1株耐高溫纖維素降解菌發酵條件優化與秸稈降解應用

王永倫, 余克非, 鄭展望

(浙江農林大學環境與資源學院,浙江杭州 310000)

隨著我國農作物種植面積的不斷增加[1],如何對秸稈資源進行高效利用是當前存在的主要問題之一[2]。此前,秸稈的主要利用方式有焚燒和直接還田[3]。焚燒的方法會造成環境污染,不符合生態環保的理念,秸稈直接還田會導致農作物發生病蟲害的風險大大增加[4-5]。利用堆肥降解秸稈具有成本低、操作簡單和適應性廣泛等優勢。因此,利用堆肥降解秸稈被國內外學者廣泛研究[6]。

利用堆肥降解秸稈的關鍵是纖維素降解菌的篩選和應用。但在堆肥的高溫階段具有纖維素降解能力的菌株生長繁殖會受到高溫限制。因此,篩選的菌株必須具有耐高溫能力。另外,高溫纖維素降解菌在降解秸稈的過程中常常出現纖維素酶活性低的情況[7],菌株所產纖維素酶的活性不僅僅與菌株本身性質有關,還受菌株發酵條件(pH值、接種量、碳源、氮源、金屬離子種類與濃度)影響[8],通過優化菌株的固態發酵條件可以有效提高菌株所產的纖維素酶活性[9]。

目前,研究者已對纖維素降解菌的堆肥效果進行了大量評估。董雪麗等將在腐化秸稈中篩選的低溫纖維素降解菌株JiTF01應用于北方低溫環境下的秸稈堆肥(pH值為6.67、接種量2.89%、培養時間12～13 d),發酵21 d后,水稻秸稈的降解率可達45.24%[10]。孟童瑤等將實驗室中的木質素降解菌制成菌劑用于園林廢棄物堆肥,木質素、纖維素降解率分別較未加菌劑的處理提高了23.91%和8.34%[11]。張鵬飛等將園林廢棄物堆肥中篩選的嗜熱脂肪地芽孢桿菌制成菌劑接入園林廢棄物堆肥28 d后,纖維素降解率為28.47%[12]。但以上研究多基于低溫和常溫進行,對于堆肥高溫階段菌株產纖維素酶特性和秸稈降解效果的報道較少。

本試驗在高溫下從小麥秸稈的模擬堆肥中采用剛果紅培養基和高溫篩選的方法選出1株能夠降解纖維素的菌株,對篩選出的纖維素降解菌在60 ℃下產纖維素酶的條件進行優化,用于秸稈降解,并測定堆肥中的秸稈降解率和該菌株數量、pH值、纖維素酶活性的變化,以期為后續高溫纖維素降解菌的研究提供基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

模擬堆肥的小麥秸稈購自河南省鄭州市某農場,樣品購回后放置于浙江農林大學農村環境研究所儲物間干燥環境下通風保存,后續堆肥降解所用小麥秸稈與上述秸稈相同。

1.2 培養基與試劑

LB液體培養基 (1 L)：10 g胰蛋白胨,10 g氯化鈉,5 g酵母粉,去離子水 1 L。

LB固體培養基(1 L)：10 g胰蛋白胨,10 g氯化鈉,5 g酵母粉,20 g 瓊脂,去離子水 1 L。

剛果紅固體培養基(1 L)：10 g羧甲基纖維素鈉,1 g磷酸氫二鉀,0.1 g七水硫酸鎂,0.1 g 硫酸亞鐵,0.5 mg 硫酸錳,10 g 胰蛋白胨,10 g 酵母粉,20 g 瓊脂粉,去離子水1 L。

發酵培養基 (1 L)：15 g羧甲基纖維素鈉,1.4 g硫酸銨,2 g 磷酸氫二鉀,0.5 g七水硫酸鎂,0.3 g 氯化鈣,0.8 mg 五水硫酸銅,0.5 mg硫酸錳,去離子水1 L,pH值=7。

DNS試劑(100 mL)：18.2 g酒石酸鉀鈉,2.1 g氫氧化鈉,0.63 g 3,5-二硝基水楊酸,0.5 g苯酚,0.5 g亞硫酸鈉,去離子水100 mL(避光保存10 d后使用)。

