半夏組織培養一步成苗技術初步研究

程搏幸, 羅夫來, 李冀青, 王洪亮, 李開陽, 周 丹

(1.貴州師范學院生物科學學院, 貴陽 550018; 2.貴州大學農學院, 貴陽 550025;3.貴州省農業科技發展中心, 貴陽 550001;4.赫章縣山地高效農業科技有限公司, 貴州 畢節 553200)

半夏[Pinelliaternate(Thunb.)Breit.]是天南星科草本植物,以干燥塊莖入藥,被歷版《中華人民共和國藥典》收載[1],具有燥濕化痰、降逆止嘔、消痞散結等功效[2],是常用的化痰止咳平喘藥材[3]。隨著半夏藥材需求量逐步增加,野生資源大幅衰減,市場上半夏藥材主要依靠人工種植[4]。目前,主要以塊莖作為種莖,用無性繁殖方式進行種植,繁殖系數小、種莖成本高、種植效益低,嚴重影響半夏產業可持續發展[5-6]。利用組織培養技術,實行半夏工廠化育苗是提高繁殖系數、降低種莖成本、提升種植效益的有效途徑,但是傳統組培技術需經過多次接種和培養,才能完成誘導、分化、生根、壯苗的過程,育苗環節多、步驟繁瑣、周期長[7]。一步成苗組織培養育苗法是在同一培養基上完成脫分化、再分化等過程,減少人工操作環節,降低污染風險,有效提高了育苗效率、縮短了育苗周期,為進一步提高種苗大規模生產提供有力保障。近年來,石斛[8]、丹參[9]、白芨[10]、栝樓[11]等藥用植物均已初步完成了一步成苗的相關研究,從理論上簡化了種苗生產操作流程,縮短育苗周期。然而關于半夏一步成苗的研究相對較少,目前主要以三葉半夏[12]、荊半夏[13]等作為研究對象,對其培養基成分優化。本研究以半夏為材料,研究其一步成苗的適宜外植體、培養基配方、煉苗方法、移栽煉苗基質,以期簡化半夏組織培養種苗生產流程,縮短培育周期,初步建立半夏一步成苗技術,為半夏種苗組培快繁提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗用半夏塊莖來源于貴陽市花溪區大將山半夏種植基地,經貴州大學趙才副教授鑒定為天南星科植物半夏(Pinelliaternata)。

1.2 方 法

1.2.1半夏無菌葉柄、葉片的培養

選取健康半夏塊莖通過組織培養得到半夏組培幼苗,將組培幼苗作為外植體來源,其葉柄和葉片作為外植體,葉柄切成1 cm小段、葉片切成0.5～1.0 cm見方小塊。

1.2.2外植體及培養基配方篩選

以MS培養基(含0.1%活性炭)為基本培養基,采用二因素三水平完全隨機設計(表1),考察生長調節劑對半夏組培苗生長的影響,將外植體接種到相應培養基上,放入培養室培養。培養條件為25 ℃、2 000～2 500 lx,每天光照12 h,培養周期為60 d。記錄愈傷數、芽分化數、根分化數以及每顆外植體長出的幼苗數,并計算愈傷誘導率、芽分化率、根分化率等。

表1 半夏一步成苗的生長調節劑因素及水平

愈傷誘導率/%=(分化愈傷組織外植體數/接種外植體數)×100%;

芽分化率/%=(具芽的外植體數/接種外植體數)×100%;

根分化率/%=(具根的外植體數/接種外植體數)×100%;

平均每個外植體分化的幼苗數=分化出的幼苗總數/分化出幼苗的外植體數;

增殖系數=分化出的幼苗總數/接種株數。

1.2.3煉苗方法篩選

將生長健壯,長勢一致的組培苗與培養瓶一起轉移至煉苗室,進行閉瓶煉苗(0 d、2 d、5 d)和開瓶煉苗(3 d)處理,考察煉苗方式和時間對半夏幼苗成活率及幼苗長勢的影響,各處理200瓶。煉苗環境:溫度25 ℃、濕度40%～50%、光照2 000～2 500 lx,適當澆水。

