四妙湯對類風濕關節炎大鼠維生素D 系統及中性粒細胞胞外誘捕網的影響研究

羅書曼，朱星，陳帥，李文，董右青，何昌祿，周艷，陳云志*

1.550025 貴州省貴陽市，貴州中醫藥大學

2.554300 貴州省銅仁市德江縣民族中醫院推拿科

類風濕關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種慢性、系統性的自身免疫性疾病，主要病理特征為持續性滑膜炎和滑膜增生。目前全球RA 患病率約為1%［1］。RA 致死率不高，但有較高致殘率，對患者身體功能及生活質量影響較大，有“不死癌癥”之稱。RA 患者發生心血管疾病等并發癥的概率遠高于普通人，增加了患者因心血管疾病死亡的風險，而糖皮質激素作為RA 常用治療藥物，在臨床使用時增加了RA 合并心血管疾病患者的死亡率［2］。因此尋找低毒高效的RA 治療藥物是目前公共衛生系統的共同挑戰。流行病學數據顯示，維生素D（VD）缺乏與自身免疫性疾病有關，其中血清25-羥基維生素D3［25（OH）D3］水平與RA 發病率和疾病活動之間存在負相關［3］。動物實驗研究表明，VD 可緩解RA 小鼠模型的關節炎癥狀，降低關節炎評分［4］。臨床研究表明，使用VD 補充劑可降低RA 發展風險［5］。VD、維生素D 受體（VDR）及相關代謝酶共同組成維生素D 系統，維生素D 系統通過多種途徑參與免疫調節，其中通過抑制樹突狀細胞、T 細胞、B 細胞的免疫反應導致腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白介素6（IL-6）等細胞因子產生減少，抑制RA 的發生、發展［6］。中性粒細胞胞外誘捕網（NETs）是中性粒細胞受到刺激形成的以DNA 為骨架的網狀結構［7］，其形成過程被稱為中性粒細胞胞外誘捕網凋零（NETosis）。NETs 的過度表達在RA 病理過程中發揮重要作用，促進抗瓜氨酸化抗體（ACPA）的產生，加重RA 進程［8］。研究表明，VD 可通過降低NETs 標志物髓過氧化物酶（MPO）活性，抑制NETs 形成［9］；活性形式的VD，即1，25-二羥基維生素D［1，25（OH）2D3］可降低NETosis 活性，抑制NETs 形成［10］。

中醫將RA 歸屬“痹證”范疇［11］。“痹”者，“閉”也，血氣凝滯不通也［12］。氣血運行不暢在痹證的發病過程中起關鍵作用，調暢氣機、活血通絡開痹是治療重點。四妙湯見于清·蔣示吉《醫宗說約》，是由兩個藥對組成的藥少力專的方劑，黃芪和當歸組成當歸補血湯，補氣生血，金銀花與甘草組為銀花甘草湯，清熱解毒，方中四藥合伍，共奏益氣合血、托里解毒功效［13］。研究表明當歸補血湯對骨質疏松大鼠模型維生素D 系統有調節作用［14］，當歸補血湯含藥血清對RA 滑膜炎癥有抑制作用［15］。基于中醫理論及前期研究成果，故推測，四妙湯通過調節維生素D 系統影響NETs 的形成有效改善RA。因此，本研究通過膠原誘導法建立滑膜型關節炎大鼠模型，深入探索四妙湯治療RA 的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗時間：2021 年11 月—2023 年1 月。

1.1.2 實驗動物：SPF 級6～7 周齡SD 雌性大鼠70 只，體質量200～220 g，購自貴州中醫藥大學實驗動物研究所，許可證號：SCXK（黔）2021-0003，所有大鼠在貴州中醫藥大學實驗動物研究所飼養，室溫22～25 ℃，相對濕度50%～60%，適應性飼養1 周后進行造模實驗。本實驗所有程序通過貴州中醫藥大學實驗動物研究所動物倫理審查（編號：20210100）。

