坦布蘇病毒RNA復制子系統的構建與應用

章麗嬌, 趙冬敏, 韓凱凱, 黃欣梅, 楊 婧, 吳鳳瑤, 劉青濤, 劉宇卓, 張小飛, 李 銀

[1.江蘇省農業科學院獸醫研究所,江蘇南京 210014; 2.獸用生物制品(泰州)國泰技術創新中心,江蘇泰州 225300]

坦布蘇病毒病是我國新發現的一種由坦布蘇病毒(Tembusu virus,TMUV)引起的以水禽嚴重產蛋下降和神經系統異常為主要特征的重要傳染病[1-2]。該病自2010年暴發以來,傳播迅速,幾乎席卷了我國大部分水禽養殖地區,發病率高達100%,死亡率為5%～30%[3]。目前,坦布蘇病毒已成為危害我國水禽養殖業的主要流行病原之一。

坦布蘇病毒是黃病毒科(Flaviviridae)黃病毒屬(Flavivirus)成員之一,具有典型的黃病毒屬基因組結構特征,為單股正鏈RNA,全長10 990 nt,編碼單一的開放讀碼框,包括衣殼蛋白(C)、基質蛋白(PrM)、囊膜蛋白(E)3個結構蛋白和7個非結構蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5),5′端有Ⅰ型帽子結構,3′端無聚合賴氨酸尾。研究表明,黃病毒屬病毒作為單股正鏈RNA病毒,缺失部分或全部結構蛋白基因后仍可形成具有自主復制能力的病毒亞基因組,即RNA復制子,其可表達病毒自身非結構蛋白和插入的外源基因蛋白,但不會產生具有感染性的病毒顆粒[4]。目前,日本乙型腦炎病毒、西尼羅病毒、登革熱病毒及寨卡病毒等RNA復制子相繼被成功構建與應用[5-8]。病毒復制子是病毒基因組結構與功能研究、抗病毒藥物篩選及新型疫苗研發等方面的有力工具。

本研究在坦布蘇病毒JXSP株感染性克隆基礎上[9],利用反向遺傳操作技術,不同程度缺失病毒的結構蛋白基因,同時在缺失部位插入綠色熒光蛋白基因,構建RNA復制子,鑒定活性,并應用該平臺表達H9亞型禽流感HA基因,為坦布蘇病毒致病機制和新型疫苗的開發提供新的技術手段和平臺。

1 材料與方法

1.1 毒株、細胞和質粒

試驗所用坦布蘇病毒JXSP株由中國農業大學蘇敬良教授饋贈;BHK-21細胞系和質粒pEGFP-N1均由筆者所在實驗室保存。

1.2 主要試劑和耗材

高保真酶Primer Star Mix,購自Takara公司;凝膠回收純化試劑盒,購自Axygen公司;RiboMAXTMLarge Scale RNA Production Systems(T7)和Ribo m7G Cap Analog,均購自Promega公司;酚 ∶三氯甲烷 ∶異戊醇(25 ∶24 ∶1,pH值<5.0)和三氯甲烷 ∶異戊醇(24 ∶1),均購自北京索萊寶科技有限公司;Opti-MEM? I Reduced Serum Medium和Lipofectamine MessengerMAXTM,均購自Invitrogen公司;胎牛血清,購自Hyclone公司;SYBR qPCR Master Mix,購自諾唯贊公司;H9N2 HA鼠單抗,購自北京義翹神州科技有限公司;β-actin鼠單抗,購自康維世紀生物科技有限公司;辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG,購自中杉金橋公司;常規的試劑和儀器均由江蘇省農業科學院獸醫研究所水禽實驗室提供。

1.3 引物設計與合成

根據GenBank中登錄的坦布蘇病毒JXSP株全基因組序列(登錄號：JQ920423)和綠色熒光蛋白基因序列設計引物(表1)。引物于2022年3月份由南京金斯瑞生物有限公司合成。

表1 TMUV RNA復制子構建引物

1.4 4種坦布蘇病毒RNA復制子全長cDNA的構建

采用 Axygen體液病毒核酸提取試劑盒,提取坦布蘇病毒JXSP株RNA,利用 Promega 反轉錄試劑盒生成cDNA。以病毒cDNA為模板,利用表1引物分段擴增,獲得不同程度缺失結構蛋白基因的病毒基因組PCR片段。以pEGFP-N1質粒為模板,利用EGFP-F/2A+EGFP-R引物對擴增,獲得EGFP-2A片段。各PCR目的片段產物經1%凝膠電泳鑒定,并用Axygen瓊脂糖DNA凝膠回收試劑盒回收與純化。純化后的片段進行雙鏈DNA濃度測定。按圖1所示構建策略,采用融合PCR方法,連接各片段,分別使病毒基因組缺失CPrME、CPrM、PrME和PrM結構蛋白,缺失部位插入外源蛋白報告基因EGFP-2A。融合PCR反應體系如下：Primer Star Mix(2×) 25 μL,T7+1F和10990R各 1 μL,各連接片段以相同摩爾數加入,雙蒸水加至50 μL。PCR反應程序如下：98 ℃預變性5 min;98 ℃ 變性10 s、52 ℃退火15 s、72 ℃延伸3 min 30 s,30個循環;72 ℃延伸7 min。融合片段電泳鑒定后切膠回收純化,送至上海生工生物工程有限公司測序。