檸檬酸緩沖液(400 mL)(0.05 mol/L,pH值為5)：將118 mL(0.1 mol/L)檸檬酸鈉溶液和82 mL (0.1 mol/L)檸檬酸溶液充分混合,用超純水定容至400 mL。

1%產酶底物(400 mL)：將4 g 羧甲基纖維素(CMC)溶解在400 mL檸檬酸緩沖溶液中(適當加熱以增大CMC的溶解度)。

1.3 菌株的篩選與鑒定

1.3.1 菌株的分離與初篩 本試驗于2022年8—12月在浙江省杭州市臨安區浙江農林大學農村環境研究所微生物實驗室內進行,將小麥秸稈切碎后(1～2 cm)稱取20 g碎末放置于500 mL錐形瓶中,調節其含水率為60%～65%置于60 ℃恒溫培養箱模擬堆肥[13]。第15天取3 g堆肥置于裝有50 mL無菌水的燒杯,在轉速為200 r/min的搖床中搖晃30 min后,取上清液梯度分別稀釋至10-4、10-5、10-6、10-7。吸取50 μL各稀釋液涂布于剛果紅培養基,置于60 ℃恒溫培養箱直至長出清晰菌落,挑取形態不同的菌落劃線培養直至出現單菌落。用 1 mg/mL 的剛果紅溶液和1 mol/L NaCl 溶液分別對剛果紅培養基上的菌株進行染色與脫色各 15 min[14],選擇剛果紅培養基上透明圈較大的菌株進行復篩[15]。

1.3.2 菌株的復篩 將初篩得到具有纖維素降解能力的菌株接種至發酵培養基,并將接種纖維素降解菌的發酵培養基置于60 ℃、180 r/min的恒溫搖床中培養10 d后,測定上述各菌株的纖維素酶活性。選擇纖維素酶活性最高的菌株作為本試驗的目標菌株,每個處理3次重復。

1.3.3 菌株的鑒定 將目標菌株接種在LB固體培養基上,放置在60 ℃恒溫培養箱培養2d后提取該菌株16S rDNA利用27 F/1492 R(27 F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAC-3′;1492 R：5′-CATCGGCTACCTTGTTACGA-3′)對其進行擴增,聚合酶鏈式反應(PCR)片段由有康生物科技有限公司(杭州)進行測序分析,將得到的目標菌株基因序列與基因庫中給出的其他菌株16S rDNA基因序列進行比對,使用MEGA 11軟件的鄰接法(neighbor-joining,簡稱NJ)構建高度相似的目標菌株系統發育樹。

1.4 菌株生長曲線的測定

取目標菌株對數期培養液2 mL接種于200 mL的LB液體培養基中,置于60 ℃、180 r/min的恒溫搖床培養24 h后分別離心取上清液,測定波長 600 nm 處的D值,記錄D600 nm最大時菌株的培養時間,每個處理重復3次。

1.5 酶活定義與粗酶液的制備

纖維素酶活性的定義為1 mL粗酶液在酶解過程中(4 ℃,pH值=5)消耗1 mL的1%產酶底物產生1 μmoL葡萄糖的纖維素酶含量,單位為 U/mL[16]。目標菌株粗酶液的制備：目標菌株的發酵液在4 ℃下、5 000 r/min離心15 min后得到的上清液[17]。

1.6 菌株產酶條件優化

1.6.1 碳源、氮源的種類與濃度對纖維素酶活影響 試驗中選擇4種碳源(淀粉、蛋白胨、羧甲基纖維素鈉、木質素磺酸鈉)和4種氮源(氯化銨、硫酸銨、尿素、酵母粉),設計不同的碳源濃度(10～18 g/L,梯度2 g/L)與氮源濃度(1～1.8 g/L,梯度0.2 g/L),按最適培養時間培養(“1.4”節得出),測定不同種類碳源與氮源及其不同濃度下目標菌株的纖維素酶活,并記錄目標菌株纖維素酶活最大時碳源與氮源的種類及濃度。