1.1.3 實驗藥物和試劑：黃芪（批號：20210503）、當歸（批號：20210609）、金銀花（批號：20210763）、甘草（批號：20210921）均購自北京同仁堂貴陽藥店，上述所有藥材經貴州中醫藥大學方藥教研室蔣志濱副教授鑒定為合格中藥飲片。甲氨蝶呤片（MTX）（上海上藥信誼藥廠有限公司，批號：036210906），維生素D 滴劑（青島雙鯨藥業股份有限公司，批號：2104191），牛Ⅱ型膠原蛋白（上海源葉生物科技有限公司，批號：L22S11C125306），弗氏不完全佐劑（美國SIGMA 公司，批號：SLCH4885），冰乙酸（四川西隴科學有限公司，批號：2104131），大鼠IL-6、NETs、25（OH）D3ELISA 試劑盒（上海茁彩生物科技有限公司，批號：ZC-36404、ZC-54723、ZC-35943），甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體、中性粒細胞彈性蛋白酶（NE）抗體（美國Affinity 公司，批號：AF7021、AF0010），1-α 羥化酶（CYP27B1）抗體（美國Rioss 公司，批號：Bs-14146R），MPO 抗體（武漢三鷹生物技術有限公司，批號：22225-1-AP），VDR 抗體、24-羥化酶（CYP24A1）抗體（美國ABclonal 公司，批號：A2194、A1805）。

1.1.4 主要儀器：Multiskan MK3 型酶標儀（美國Thermo 公司），DYY-6C 型電泳儀（北京六一生物科技有限公司），L500-A 型離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司），光學顯微鏡（德國Leica 公司），Universal Hood Ⅱ型核酸蛋白凝膠成像儀（美國Bio-Rad公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 四妙湯的制備：四妙湯水煎劑由黃芪、金銀花、當歸、甘草按照10∶8∶2∶1 比例配伍組成，將4 味藥材用純凈水浸泡60 min 后，武火煮沸，轉文火煎煮30 min，取濾液，重復操作，合并兩次濾液利用旋轉蒸發儀濃縮生藥濃度至0.63 g/mL 備用。

1.2.2 大鼠分組：采用隨機數字表法將大鼠分為空白組（Control 組）、模型組（Model 組）、甲氨蝶呤組（MTX組）、維生素D組（VD組）、四妙湯低劑量組（SMT-L組）、四妙湯中劑量組（SMT-M 組）、四妙湯高劑量組（SMT-H組），每組10 只。

1.2.3 CIA 大鼠模型造模：大鼠參考文獻［16］造模，用蒸餾水配制0.05 mol/L 乙酸溶液，將牛Ⅱ型膠原蛋白溶于乙酸溶液中制成濃度為2 g/L 溶液，4 ℃環境下搖床震蕩過夜至完全溶解，隔天冰上操作與弗氏不完全佐劑1 ∶1 比例混合制成膠原乳液。分別在大鼠背部、尾根部、雙側后足墊四點皮下各注射膠原乳液0.1 mL 進行初次免疫，Control 組以相同方式注射等量0.9%氯化鈉溶液，初次免疫7 d 后，在大鼠背部及尾根部兩點皮下各注射0.1 mL 乳液加強免疫。以體質量下降，大鼠關節、腳踝及足部出現泛紅伴隨腫脹作為造模成功的標準。隨機抽取2 只大鼠，采用蘇木素-伊紅（HE）染色觀察大鼠滑膜組織的病理學改變，若出現滑膜增生、炎性細胞浸潤、纖維組織增生等系列變化，提示CIA 模型建立成功。

1.2.4 藥物干預：于加強免疫7 d 后開始灌胃治療，根據成人用量按照人與大鼠體表面積折算等效劑量［17］，SMT-L、SMT-M、SMT-H 組分別給予四妙湯水煎液3.15 g·kg-1、6.30 g·kg-1、12.60 g·kg-1灌胃，VD 組給予VD 滴劑25 μg·kg-1，Control 組和Model 組給予等量0.9%氯化鈉溶液灌胃，MTX 組給予MTX 1.5 mg·kg-1灌胃，2 次/周，其余各組均為1 次/d，藥物干預28 d。