1.5 體外轉錄RNA

采用RiboMAXTMLarge Scale RNA Production Systems(T7)對純化并測序正確的融合PCR產物進行體外轉錄,根據說明書構建如下30 μL反應體系：5×Reaction buffer 6.00 μL,ATP、CTP和UTP各2.25 μL,GTP 0.50 μL,Ribo m7G Cap Analog 2.25 μL,DNA模板12.00 μL,Enzyme mix 3.00 μL。37 ℃反應4 h,加入1.80 μL Dnase,37 ℃作用15 min,消化模板。苯酚三氯甲烷抽提體外轉錄產物,測定RNA濃度,-70 ℃保存。

1.6 轉染

采用Lipofectamine MessengerMaxTM試劑盒將純化的RNA轉染至BHK-21細胞。具體操作步驟如下：PBS輕輕洗滌細胞3次,每孔加入200 μL Opti-MEM? I Reduced Serum Medium,將1.5 μL Lipofectamine?MessengerMax Reagent與25.0 μL Opti-MEM混勻,將1 μg RNA與25 μL Opti-MEM混勻,將轉染試劑稀釋液和RNA稀釋液等體積混勻,室溫5 min,復合物以50 μL/孔加入24孔板BHK-21單層細胞,同時設立轉染試劑對照,37 ℃培養4 h后吸棄轉染混合液,加入含3%胎牛血清的DMEM維持液,于37 ℃、5% CO2條件下培養。

1.7 EGFP報告基因表達檢測

使用Olympus公司IX-51型熒光顯微鏡觀察轉染后不同時間點4種RNA復制子在BHK-21細胞內綠色熒光蛋白的表達情況。

1.8 復制子中EGPF 轉錄能力檢測

采用RNA抽提試劑盒,按說明書操作提取細胞樣品RNA,反轉錄生成cDNA。以cDNA為模板,進行SYBR Green相對熒光定量PCR反應。EGFP基因上下游擴增引物：5′-AAGCAGAAGAACGGCATCAAGG-3′和5′-CACGAACTCCAGCAGGACCATG-3′;內參基因β-actin上下游擴增引物：5′-TTGGAGGCTCTATCCTGG-3′和5′-TAGAAGCATTTGCGGTGG-3′。用2-ΔΔCT法計算EGFP RNA相對轉錄量。

1.9 應用TMUV RNA復制子表達H9亞型禽流感HA基因

提取H9亞型禽流感病毒NJ01株RNA,反轉錄為cDNA,利用HA F+191F/2A+HA R引物對擴增HA片段,以ΔCPrME構建策略為基礎,將EGFP片段替換為HA片段,利用融合PCR方法獲得基因組全長,體外轉錄為mRNA,轉染至BHK-21細胞。收集轉染72 h后的細胞樣品,提取細胞總蛋白,測定蛋白濃度后經Western blotting檢測蛋白表達。以H9N2 HA鼠單抗為一抗,辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG 為二抗,ECL顯影觀察。

2 結果與分析

2.1 4種TMUV RNA復制子全長cDNA的構建

通過PCR擴增獲得了Pa&b1、Pc&d1、Pegfp-2A、Pa&c(3+4)、Pb&d3、P4、P5、P6、P7、P8等10個目的片段,大小依次為237、504、798、1 747、1 548、1 557、1 876、1 603、2 093、1 491 bp。PCR片段經電泳鑒定,由圖2可知,與預期大小一致。純化的PCR片段按圖1所示方案,通過融合PCR,成功獲得了ΔCPrME、ΔCPrM、ΔPrME、ΔPrM 4種TMUV RNA復制子全長cDNA,大小依次為9 657、11 094、9 924 、11 362 bp。由圖3可知,電泳結果與預期相符,測序結果顯示,序列均與預期一致。純化的全長PCR產物經體外轉錄和苯酚-三氯甲烷抽提,獲得ΔCPrME、ΔCPrM、ΔPrME、ΔPrM體外轉錄mRNA,濃度分別為535、531、469、427 ng/μL。