1.6.2 金屬離子對纖維素酶活的影響 試驗選擇的金屬離子[18]為K+、Co2+、Mg2+、Ca2+,各金屬離子均設置3個濃度分別為0.08、0.10、0.12 μmol/L,設計4因素3水平正交試驗如表1所示。在確定目標菌株液體培養基中最適碳源、氮源種類與濃度后(由“1.6.1”節得出)向各組目標菌株的液體培養基中添加表1所列的各組金屬離子組合,按最適培養時間培養(由“1.4”節得出),測定各組液體培養基中目標菌株的纖維素酶活并記錄纖維素酶活最大時該組合中各金屬離子的種類和濃度。

表1 金屬離子的種類與濃度正交實驗設計

1.6.3 pH值、接種量、培養時間 確定目標菌株培養基中最適的碳源、氮源、金屬離子的種類與濃度(由“1.6.1”“1.6.2”節得出)后,使用單因素試驗對目標菌株的發酵條件(接種量、pH值、培養時間)進行優化。優化的初始條件設置為接種量3%、pH值為7、培養時間6 d,每次試驗只改變接種量、pH值、培養時間中的1個因素。設置接種量的范圍為1%～10%、pH值的范圍4～10、培養時間的范圍 1～9 d,測定目標菌株在不同條件下的纖維素酶活性。上述試驗中,用于接種的LB液體培養基中菌株數量為0.5×107CFU/mL (XmL發酵培養基接種含有上述菌株數量的LB液體培養基的體積為X% mL)。

1.7 纖維素酶的性質探究

1.7.1 酶促反應pH值對纖維素酶影響 將1 mL目標菌株的粗酶液分別加入到pH值為1、2、3、4、5、6、7的1%產酶底物中,置于50 ℃水浴鍋中水浴 30 min,測定在不同pH值的1%產酶底物中目標菌株的纖維素酶活,并記錄纖維素酶活的最大值以及此時1%產酶底物的pH值,試驗重復3次,纖維素酶活取平均值。

1.7.2 pH值對纖維素酶穩定性影響 將1 mL目標菌株的粗酶液分別加入到pH值為1、2、3、4、5、6、7的檸檬酸緩沖液中保存3 h后,測定目標菌株的粗酶液在不同pH值檸檬酸緩沖液中的纖維素酶活性,并記錄纖維素酶活的最大值以及此時檸檬酸緩沖液的pH值,試驗重復3次,纖維素酶活取平均值。

1.8 秸稈降解過程探究

1.8.1 秸稈堆肥與降解率測定 為研究目標菌株對秸稈的降解效果,將該菌株按最適條件培養(由“1.6.1”“1.6.2”“1.6.3”節得出)最適時間(由“1.6.3”節得出)后,按最適比例(由“1.6.3”節得出)接種在以100 g小麥秸稈為唯一碳源的發酵培養基中,測定預處理(使用去離子水浸泡沖洗后干燥后放入高速攪拌機磨碎,過40目的網篩,在 121 ℃、121 kPa下滅菌30 min)小麥秸稈的降解率。每6 d取5 g秸稈堆肥樣品測定樣品中秸稈降解率和目標菌株的纖維素酶活性,樣品測定前的處理方式為將樣品采用無菌水進行沖洗后放入110 ℃的恒溫烘箱中進行干燥,并記錄其質量。小麥秸稈的降解率計算方法如下：A=(B-C)/B×100%,其中B為添加預處理秸稈的質量,C是烘干后樣品的質量,A為降解率。試驗重復3次,秸稈的降解率取3次試驗測定的平均值。

1.8.2 樣品pH值測定 取0.1 g堆肥樣品加入裝有10 mL無菌水的燒杯中,放入60 ℃、180 r/min的恒溫搖床中搖晃30 min,使用pH計對不同樣品的pH值進行測定,記錄不同樣品中的pH值。試驗重復3次,pH值取平均值。

1.8.3 微生物數量統計 取0.1 g堆肥樣品加入裝有10 mL無菌水的燒杯中,放入60 ℃、180 r/min的恒溫搖床中搖晃30 min,稀釋涂布于LB固體培養基,將其置于溫度為60 ℃的恒溫培養箱中按最適培養時間(由“1.4”節得出)培養,利用活菌計數法對樣品中的微生物數量進行統計,記錄不同樣品中的菌株數量。