1.3 指標檢測

1.3.1 大鼠一般狀況及踝部腫脹程度：觀察藥物干預前后，大鼠體質量、攝食情況、四肢活動情況及皮毛色澤等一般狀況。每組選取10 只大鼠，分別于藥物干預第0、7、14、21、28 天用電子秤測量并記錄大鼠體質量，用游標卡尺測量大鼠踝部直徑，以評估踝部腫脹程度，當前測量直徑減去初始測量直徑視為腫脹程度。

1.3.2 關節炎指數（AI）評分：分別于藥物干預第0、7、14、21、28 天，按照AI 評分標準進行評分并記錄。0 分：關節無紅腫脹癥狀；1 分：踝關節輕微腫脹；2 分：踝關節輕度紅腫伴足趾有紅斑；3 分：踝關節累及足趾中度紅腫；4 分：踝關節及全足重度紅腫，每只大鼠的四肢累計得分為AI 評分。

1.3.3 關節滑膜組織病理學檢測：藥物干預結束后，將大鼠踝關節取下置于4%多聚甲醛固定72 h，脫鈣、流水沖洗24 h、標本脫水、包埋、切片。采用HE 染色進行切片，顯微鏡觀測并采集圖像分析大鼠關節組織病變情況。

1.3.4 免疫組化法檢測滑膜組織MPO、TNF-α 表達情況：將制備好的滑膜組織切片進行脫蠟水化、磷酸鹽緩沖溶液（PBS）沖洗、抗原修復、血清封閉孵育，配置合適濃度的一抗（MPO 1∶40，TNF-α 1∶50）4 ℃孵育過夜，PBS 沖洗后滴加稀釋后的相應二抗，37 ℃烘箱孵育30 min，PBS 沖洗后加入顯色液，脫水封片。將切片在顯微攝像系統下觀察并采集圖像，每張切片采集3 張，使用HALO 數字病理圖像分析工具分析每張圖像的MPO、TNF-α 陽性面積占比。

1.3.5 酶聯免疫吸附測定（ELISA）檢測大鼠血清中IL-6、25（OH）D3、NETs 水平：藥物干預結束后，大鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉，經腹主動脈取血，室溫靜置30 min，4 ℃離心10 min（3 000 r/min，離心半徑14 cm），分離收集血清，置于-80℃冰箱備用，采用酶聯免疫吸附法（ELISA）測定血清IL-6、25（OH）D3水平，采用基于MPO-DNA 復合物的捕獲酶聯免疫吸附法測定NETs 水平，嚴格按照ELISA 試劑盒說明書進行操作，顯色后在酶標儀450 nm波長條件下依序測量各孔內OD 值，并根據獲得的標準曲線方程，計算樣品濃度。

1.3.6 蛋白質印跡法（Western blotting）檢測關節滑膜組織CYP24A1、CYP27B1、MPO、VDR、彈性蛋白酶（NE）表達水平：分離出大鼠踝關節滑膜組織放入2 mL 研磨管中，按樣本比例向管中加入RIPA 裂解液和鋼珠，低溫研磨儀研磨2 次，后設置離心機4 ℃以12 000 r/min離心5 min，分離出上清液置冰箱-20 ℃備用。依照BCA 試劑盒標準蛋白濃度和相應OD 值，計算樣本蛋白濃度。配置電泳膠、上樣、電泳、轉膜，用含5%脫脂奶粉的TBST（封閉液）室溫下搖床震蕩封閉2 h，TBST洗膜3 次，放入孵育盒，加入稀釋過的一抗4 ℃孵育過夜，一抗稀釋比例：CYP24A1（1∶1 000）、CYP27B1（1∶1 000）、MPO（1∶2 000）、VDR（1∶1 000）、NE（1∶1 000）。TBST 洗膜3 次，加入HRP 標記二抗（1∶600稀釋），37 ℃搖床孵育2 h，TBST 充分洗膜。最后配置ECL 顯影液，均勻滴加到聚偏二氟乙烯膜上，暗室曝光成像，掃描膠片，用BandScan 凝膠圖像分析軟件分析膠片灰度值。

