長鏈非編碼RNA NEAT1、miRNA-182-5p 與2 型糖尿病合并代謝性脂肪性肝病患者肝纖維化風險的相關性研究

賀佳，李永平，魏楓*，劉美嵐，吳亞玲，韶龍格

1.014010 內蒙古自治區包頭市，內蒙古科技大學包頭醫學院第一附屬醫院

2.014010 內蒙古自治區包頭市衛生健康委員會綜合保障中心

2 型糖尿病（T2DM）是常見的慢性代謝性疾病，其發病機制復雜多樣，可歸結為胰島素抵抗（insulin resistance，IR）及胰島功能衰竭［1］，兩者共同影響糖尿病發展的全過程。流行病學調查研究顯示，預計到2030 年全球糖尿病患病人數將達到6.43 億（11.3%），2045 年將增至7.84 億（12.2%）［2］。T2DM 常合并代謝相關脂肪性肝病（MAFLD），MAFLD 由非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD）更名而來，2020 年22 個國際專家小組認為MAFLD 相較于NAFLD 更加適合描述與內分泌代謝功能障礙相關的肝臟疾病［3］。約55.5%的T2DM 患者合并MAFLD，且發生肝纖維化的概率為17.0%［4］，兩者共存不僅增加了肝硬化和肝細胞癌的發生，同時也增加了糖尿病腎病及心腦血管系統并發癥的風險，嚴重威脅人類健康。

T2DM 合并MAFLD 的發病機制錯綜復雜，近年來非編碼RNA 成為這一研究熱點。其中長鏈非編碼RNA核富集轉錄體1（long non-coding RNA-nuclear enriched abundant transcript 1，lncRNA NEAT1）異常表達與胚胎發育、細胞增殖分化、脂肪變性、氧化應激、內質網應激等生理病理進程密切相關［5］。有研究顯示，lncRNA NEAT1 可參與胰島素的合成、分泌及敏感性的調控［6］。

微小RNA（microRNA，miRNA）也是非編碼RNA的一種，其中miRNA-182-5p 目前已被證明在T2DM 及其并發癥的調節途徑中發揮作用，并可通過調控不同信號通路來調節IR［7］。目前lncRNA NEAT1 與miRNA-182-5p 在T2DM 合并MAFLD 的研究中較少，本研究通過比較不同患者外周血中lncRNA NEAT1、miRNA-182-5p 的表達情況，分析其與肝纖維化的相關性，為臨床早期診斷及防治疾病提供新的方向。

1 對象與方法

1.1 研究對象

納入2021 年10 月—2022 年6 月在內蒙古科技大學包頭醫學院第一附屬醫院內分泌科就診并入組國家標準化代謝性疾病管理中心（MMC）的T2DM 患者236例為研究對象，同時納入在內蒙古科技大學包頭醫學院第一附屬醫院體檢的49 名健康志愿者為健康對照組。納入標準：（1）T2DM 診斷符合《中國2 型糖尿病防治指南（2020 年版）》［8-9］；（2）MAFLD 診斷符合《代謝功能障礙相關脂肪肝的新定義：國際專家共識聲明》［3］；（3）年齡18～80 周歲。排除標準：（1）其他類型糖尿病及糖尿病急性并發癥患者；（2）感染性疾病、免疫性疾病及腫瘤患者；（3）嚴重肝、腎功能不全患者；（4）近期服用影響肝功能藥物的患者。本研究已通過內蒙古科技大學包頭醫學院第一附屬醫院醫學倫理委員會審批（審批號：2023011），入組患者均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 一般資料收集：記錄研究對象的年齡、性別、T2DM 病程，吸煙史（定義為吸煙≥1 支/d，連續吸煙＞1 年［10］）、飲酒史［定義為平均飲白酒（酒精含量＞50%）≥100 mL/d，持續1 年以上［10］］等指標。測量身高、體質量、頸圍（NC）、腰圍（WC），計算BMI。