1.9 數據分析

本研究采用SPSS 22.0軟件進行顯著性分析,多重比較方法為Duncan’s法,目標菌株鄰接樹使用MEGA 11進行構建,采用Origin 2019進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 菌株的篩選

在小麥秸稈的模擬堆肥中,共篩到具有纖維素降解能力的菌株16株。剛果紅溶液染色和氯化鈉溶液脫色后透明圈較為明顯的菌株有5株,分別將這5株纖維素降解菌順序編號為01、02、03、04、05。這5株纖維素降解菌在60 ℃下纖維素酶活性、透明圈直徑,透明圈直徑與菌落直徑的比值如表2所示,在5株菌中,菌株01、02、04、05的纖維素酶活較低而菌株03的纖維素酶活最高,為15.71 U/mL。因此,選定菌株03作為本試驗的目標菌株。

表2 耐高溫纖維素降解菌篩選結果

2.2 菌株03的鑒定

由圖1可見,菌株03在剛果紅培養基上的菌斑為圓形,菌斑的中間有白色孢子向四周發散與周圍的白色菌絲連接,根據《中國真菌志》初步鑒定其為芽孢桿菌[19],根據分子生物學的鑒定結果建立該菌株的系統發育樹如圖2所示,菌株03與枯草芽孢桿菌屬的菌株16S rDNA序列之間具有高達90%的相似性,所以菌株03被認為是一株枯草芽孢桿菌,故將其命名為Bacillussubtilis03,該菌株的基因序列已提交至美國國家生物技術信息中心(NCBI)并申請登錄號為SUB12359776。

2.3 菌株Bacillus subtilis 03的生長曲線

由圖3可見,菌株在0～6 h內生長速度較慢,此時菌株處于環境適應期[20]。在6～12 h時,菌株處于對數生長期。菌株在LB液體培養基中培養 12 h 后,D600 nm達到最高,為1.273,隨后菌株數量逐漸趨于穩定。與大多數纖維素降解菌[21-22]相比,菌株Bacillussubtilis03所需生長時間較短,具有快速繁殖的能力。

2.4 菌株Bacillus subtilis 03產酶條件優化結果

2.4.1 最適碳源、氮源的種類與濃度 由圖4-A可見,菌株Bacillussubtilis03在不同碳源中均可以產生纖維素酶,其中以羧甲基纖維素鈉為唯一碳源時,該菌株的纖維素酶活最高。菌株在發酵培養基中最適碳源種類的順序為羧甲基纖維素鈉>淀粉>蛋白胨>木質素磺酸鈉,由圖4-B可見,當羧甲基纖維素鈉的濃度為14 g/L時,菌株Bacillussubtilis03的纖維素酶活為18.14 U/mL。由圖4-C可見,在唯一氮源的發酵培養基中菌株Bacillussubtilis03的最適氮源順序為硫酸銨>酵母粉>氯化銨>尿素,由圖4-D可見,當硫酸銨濃度為 1.4 g/L 時,該菌株的纖維素酶活為18.88 U/mL。

2.4.2 金屬離子組合選定 由表3可見,與CK組相比,處理1和處理3的纖維素酶活性提升并不顯著,這是因為金屬離子的種類與濃度會影響菌株纖維素酶的合成[23];其他處理菌株Bacillussubtilis03的纖維素酶活均有顯著提升,其中處理6的纖維素酶活最高,為(23.84±1.22) U/mL。綜上所述,添加處理6中的金屬離子組合(Co2+濃度為 0.12 μmol/L,Mg2+濃度為0.12 μmol/L,Ca2+濃度為0.12 μmol/L),有利于菌株Bacillussubtilis03纖維素酶活性的提升。

表3 不同種類與濃度的金屬離子對菌株纖維素酶活性的影響

2.4.3 接種量、pH值、培養時間對纖維素酶活性的影響 由圖5-A可見,當接種量為1%～10%時,菌株的纖維素酶活性均處于較高水平。接種量為4%時,該菌株的纖維素酶活性最高,為25.15 U/mL。因此,菌株Bacillussubtilis03的最適接種量為4%。