1.4 統計學方法

采用SPSS 26.0 統計學軟件進行數據分析，符合正態分布的計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠一般狀況及腫脹度變化

正常組大鼠四肢活動正常，精神狀態良好，攝食正常，皮毛有光澤；模型組大鼠自初次免疫7 d 后逐漸出現四肢活動異常，精神狀態不佳，喜蜷臥角落，皮毛晦暗。干預第0 天7 組大鼠體質量比較，差異無統計學意義（P＞0.05），第7、14、21、28 天7 組大鼠體質量比較，差異有統計學意義（P＜0.05），其中第7 天VD 組、SMT-L 組、SMT-H 組高于Model 組，第14 天Control 組、MTX 組、VD 組、SMT-L 組、SMT-H 組高于Model 組，第21、28 天Control 組、MTX 組、VD 組、SMT-L 組、SMT-M 組、SMT-H 組高于Model 組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 7 組大鼠體質量比較結果（g）Table 1 Comparison of weight change result of rats in the seven groups

干預第0、7、14、21、28 天7 組大鼠腫脹程度比較，差異有統計學意義（P＜0.05），其中第0 天Model組、MTX 組、VD 組、SMT-L 組、SMT-M 組、SMT-H組高于Control 組，第7 天Control 組、MTX 組、VD 組、SMT-L 組、SMT-M 組、SMT-H 組低于Model 組，第14天Model 組高于Control 組，SMT-M 組高于Model 組，第21 天Model 組高于Control 組、MTX 組，低于VD 組、SMT-L 組、SMT-M 組、SMT-H 組，第28 天Control 組、MTX 組、VD 組、SMT-L 組、SMT-M 組、SMT-H 組低于Model 組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 7 組大鼠腫脹程度比較結果（mm）Table 2 Comparison of the swelling degree of rats in the seven groups

2.2 7 組大鼠AI 評分比較

藥物干預第0、7、14、21、28 天，Control 組大鼠AI 評分均為0 分。干預第0、7 天各組大鼠AI 評分均高于Control 組（P＜0.05）；干預第14、21、28 天各組大鼠AI 評分比較，差異有統計學意義（P＜0.05），其中第14 天SMT-H 組低于Model 組，第21 天MTX 組、VD 組、SMT-L 組、SMT-H 組低于Model 組，第28 天MTX 組、VD 組、SMT-L 組、SMT-M 組、SMT-H 組低于Model 組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表3。

表3 7 組大鼠AI 評分比較結果（分）Table 3 Comparison of AI scores of rats in the seven groups

2.3 7 組大鼠關節滑膜組織病理學檢測結果

HE 染色組織細胞核呈藍色，軟骨呈深藍色，細胞漿呈粉紅色至桃紅色，胞漿內嗜酸性顆粒呈鮮紅色，膠原纖維呈淡粉色。Control 組大鼠滑膜組織結構完整，骨層清晰，襯里層滑膜細胞排列疏松，未見病理改變；Model 組大鼠滑膜組織襯里下層大量炎性細胞浸潤、滑膜細胞異常增生、關節面被破壞出現不同程度的纖維組織增生；與Model 組比較，各給藥組大鼠滑膜組織的病理狀態均有改善，其中MTX組、SMT-H組改善較為明顯，炎性細胞浸潤減少，關節面相對完整，少量纖維增生，見圖1。

圖1 7 組大鼠關節滑膜組織病理學檢測結果（HE 染色，×50）Figure 1 Results of joint synovial histopathology in 7 groups of rats