1.2.2 實驗室指標檢測：研究對象均測定血小板計數（PLT）、空腹血糖（FPG）、糖化血紅蛋白（HbA1c）、丙氨酸氨基轉移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉移酶（AST）、白蛋白（Alb）、三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、血尿酸（SUA）、空腹C 肽，計算改良穩態模型評估胰島素抵抗指數（HOMA-IR），HOMA-IR=1.5+FPG（mmol/L）×空腹C 肽（pmol/L）/2 800。

1.2.3 內臟脂肪面積（VFA）、 皮下脂肪面積（SFA） 的測定： 采用生物電阻抗法（ 歐姆龍DUALSCANHDS-2000）測量VFA、SFA，單位以cm2表示。

1.2.4 lncRNA NEAT1、miRNA-182-5p 的測定：采集研究對象外周血2 mL，首先用人淋巴細胞分離液提取單核細胞，后采用Trizol 法提取總RNA，采用實時熒光定量PCR（qRT-PCR）法檢測lncRNA NEAT1、miRNA-182-5p 相對表達量，lncRNA NEAT1 以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）作為內參，依照試劑盒（天根生化科技有限公司，貨號：FP402-02）說明書進行檢測，miRNA-182-5p 以U6 作為內參，依照試劑盒（諾唯贊，貨號：MQ101-02）說明書進行檢測。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.5 分組：將T2DM 患者依據《代謝功能障礙相關脂肪肝的新定義：國際專家共識聲明》［3］分為T2DM 合并非MAFLD組（n=82）與T2DM合并MAFLD組（n=154）。進一步根據肝纖維化指數（FIB-4）：FIB-4=（年齡×AST）/（PLT×ALT1/2）［11］，將T2DM 合并MAFLD 組分為肝纖維化低危亞組（FIB-4＜1.30 或年齡≥65 歲、FIB-4＜2.00，n=55），肝纖維化中危亞組（1.30 ≤FIB-4 ≤2.67或年齡≥65 歲、2.00 ≤FIB-4 ≤2.67，n=69），肝纖維化高危亞組（FIB-4＞2.67，n=30）。

1.3 統計學方法

采用SPSS 26.0 統計學軟件進行數據分析。采用Kolmogorov-Smirnov 檢驗分析數據是否符合正態分布，符合正態分布的計量資料采用（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗；不符合正態分布的計量資料以M（P25，P75）表示，多組間比較用Kruskal-Wallis H 檢驗，組間兩兩比較采用Mann-Whitney U 檢驗。計數資料以相對數表示，組間比較采用χ2檢驗。采用Spearman 秩相關分析探究肝纖維化高危亞組lncRNA NEAT1、miRNA-182-5p 表達水平的相關性，采用多因素有序Logistic 回歸分析探究T2DM 合并MAFLD 患者肝纖維化風險的影響因素。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 T2DM合并非MAFLD組、T2DM合并MAFLD組、健康對照組一般資料及實驗室檢測指標比較

3 組研究對象年齡、BMI、NC、WC、VFA、SFA、FPG、HbA1c、HOMA-IR、PLT、ALT、AST、Alb、TG、TC、SUA、lncRNA NEAT1、miRNA-182-5p 比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。組間比較結果顯示，健康對照組年齡、NC、FPG、HbA1c低于T2DM 合并MAFLD 組、T2DM 合并非MAFLD 組，Alb 高于T2DM合并MAFLD 組、T2DM 合并非MAFLD 組，差異有統計學意義（P＜0.05）；T2DM 合并MAFLD 組BMI、WC、VFA、SFA、HOMA-IR、TG、SUA、lncRNA NEAT1 高于健康對照組、T2DM 合并非MAFLD 組，PLT 低于健康對照組、T2DM 合并非MAFLD 組，TC 低于健康對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；T2DM 合并非MAFLD 組HOMA-IR、lncRNA NEAT1 高于健康對照組，miRNA-182-5p 高于健康對照組、T2DM 合并MAFLD組，ALT、AST 低于健康對照組、T2DM 合并MAFLD組，差異有統計學意義（P＜0.05）。3 組研究對象性別、T2DM 病程、吸煙史、飲酒史比例比較，差異無統計學意義（P＜0.05），見表2。