移栽成活率/%=(成活株數/移栽株數)×100%。

1.2.4移栽煉苗基質篩選

以表2中河沙、腐殖土、蛭石三種物質比例配制移栽基質,經高壓滅菌鍋121 ℃滅菌20 min后,取出,置于烘箱中105 ℃烘干10 h以上,至恒重。在煉苗盤中裝入厚約5 cm的基質,在基質上按5 cm × 5 cm距離用木棍打孔。將上述通過煉苗且長勢良好的幼苗取出,分割成一芽三根的單棵植株(芽高3 cm以上,根平均長2 cm)栽入小孔內,每個處理移栽40顆小苗,3次重復。移栽煉苗環境:溫度25 ℃、濕度40%～50%、光照2 000～2 500 lx,每天光照12 h,適量補水,20 d后觀察組培苗移栽成活率及幼苗生長情況。

表2 移栽基質的配比設計

1.2.5移栽基質含水量篩選

以腐殖土+河砂作為移栽基質,根據上述實驗方法配制移栽基質及移栽半夏組培苗,20 d后觀察成活率及幼苗生長情況。

計算最大持水量:用環刀取基質,在環刀下墊一張濾紙,用皮筋固定在環刀上,防止基質散出。之后將環刀放在盤子里,盤中倒水,沒過濾紙即可,隔天將環刀中的基質取出,放在已知重量的鋁盒中稱重,得到最大持水量時的土壤質量(W1);之后將鋁盒放在烘箱中105 ℃烘至恒重(約10 h以上),稱重得到干土質量(W2)。

最大持水量(質量含水量)=(W1-W2)/W2。

1.3 數據處理

試驗數據分析采用Excel軟件進行,方差分析采用IBM SPSS Statistics24軟件進行,利用鄧肯新復極差法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 不同培養基配方對半夏葉柄一步成苗的影響

由表3可知,以半夏無菌苗葉柄為外植體時,處理8愈傷組織誘導率最高,達100%,但愈傷組織能分化為幼苗的比例僅達到一半。處理7愈傷組織誘導率達81.48%,愈傷組織的成苗率也接近100%,但該處理中根系相對較少,每棵具苗外植體產出幼苗數為4.88株。處理2和處理5愈傷組織誘導率分別為77.78%和86.42%,愈傷組織的成苗率接近100%,且根系發達,每顆具苗外植體能產出8株幼苗,為本組實驗中的最高值,且處理5的增殖系數顯著高于其他處理(表4)。因此,處理5最適宜作為半夏無菌苗葉柄作為外植體時一步成苗的培養基。

表3 生長調節劑對半夏一步成苗的影響

2.2 不同培養基配方對無菌葉片一步成苗的影響

如表3所示,以半夏無菌苗葉片為外植體時,處理4愈傷組織誘導率為86.42%,為該組實驗最高值,愈傷組織分化成苗率接近100%,根系發達,每顆具苗外植體能分化幼苗數為8.07株。處理7和處理8的愈傷組織分化成苗率也接近100%,根系發達,每顆具苗外植體能分化幼苗數分別為13.58株和15.19株,然而處理7的愈傷組織誘導率為53.09%,低于處理8(79.01%),且處理8的增殖系數顯著高于處理7(表4)。因此,處理8最適宜作為半夏無菌苗葉片為外植體時一步成苗的培養基。

綜合上述兩組試驗數據,半夏無菌苗葉片作為外植體時處理8的愈傷組織誘導率、芽分化率、根分化率等數據與葉柄作為外植體時處理2和處理5的相似,葉片作為外植體時處理8的成苗率、增殖系數均高于葉柄為外植體的。因此,半夏無菌苗一步成苗體系中應以葉片作為外植體,并以處理8的生長調節劑濃度配比作為培養基配方。

2.3 煉苗時間對半夏組培苗生長的影響

如表5所示,閉瓶煉苗時間對半夏組培苗成活率影響顯著且苗情差異較大。在煉苗階段,直接開瓶煉苗時半夏組培苗成活率為56%,成活的幼苗長勢不佳,不宜移栽。當閉瓶煉苗2 d、5 d再開瓶煉苗時,成活率均達到100%,且幼苗長勢均良好。