2.4 7 組大鼠滑膜組織MPO、TNF-α 表達水平比較

二氨基聯苯胺法染色蛋白陽性表達為棕黃色，MPO陽性產物主要表達于細胞核、細胞質及細胞間質，TNF-α 陽性產物主要表達于細胞質及細胞間質。免疫組化法結果顯示，7 組大鼠滑膜組織MPO、TNF-α表達水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05），其中Model 組MPO、TNF-α 高于Control 組，MTX 組、VD組、SMT-H 組MPO、TNF-α 低于Model 組，SMT-M組TNF-α 低于Model 組，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖2～3、表4。

圖2 7 組大鼠滑膜組織MPO 表達情況（免疫組化法，×40）Figure 2 MPO expression in synovial tissue of 7 groups of rats

圖3 7 組大鼠滑膜組織TNF-α 表達情況（免疫組化法，×40）Figure 3 Expression of TNF-α in synovial tissue of 7 groups of rats

表4 7 組大鼠滑膜組織MPO、TNF-α 表達水平比較（%）Table 4 Comparison of MPO and TNF-α expression levels in synovial tissue of 7 groups of rats

2.5 7 組大鼠血清IL-6、25（OH）D3、NETs 水平比較

7 組大鼠血清IL-6、25（OH）D3、NETs 水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05），其中Model 組IL-6、NETs 高于Control 組，25（OH）D3低于Control 組；MTX 組、VD 組、SMT-H 組IL-6、NETs 低于Model 組，25（OH）D3高于Model 組；SMT-M 組NETs 低于Model 組，差異均有統計學意義（P＜0.05），見表5。

表5 7 組大鼠血清IL-6、25（OH）D3、NETs 水平比較Table 5 Comparison of serum levels of IL-6，25（OH）D3 and NETs in 7 groups

2.6 7 組大鼠關節滑膜組織CYP24A1、CYP27B1、MPO、VDR、NE 相對表達量比較

7 組大鼠CYP24A1、CYP27B1、MPO、VDR、NE相對表達量比較，差異有統計學意義（P＜0.05），其中Model 組CYP24A1 高于Control 組、MTX 組、VD 組、SMT-M 組、SMT-H 組，CYP27B1、VDR 低于Control組、MTX 組、VD 組、SMT-M 組、SMT-H 組，MPO 高于Control 組、MTX 組、VD 組、SMT-L 組、SMT-M 組、SMT-H 組，NE 高于Control 組、VD 組、SMT-M 組、SMT-H 組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表6、圖4。

圖4 7 組大鼠關節滑膜組織CYP24A1、CYP27B1、MPO、VDR、NE蛋白質印跡法檢測結果Figure 4 CYP24A1，CYP27B1，MPO，VDR，NE detected by Western Blot in synovial tissue of 7 groups of rats

表6 7 組大鼠滑膜組織CYP24A1、CYP27B1、MPO、VDR、NE 相對表達量比較Table 6 Comparative expression of CYP24A1，CYP27B1，MPO，VDR and NE in synovial tissue of 7 groups of rats

3 討論

中醫認為RA 的病因主要為素體虛弱、正氣不足、臟腑虛衰［18］。《諸病源候論》指出“人體虛，腠理開”，導致風、寒、濕三種外邪入侵，證候復雜，病勢反復纏綿；《素問·評熱病論篇》云：“邪之所湊，其氣必虛”［19］。四妙湯益氣和血，補虛生血，組方切合RA 基本病機，方中黃芪、當歸、金銀花、甘草均屬于臨床治療RA 的高頻次用藥［20］。現代藥理研究發現，甘草查爾酮A 是存在于甘草的活性物質，具有抗氧化、抗炎等多種藥理作用［21］，甘草中含有的柚皮素可通過影響大鼠血清中TNF-α 等炎性因子的含量，改善關節炎大鼠的炎癥細胞浸潤［22］。黃芪、金銀花、甘草中均含有的有效成分槲皮素和山奈酚能顯著改善RA，槲皮素是天然黃酮類化合物，通過降低氧化應激反應、抑制細胞增殖和遷移、減少炎性因子、促進滑膜成纖維細胞因子（FLS）的凋亡進而抑制滑膜炎癥，減少RA 的骨損害［23］，山奈酚可顯著抑制絲裂原活化蛋白激酶通路的激活，降低RA中FLS 的遷移和侵襲，能有效減輕CIA 小鼠關節炎的嚴重程度［24］。