2.2 肝纖維化低危亞組、肝纖維化中危亞組、肝纖維化高危亞組一般資料及實驗室檢測指標比較

3 組研究對象性別、BMI、NC、WC、VFA、SFA、PLT、AST、TC、lncRNA NEAT1、miRNA-182-5p 比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。組內比較結果顯示，肝纖維化低危亞組VFA、SFA、AST、lncRNA NEAT1低于肝纖維化中危亞組、肝纖維化高危亞組，PLT、miRNA-182-5p 高于肝纖維化中危亞組、肝纖維化高危亞組，BMI、WC、NC 低于肝纖維化高危亞組，TC 高于肝纖維化高危亞組，差異有統計學意義（P＜0.05）；肝纖維化中危亞組PLT、miRNA-182-5p 高于肝纖維化高危亞組，AST、lncRNA NEAT1 低于肝纖維化高危亞組，差異有統計學意義（P＜0.05）。3 組患者年齡、T2DM病程、吸煙史、飲酒史、FPG、HbA1c、HOMA-IR、ALT、Alb、TG、SUA 比較，差異無統計學意義（P＞0.05），見表3。

表3 肝纖維化低危亞組、肝纖維化中危亞組、肝纖維化高危亞組一般資料及實驗室檢測指標比較Table 3 Comparison of general information and laboratory indicators among the low-risk subgroup，medium-risk subgroup and high-risk subgroup of liver fibrosis

2.3 肝纖維化高危亞組患者lncRNA NEAT1、miRNA-182-5p 的相關性分析

Spearman 秩相關分析結果顯示，肝纖維化高危亞組患者lncRNA NEAT1 與miRNA-182-5p 呈負相關（rs=-0.438，P＜0.05）。

2.4 肝纖維化發生風險影響因素的多因素有序Logistic回歸分析

以T2DM 合并MAFLD 患者肝纖維化危險程度為因變量（賦值：肝纖維化低危亞組=1，肝纖維化中危亞組=2，肝纖維化高危亞組=3），以性別（賦值：男=1，女=2）、lncRNA NEAT1、miR-182-5p、BMI、NC、WC、VFA、SFA、AST、PLT、TC（賦值均為實測值）為自變量進行多因素有序Logistic 回歸分析，結果顯示lncRNA NEAT1、VFA、miRNA-182-5p、PLT、AST 是T2DM 合并MAFLD 患者肝纖維化發生風險的影響因素（P＜0.05），見表4。

表4 肝纖維化風險影響因素的多因素有序Logistic 回歸分析結果Table 4 Multilevel ordinal Logistic regression analysis of risk factors for liver fibrosis

3 討論

目前MAFLD 已經取代慢性肝炎成為全球最常見的慢性肝臟疾病［12］，最被人們接受并承認的發病機制是多重打擊學說，即不良的飲食習慣、不佳的生活方式以及環境和遺傳等因素導致了IR、肥胖、代謝紊亂、氧化應激、線粒體功能障礙，其共同作用導致了肝細胞損傷和纖維化，甚至可以進展為肝硬化。所以早期監測、識別肝纖維化危險程度對患者預后具有重要意義。目前肝纖維化的診斷金標準仍然是肝穿刺，但因其為有創檢查，故國際上多采用FIB-4 評估肝臟纖維化程度［11］。