由圖5-B可見, 當pH值為4時, 纖維素酶活性最低,pH值為7時菌株酶活性最高。當pH值為8時,菌株的纖維素酶活性下降速度較為緩慢。同時菌株在pH值為7～10時,纖維素酶活性的范圍為 20.01～27.55 U/mL。當pH值為10時,菌株的纖維素酶活性可以保持最適pH值(pH值=7)時纖維素酶活的72.63%。結果表明,菌株Bacillussubtilis03在堿性條件下具有較高的纖維素降解能力。

由圖5-C可見,菌株Bacillussubtilis03在發酵的前4 d纖維素酶活性均處于較低水平。當發酵至 5 d 時,菌株的纖維素酶活性快速增高,在8 d時纖維素酶活性達到最高,為29.34 U/mL。該菌株發酵8 d時纖維素酶活性最高,證明其具有長時間產纖維素酶的能力,這對菌株Bacillussubtilis03在高溫下對秸稈進行持續降解具有重要意義。

2.5 不同pH值下菌株纖維素酶的特性

本試驗發現菌株Bacillussubtilis03在堿性環境下仍能保持較高的纖維素酶活性(“2.4.3”節),為進一步研究菌株在堿性環境下所產纖維素酶的特性,取該菌株的粗酶液在不同pH值下對該菌株的酶促反應活性進行研究。由圖6可見,在pH值為7時酶促反應的活性和穩定性均為最大,在pH值為10時菌株Bacillussubtilis03的酶促反應活性和穩定性仍可以保持pH值為7時的73.28%、68.14%。

2.6 秸稈堆肥中pH值與微生物數量變化

2.6.1 堆肥pH值的變化 由圖7可見,0～6 d時,菌株Bacillussubtilis03的數量較少,對秸稈的降解能力弱,產生的腐殖酸較少,此時pH值下降的主要原因是菌株大量繁殖產生的CO2使堆肥的pH值下降。6～12 d時,菌株進入對數生長期,此時pH值下降的主要原因是菌株大量分解秸稈中的纖維素產生腐殖酸導致堆肥pH值快速下降。12～18 d時,堆肥pH值下降的速率與堆肥升溫階段相比并未降低, 這顯示了菌株可以有效克服高溫脅迫持續對秸稈進行降解生成腐殖酸。在18～24 d時菌株產生的少量氨類物質使pH值開始有所升高。24～36 d時堆肥開始進入降溫階段,此時秸稈被大量分解, 堆肥中的纖維素含量降低,菌株Bacillussubtilis03不得不分解部分富里酸提供營養物質,此時堆肥的pH值開始持續升高。由堆肥中pH值的變化可知,菌株Bacillussubtilis03在降解秸稈中纖維素時,不僅可以產生腐殖酸還可以生成部分氨類物質,這對于秸稈資源化利用具有重要意義。

2.6.2 堆肥中微生物的數量變化 由圖8可見,在0～6 d時菌株處于環境適應期,繁殖速度較低。在 6～12 d時進入對數生長期后菌株數量大幅度提升。12 d時菌株的數量達到1×108CFU/mL。在12～24 d時堆肥進入高溫階段,菌株的數量略有減少,但仍處于較高水平,表明菌株具有耐高溫的特性。在24～36 d時堆肥進入降溫階段,此時秸稈中纖維素被大量降解,菌株不得不分解部分腐殖酸提供營養,這導致了堆肥中菌株數量下降。堆肥中微生物的數量變化顯示,堆肥進入高溫階段后,堆肥中菌株的數量約為菌株數量最高值的87.5%,仍處于較高水平,這對于菌株持續降解秸稈具有重要意義。

2.6.3 秸稈降解率與纖維素酶活變化 由圖9可見,堆肥6 d時,秸稈的降解率為5.18%,纖維素酶活性為7.26 U/mL。堆肥12 d時,秸稈的降解率為19.15%,纖維素酶活性為33.15 U/mL。堆肥12 d后,菌株的纖維素酶活性開始下降,但秸稈降解率卻持續增加。在堆肥30～36 d時,秸稈的降解率分別為32.67%和32.72%。