本研究選擇與人類RA 病理特征高度相似的膠原誘導法構建的CIA 大鼠模型，實驗結果表明，Model 組大鼠出現體質量下降、足趾關節腫脹、精神狀態異常等一般狀況，經四妙湯干預后，大鼠體質量明顯增加、足腫脹度降低、關節指數評分降低、滑膜組織病理狀態明顯改善。IL-6、TNF-α 作為引起RA 持續性滑膜炎的重要炎癥反應標志物，其水平與RA 疾病程度存在正相關［25］。四妙湯干預后，可顯著降低CIA 大鼠血清IL-6水平，顯著降低滑膜組織中TNF-α 陽性表達。表明四妙湯能有效改善RA 病理癥狀，抑制RA 的炎癥反應。

VD 缺乏與RA 發病率和嚴重程度有關［5］。人體獲取VD 的形式是VD2和VD3，而VD2對維生素D 結合蛋白（DBP）的親和力較低，生物利用度降低，因此VD在人體內發揮免疫作用的形式主要是VD3。VD3依靠位于肝臟的CYP27A1 羥化為25（OH）D3，產生活性1，25-雙羥維生素D3［1，25（OH）2D3］，由CYP27B1介導，1，25（OH）2D3可作用于VDR 發揮生物學效應。CYP27B1是維生素D活化的關鍵酶，CYP24A1是25（OH）D3、1，25（OH）2D3失活的羥化酶［26］。本研究結果顯示，模型組大鼠血清25（OH）D3水平顯著降低，滑膜組織CYP27B1、VDR 蛋白表達顯著降低，CYP24A1 蛋白表達顯著升高。四妙湯干預后，顯著上調大鼠血清25（OH）D3水平及滑膜組織CYP27B1、VDR 蛋白表達，顯著下調CYP24A1 蛋白表達。表明四妙湯可能通過調控維生素D 系統實現對RA 的治療作用。

免疫系統的作用始終貫穿RA 的發生、發展，中性粒細胞作為固有免疫吞噬細胞［27］，是人體非特異性免疫的重要組成部分，其經過刺激釋放到細胞外的NETs在RA 中，是自身免疫抗原的重要來源，NETs 表達增加與RA 疾病狀態相關［28］，NETs 通過誘導ACPA 產生，刺激IL-6、TNF-α、白介素15（IL-15）等炎性因子的分泌，破壞機體免疫，參與RA 病理過程。NETs 的蛋白質組分NE 可降解關節軟骨，加重RA 的炎癥反應及骨破壞。NETs 及其產物MPO、NE 可作為RA 疾病活性標志物［29］。實驗結果顯示，模型組大鼠血清NETs水平顯著升高，滑膜組織MPO、NE 蛋白表達顯著升高，IHC 結果顯示MPO 陽性表達顯著升高，四妙湯高劑量及VD 干預后，則顯著降低大鼠血清NETs 水平、滑膜組織MPO、NE 蛋白表達、MPO 陽性表達。表明四妙湯與VD 改善RA 與抑制NETs 的形成及其成分MPO、NE的釋放相關。

綜上所述，四妙湯可能通過調控VD 系統抑制NETs 的形成有效改善CIA 大鼠RA 病理癥狀，為臨床治療RA 提供了實驗基礎。

作者貢獻：羅書曼負責文章的構思與撰寫，數據處理及分析；朱星負責文章的質量控制及審校；羅書曼、陳帥、李文、董右青負責動物模型的制備、實驗指標的檢測；何昌祿、周艷負責文獻和資料收集、整理，文章修訂；陳云志提出實驗的研究思路，負責實驗的實施推進與可行性分析，對文章最終版本進行審核。

本文無利益沖突。