本研究發現T2DM 合并MAFLD 組患者BMI、WC、VFA、SFA、TG 顯著升高，提示T2DM 合并MAFLD 組患者的脂肪蓄積、代謝異常更為嚴重，認為體質量增加及腹型肥胖可能增加單純T2DM 人群患MAFLD 的風險。在T2DM 合并MAFLD 中發現與肝纖維化低危亞組相比，肝纖維化高危亞組患者AST、VFA、SFA、BMI、NC、WC 顯著升高，同時多因素有序Logistic 回歸分析發現，VFA 是T2DM 合并MAFLD 患者肝纖維化風險的影響因素，VFA 水平越高，發生肝纖維化的風險越高。YU 等［12］發現VFA 的增加與NAFLD 及肝纖維化獨立相關，提示VFA 可能是MAFLD 患者生活方式改變的中心目標。內臟脂肪組織（VAT）導致病理變化的可能機制是：VFA與其獨特的生理位置以及酯酶活性增強有關，從而使血液中游離脂肪酸（FFA）顯著升高，并通過門脈系統直接進入肝臟，高濃度的FFA 儲存在肝臟脂肪細胞，最終導致IR 和糖脂代謝紊亂的加重，其次VAT 蓄積導致肝臟脂肪變性，并可能通過脂質重配、線粒體失調、產生活性氧、脂質過氧化、內質網應激等病理生理機制引發炎癥，最終由NAFLD 進展為肝纖維化［13-14］。另外一項國外的隊列研究發現，NC 與血糖異常和代謝綜合征標志物相關，且NC 可以在識別糖尿病前期或糖尿病患者中發揮作用，可預測MAFLD 的發生風險［15］，但本研究結果不支持NC 與肝纖維化之間的關聯。本研究多因素有序Logistic 回歸分析結果表明，NC 不是T2DM合并肝纖維化風險的影響因素，與既往研究一致。本研究還發現PLT 下降是T2DM 合并發生肝纖維化的獨立危險因素，韓孟冉等［16］研究發現，肝纖維化患者PLT/白細胞計數顯著下降，并且PLT/白細胞計數是預測肝纖維化的獨立危險因素，本研究結果與之一致。LIU 等［17］認為，肝臟可以產生血小板生成素（TPO），在MAFLD 病理過程中，線粒體功能發生損害，可以影響TPO 合成，從而導致PLT 降低。此外，國外學者認為IR 本身不引起PLT 降低，但是當MAFLD 存在時，IR 可能會引發PLT 降低，同時發現PLT 的降低程度與肝組織的脂肪浸潤程度有關［18］，本研究結果與之一致。

研究顯示lncRNA NEAT1 在脂肪代謝中起著重要調控作用［19］。lncRNA NEAT1 在MAFLD 大鼠肝臟組織中呈高度表達，且lncRNA NEAT1 下調后可以通過哺乳動物雷帕霉素靶蛋白mTOR 及其下游調控蛋白核糖體S6 蛋白激酶（s6k1）信號通路來調節脂質合成緩解MAFLD［20］。還有研究發現miRNA-140 和lncRNA NEAT1 相互作用可增強lncRNA NEAT1 的表達以及穩定性，SUN 等［21］發現lncRNA NEAT1 可以與miRNA-140競爭性結合，并通過調節腺苷酸激活蛋白激酶/固醇調節元件結合蛋白（AMPK/SREBP-1）信號通路影響MAFLD 的進展，同時lncRNA NEAT1 也可以通過靶向調控Rho 相關卷曲螺旋形成蛋白激酶1（ROCK1）的miRNA-146a-5p 并進一步影響AMPK/SREBP 通路，最終增加脂肪變性，加重MAFLD 的進展［22］。

本研究發現，T2DM 合并MAFLD 患者外周血中lncRNA NEAT1 的表達顯著升高，且相較于肝纖維化低危亞組與中危亞組患者，肝纖維化高危亞組lncRNA NEAT1 表達明顯升高，多因素有序Logistic 回歸分析發現lncRNA NEAT1 是T2DM 合并MAFLD 患者發生肝纖維化的危險因素。有學者通過體外實驗證實lncRNA NEAT1 可通過與miRNA-506 競爭性結合膠質瘤相關腫瘤基因同源3（GLI3）來調節肝纖維化、炎癥反應及脂質代謝［23］。故本研究認為外周血中lncRNA NEAT1 的相對表達量與進展肝纖維化有一定關系。