3 討論

本試驗在60 ℃時分離出1株能在高溫下降解纖維素的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis03),通過單因素試驗與正交試驗設計對其產酶條件進行優化,有效提升了菌株Bacillussubtilis03的纖維素酶活。另外,研究發現菌株Bacillussubtilis03在堿性環境下仍具有較高的纖維素酶活。當pH值為10時,菌株的纖維素酶促反應活性和纖維素酶穩定性可以保留最適pH值(pH值=7)的73.28%、68.14%,目前大多數纖維素降解菌適應酸性和堿性的范圍較窄,菌株在pH值為10時具有較高的纖維素酶活擴大了其應用范圍。目前有研究顯示,在堿性環境下秸稈中的氫鍵分解速度加快,木質素和纖維素的溶解性也會有適度的增加;由于秸稈生物發酵受到pH值的影響,堿性處理后的秸稈往往需要中和至一定范圍的pH值后才能進行生物發酵[24]。由于該菌株具有耐堿性特征,堿性處理后的秸稈可以直接用于微生物降解,這會減少秸稈處理過程的成本,但目前關于具有在堿性條件下降解纖維素能力的菌株鮮有報道。

耐高溫纖維素降解菌對克服秸稈堆肥高溫階段存在的秸稈降解率低的問題具有重要意義,郜道玉等在牛糞中篩選的3株嗜熱鏈霉菌和地衣芽孢桿菌在50 ℃下,菌株的纖維素酶活為104.32～168.92 U/mL,表明該菌株具有較高的纖維素降解潛力[25]。易旻等在雞糞蘑菇渣堆肥中篩選的解淀粉芽孢桿菌在產酶條件優化后,菌株的纖維素酶活為6.14 U/mL[26]。張秧等將從小麥秸稈中篩選的3株纖維素降解菌接入小麥秸稈堆肥中,堆肥的高溫期溫度峰值分別為58.2、54.7、53.7 ℃,秸稈堆肥高溫階段分別維持了9、6、6 d,秸稈降解率達到分別為18.87%、24.48%、22.08%[27]。

此外,劉心吾等在土壤中篩選的耐高溫纖維素降解菌,其分離的菌株在60 ℃下接種在秸稈堆肥中20 d后,纖維素的降解率為20.47%[28]。而本研究在堆肥18 d時秸稈的降解率為25.71%,說明菌株Bacillussubtilis03能更高效地在高溫環境下降解秸稈。

4 結論

為解決秸稈堆肥高溫階段微生物大量死亡,導致秸稈降解率低的問題。本研究在小麥秸稈的模擬堆肥中篩選出1株耐高溫纖維素降解菌Bacillussubtilis03。通過單因素試驗和正交試驗對該菌株產酶條件進行優化。結果顯示：培養時間為12 h,羧甲基纖維素鈉的濃度為14 g/L,硫酸銨濃度為 1.4 g/L,接種量為4%,pH值為7,發酵周期8 d,K+濃度為0.08 μmol/L,Co2+濃度為0.12 μmol/L,Mg2+濃度為0.12 μmol/L,Ca2+的濃度為 0.12 μmol/L 時,該菌株的纖維素酶活最高,為 29.34 U/mL。菌株Bacillussubtilis03在堿性環境中具有良好的酶促反應活性和纖維素酶穩定性,在 pH值為10時該菌株的纖維素酶活和纖維素酶穩定性可以保留最適pH值(pH=7)的73.28%、68.14%,在一定程度上擴大了其應用范圍。堆肥中pH值的變化,反映出秸稈中纖維素降解后產生了大量的腐殖酸,這顯示出該菌株對秸稈的強降解能力。堆肥高溫階段該菌株的數量約為升溫階段末期的87.5%,證明該菌株具有耐高溫能力。菌株Bacillussubtilis03前期對秸稈的降解速率較快,但隨著纖維素酶活的降低和秸稈堆肥中纖維素含量的減少,導致秸稈降解速率逐漸下降,在36 d 時堆肥中秸稈的降解率達到了32.72%。研究結果為秸稈降解提供了理論依據和實踐基礎,對解決農業生產過程存在的秸稈廢棄物產量大、處理難的問題具有重要意義。