中細交鏈格孢菌、鏈格孢菌為優勢菌種,均占菌株數量的48.65%,只有1株為蕓薹鏈格孢菌。水稻穗腐病病原菌的菌絲生長受培養基、溫度、pH值和碳、氮源的影響,其中溫度和碳、氮源的影響較突出。不同的生理小種在不同的碳、氮源培養基上菌絲生長速率存在差異,較適合所有菌株菌絲生長的碳源為葡萄糖和可溶性淀粉,氮源為牛肉膏和蛋白胨。8個菌株均能分泌3種外分泌酶。分析結果表明,鏈格孢菌屬不同菌種存在生物學特性差異,同一菌種的不同菌株也存在生物學特性差異。