近年來有學者認為miRNA 在糖脂代謝疾病中起重要作用，其中miRNA-182-5p 已被證實可以影響IR 及脂質代謝［24］。本研究發現，T2DM 合并非MAFLD 組患者miRNA-182-5p 顯著高于T2DM 合并MAFLD 組，這與WEALE 等［25］的研究一致，該研究納入了1 270例受試者，發現T2DM 及糖尿病前期患者中miRNA-182-5p 顯著升高。而KAROLINA 等［26］發現miRNA-182-5p 在T2DM 中表達下調，在FPG 受損的受試者中表達輕微上調，認為miRNA-182-5p 通過靶向調控叉頭盒蛋白O1（FOXO1）來促進葡萄糖生成，在介導肝臟IR 信號傳導效應中發揮關鍵作用。本研究通過分析肝纖維化低危亞組、中危亞組、高危亞組miRNA-182-5p 的表達情況，發現肝纖維化高危亞組miRNA-182-5p 顯著下降。有學者發現miRNA-182-5p 在肥胖大鼠和人類VAT 中顯著降低，認為其是脂肪形成的新型負調節劑［27］。日本血吸蟲誘導的肝纖維化的相關研究中發現miRNA-182 呈高表達，FOXO1 低表達，兩者可促進肝纖維化細胞的增殖和抑制細胞凋亡［28-29］。但miRNA-182 與T2DM 合并MAFLD 患者發生肝纖維化風險的關系仍需進一步探究。

研究發現，用脂多糖（LPS）誘導急性肺損傷小鼠和細胞模型中lncRNA NEAT1 水平升高，且lncRNA NEAT1 可以通過與miRNA-182-5p 結合調控WNT1 誘導信號通路蛋白1（WISP1）的表達，lncRNA NEAT1過表達，可以通過miRNA-182-5p/WISP1 軸抑制LPS暴露的肺泡巨噬細胞的活力，進而促進細胞凋亡和炎癥［30］，而lncRNA NEAT1 與miRNA-182-5p 在肝纖維化中的關系尚不清楚。本研究Spearman 秩相關分析結果發現在肝纖維化高危亞組患者中lncRNA NEAT1 與miRNA-182-5p 呈負相關，因未進行動物細胞實驗，故初步認為lncRNA NEAT1、miRNA-182-5p 在T2DM 合并MAFLD 患者肝纖維化的發生和發展中起一定作用，但具體機制仍需進一步驗證。

本研究存在以下局限性：許多降糖藥對MAFLD 及肝纖維化有一定作用，影響復雜，分析較為困難，故本研究未分析降糖藥物對疾病的影響；此外，本研究采用FIB-4 評估研究對象的肝纖維化情況，未經病理驗證，故可能存在誤差。

綜上所述，lncRNA NEAT1 及miRNA-182-5p 可能在T2DM 合并MAFLD 患者及肝纖維化患者中起重要作用，提示高lncRNA NEAT1、高VFA、低miRNA-182-5p、低PLT 可能是患者肝纖維化風險的獨立危險因素。本研究為進一步明確外周血中lncRNA NEAT1、miRNA-182-5p 對肝纖維化的作用機制提供了新的思路，同時為T2DM 合并MAFLD 患者發生肝纖維化的預防提供了新的方向。

作者貢獻：賀佳、魏楓負責研究的構思及設計；賀佳、李永平負責研究的實施，論文的撰寫及修訂；劉美嵐、吳亞玲、韶龍格負責數據的收集及整理；賀佳、劉美嵐負責統計學處理及繪制圖表；魏楓負責文章的質量控制，對文章整體負責，監督管理。

本文無利益沖突。