2.2 TMUV RNA復制子活性的鑒定

為鑒定所構建的TMUV RNA復制子的活性,將ΔCPrME、ΔCPrM、ΔPrME和ΔPrM體外轉錄體mRNA轉染BHK-21細胞,分別于轉染后24、48、72 h 在熒光顯微鏡下觀察細胞內EGFP的表達情況。由圖4可知,4種復制子RNA轉染的BHK-21細胞在各檢測時間點均能在胞漿和胞核中觀察到綠色熒光信號。4種復制子中,ΔCPrME熒光信號最強,ΔPrM次之,ΔCPrM和ΔPrME無明顯差異。對照組細胞均未觀察到綠色熒光信號。以上結果表明,構建的4種RNA復制子均能有效地表達外源蛋白EGFP,其中,ΔCPrME效果最佳。

2.3 TMUV RNA復制子表達EGFP基因能力的驗證

為驗證構建的TMUV RNA復制子自我復制的能力,將ΔCPrME體外轉錄體mRNA轉染BHK-21細胞后,分別于12、24、48、72 h收集細胞樣品RNA,進行相對熒光定量PCR反應。由圖5可知,隨著時間的推移,復制子EGFP RNA量呈現增長趨勢,轉染24、48、72 h后細胞樣品中EGFP RNA量分別比12 h增長了約2.9倍、5.8倍和9.8倍,表明TMUV RNA復制子ΔCPrME具有自我復制的能力,能夠表達外源基因。

2.4 應用TMUV RNA復制子表達H9亞型禽流感HA基因

Western blotting結果(圖6)顯示,插入HA基因的TMUV RNA復制子轉染細胞72 h后,能夠檢測到HA蛋白的表達,表明構建的TMUV RNA復制子能夠應用于外源蛋白的表達。

3 討論與結論

病毒復制子技術是研究病毒復制和翻譯、抗病毒藥物篩選以及新型疫苗開發的理想工具。研究表明,黃病毒屬病毒作為單鏈正股RNA病毒,在缺失結構蛋白后仍可由自身非結構蛋白完成亞基因組的復制,但復制效率可能與缺失程度相關。因此,本研究以坦布蘇病毒JXSP株感染性克隆為基礎,分別對病毒基因組進行CPrME、CPrM、PrME和PrM等4種方式結構蛋白基因的缺失,成功構建了4種病毒RNA復制子。為檢測復制子的活性和表達外源基因的能力,缺失部位插入綠色熒光蛋白報告基因,并在報告基因序列后面引入口蹄疫病毒2A蛋白基因序列(FMDV 2A),該蛋白具有自剪切功能,可將外源基因有效地分離出來[10]。文獻報道,黃病毒基因組5′UTR下游的C蛋白編碼區存在多個病毒復制和翻譯必需的功能性元件,包括5′AUG下游序列、衣殼蛋白編碼區發卡結構、5′保守序列等[11]。所以為保證復制子的有效復制和翻譯,在構建ΔCPrME和ΔCPrM復制子時,本研究保留了C蛋白氨基端的39個氨基酸編碼序列。在構建ΔCPrME和ΔPrME復制子時,保留了E蛋白羧基端的30個氨基酸編碼序列,以保證NS1蛋白的正確剪切和加工。同時,在構建ΔCPrM、ΔPrME和ΔPrM復制子時,保留了C蛋白和PrM蛋白、PrM蛋白和E蛋白間的信號肽酶裂解位點。

4種病毒RNA復制子活性鑒定結果顯示,ΔCPrME復制子轉染細胞內綠色熒光蛋白信號最強,ΔPrM次之,剩余二者無明顯差異。結果表明,復制子表達外源基因的能力可能與結構蛋白缺失的方式有關。在其他構建的黃病毒復制子中也觀察到了類似的情況[5,7]。但總體看來,4種復制子轉染細胞中陽性信號的細胞比例均不高,可能是因為復制子基因組較長(約10 kb),轉染效率低[12]。因此,如何高效地將RNA復制子遞送進靶細胞是影響復制子表達效率的關鍵因素之一。同時結果發現,轉染細胞胞核內也能觀察到綠色熒光信號,可能是因為分離的綠色熒光蛋白質量較小,能夠穿越進入細胞核。此外,本研究利用構建的TMUV RNA復制子進行了H9亞型禽流感病毒HA基因的表達,表明該復制子具有開發新型疫苗的潛力。

總而言之,本研究利用坦布蘇病毒JXSP株感染性克隆,成功構建了ΔCPrME、ΔCPrM、ΔPrME和ΔPrM等4種病毒RNA復制子,為病毒致病機制的研究提供新的技術手段,也為新型疫苗開發奠定基礎。