表5 煉苗時間對半夏組培苗成活率及苗情的影響

2.4 移栽煉苗基質對半夏組培苗生長的影響

移栽基質的選擇影響半夏組培苗移栽成活率和苗情(表6)。3種移栽基質對幼苗成活率和葉寬的影響無顯著差異,腐殖土+河砂作為移栽基質時幼苗葉綠素相對含量和葉長顯著低于其他處理,株高顯著低于腐殖土+蛭石處理組。腐殖土+蛭石處理組與腐殖土處理組的成活率、葉長、葉寬、葉綠素相對含量等指標差異不顯著,腐殖土+蛭石處理組的株高顯著高于腐殖土處理組。因此,腐殖土+蛭石處理組較適合作為半夏組培苗移栽基質。

表6 移栽基質對半夏組培苗成活率及苗情的影響

2.5 移栽煉苗基質含水量對半夏組培苗生長的影響

隨著移栽基質含水量增加,半夏組培苗移栽成活率呈升高趨勢,幼苗長勢逐漸強壯(表7)。移栽基質含水量為80%時,成活率顯著高于其他處理,雖然該處理中半夏組培苗株高顯著低于含水量為70%的處理,但葉長、葉寬、葉綠素相對含量等指標均高于其他處理。因此,移栽基質含水量為80%有利于半夏組培苗的生長。

表7 基質含水量對半夏組培苗成活率及苗情的影響

3 討 論

激素是植物組織培養基的核心組成部分,作為植物生長調節劑在誘導愈傷組織、不定芽分化、苗的生長、生根等組培苗生長各階段均起著關鍵作用。細胞分裂素6-BA促進芽的分化和生長,并對愈傷組織的形成具有促進作用,生長素NAA以促進苗的生長和誘導不定根的形成為主[14],在一步苗體系中細胞分裂素與生長素共同影響組培苗的生長與分化[15-16]。本研究中,綜合考慮愈傷組織誘導率、芽分化率、根分化率、每個外植體形成的幼苗數及增殖系數等指標,以葉片作為外植體并在培養基中加入1.5 mg/L NAA和1 mg/L 6-BA時半夏組培一步成苗的效率優于其他處理。在該培養基處理下,愈傷組織誘導率雖然僅有79.01%,而芽分化率和根分化率均近100%,增殖系數達44.22。由此可見,本處理提高了半夏一步成苗的繁殖效率[12]。在該激素濃度配比中1 mg/L 6-BA的濃度相對較低,與楊璐等[17]、劉福平等[18]的研究結果一致,原因是過高濃度的細胞分裂素會抑制植物正常的生長、發育。本研究中,高濃度NAA促進愈傷組織誘導不定根形成,NAA濃度達到1.5 mg/L時不定根的誘導率接近100%,與李娟娟等[19]的研究結果一致。

MS培養基具有植物生長所需的豐富營養,能加快愈傷組織的形成和幼苗的生長,是植物組織培養最常用的基礎培養基之一。半夏組織培養各階段或一步成苗的大多數研究均以MS作為基礎培養基,均能達到較為理想效果,本研究也使用MS作為半夏一步成苗的基礎培養基。活性碳已廣泛應用于石斛、蝴蝶蘭、藍莓等植物組織培養,作為培養基添加劑可有效防止外植體的褐化、吸附植物代謝的有害物質、促進幼苗根系的生長[20]。喻娜[21]研究認為,添加適量活性炭有利于組織培養中半夏幼苗根系的生長,同時根據本實驗室前期實驗經驗,本研究在MS中添加了0.1%活性炭作為基礎培養基。

煉苗和移栽是植物組培幼苗一步成苗體系中最后一個環節[22],煉苗時間、移栽基質和移栽基質含水量對半夏組培幼苗移栽的成活率及長勢具有顯著影響。在本研究中,未經開瓶煉苗的半夏組培幼苗成活率及長勢顯著低于經開瓶煉苗處理的,這可能是組培苗長期在無菌環境中長大,如直接移栽適應性較差,無法適應自然環境[23]。此外,組培苗的移栽基質應具備豐富營養、疏松透氣、水分充足等特點[24],在本研究中,具有上述特征的腐殖土+蛭石(含水量為80%)更有利于半夏組培苗的移栽。