藍光致棕色挪威大鼠慢性視網膜光損傷的實驗研究

俞永珍，程天豪，鄒秀蘭，章夢一，余洋洋，鄒玉平，3，龐龍

濕性年齡相關性黃斑變性（wet age related macular degeneration，wAMD）是中老年最常見的致盲性眼病［1］，其中眼底色素沉積與wAMD 的發生發展密切相關，提示黑色素在wAMD 的發病機制中極為重要［2-3］。近年來研究顯示，慢性光損傷是導致wAMD、視網膜色素變性及其他視網膜變性類眼病的高危因素［4］，而研究光感受器細胞及視網膜色素上皮細胞（retinal pigment epithelium cell，RPEc）的損傷機制，有助于明確該類疾病的病理發生機制。藍光在可見光中波長較短，光能量大，穿透性強，故藍光最容易穿透角膜和晶狀體到達眼底視網膜，造成視網膜損傷［5］。棕色挪威（Brown Norway，BN）大鼠是有色鼠，因視網膜和色素成分與人體類似，RPEc及脈絡膜組織中含有大量的黑色素，且RPEc層和脈絡膜毛細血管復合體層也與人體類似［3，6］。目前鮮有有色鼠的光損傷相關研究。筆者推測藍光誘導的BN 大鼠視網膜光損傷可能發生了類似wAMD 的病理過程，通過建立藍光誘導的慢性視網膜光損傷動物模型，旨在研究藍光照射BN大鼠后光感受器細胞及RPEc的損傷特點及可能損傷機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 40 只雄性成年BN 大鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，生產許可證號：SCXK（京）2021-0011，體質量180~200 g，8周齡。在通風良好，氨濃度≤14 mg/m3，相對濕度40%～70%，12 h明/暗的循環光環境中適應2周，光照前暗適應24 h，環境溫度18～22 ℃。根據隨機數字表法分為光照0 d組（正常對照組）和藍光光照組：光照1、3、7及14 d組，每組8只。本研究經中國人民解放軍南部戰區總醫院實驗動物倫理委員會批準同意，批準號：SYOW2022023，實驗過程中按照動物使用的“3R”原則給予人道主義關懷。

1.2 試劑與儀器 蘇木素染色液、蘇木素分化液、蘇木素返藍液（武漢塞維爾生物有限公司），中性樹膠（國藥集團化學試劑有限公司）；大鼠活性氧簇（ROS）酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測試劑盒（美國Rapidbio 公司），FL-1D 藍光輻照計（北京師范大學光電儀器廠）；LED 藍光光源（主波峰451 nm，色純度0.982，中山共炫光電科技有限公司）；Topcon眼底照相機（德國Topcon 公司）；電生理儀、Ganzfeld 刺激器（德國羅蘭公司）；金屬環狀角膜接觸電極、金屬針狀接觸電極（北京高視遠望科技有限責任公司）；BX-51 顯微鏡（日本Olympus 公司），Multiskan Go 酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）。

1.3 LED 藍光光照箱制備 按照大鼠飼養箱規格用亞克力板制作大鼠藍光光照箱，并分隔為4格；光源用LED藍光燈，保證光照箱的藍光光照強度平均在（1 000±100）Lux，藍光燈的燈板規格為460 mm×300 mm，4 個角區域留出10 mm×10 mm 的面積，以利于光照箱內空氣流通，光照時將藍光燈朝向內部并將燈板置于大鼠飼養箱的頂部，見圖1。光照時保持光照箱內溫度為28~32 ℃。

Fig.1 Home-made LED blue light animal light incubator圖1 自制LED藍光冷光源動物光照箱

1.4 處理方法 正常對照組大鼠不進行光照，正常飼養；余各組大鼠均于光照前20 min 給予復方托吡卡胺滴眼液（1 mL/支，沈陽興齊眼藥股份有限公司）散瞳處理，每次1滴，每次間隔5 min，共滴4 次；藍光光照組大鼠每日處于藍光光照環境中3 h，分別照射1、3、7、14 d。光照結束后將大鼠送回暗環境中，給予氯霉素滴眼液滴眼，每次1 滴，每次間隔5 min，滴2次。觀察各組大鼠的行為表現，包括毛發色澤、精神狀況、食欲、體質量、對光聲的刺激反應。

1.5 視網膜電流圖（electroretinogram，ERG）檢查 ERG檢查所有操作在暗室內微弱紅光燈下進行，采用電生理儀記錄大鼠雙眼ERG信號。BN大鼠暗適應6 h后，行10%水合氯醛腹腔注射麻醉，復方托吡卡胺滴眼液點雙眼散瞳，0.4%鹽酸奧布卡因滴眼液（20 mL/支，日本參天制藥株式會社）點雙眼表面麻醉。將金屬環狀角膜接觸電極安放在檢測眼的角膜上，盡量使電極與角膜最大接觸，將金屬針狀電極（參考電極及接地電極）分別插在臉頰兩側和尾部皮下。電生理儀Ganzfeld閃光刺激器提供閃光，閃光強度：3.0 cd·s/m2，背景光強度25 cd·s/m2，每個點至少測量3次，采用雙通道同步采樣記錄，通頻帶0.2~500 Hz，每項記錄重復30 次。記錄最大混合反應ERG的a、b波振幅和潛伏期，a波振幅為基線到a波波谷的電位值，a波潛伏期為從光刺激開始至a波波峰的時間；b波振幅為a波波谷至b波波峰的電位值，b波潛伏期為從光刺激開始至b波波峰的時間。

1.6 眼底照相 大鼠完成ERG檢查后，保持瞳孔散大狀態，必要時酌情行10%水合氯醛腹腔注射麻醉。用眼底照相機采集BN大鼠以視盤為中心的50°范圍的眼底彩照。

1.7 視網膜組織HE 染色 將大鼠行10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，脊椎脫臼法處死大鼠，隨后立即摘除雙側眼球，制備石蠟切片，切片厚度4μm，將切片經二甲苯脫蠟后，依次進行蘇木素染色、分化、返藍、伊紅染色、透明及封片。BX-51顯微鏡下觀察視網膜組織切片染色情況，Image-J 軟件測量外層視網膜厚度，即光感細胞層至外核層的視網膜厚度。

1.8 ELISA 檢測視網膜組織ROS 含量 將新鮮摘除的大鼠眼球組織置于冰上，小心去除眼前節組織并分離出視網膜組織。取100 mg 視網膜組織，加入1 mL 生理鹽水，于4 ℃下3 000 r/min 離心10 min，取上清液，置于1.5 mL 離心管中，-20 ℃保存。按照ELISA檢測試劑盒說明書進行操作，采用酶標儀測定視網膜組織ROS含量。

1.9 統計學方法 采用SPSS 27.0軟件進行數據分析。計量資料均符合正態分布，以表示，多組間比較采用單因素方差分析，均經Levene 檢驗行方差齊性檢驗，方差不齊時用Dunnett-T3 檢驗進行組間多重比較，方差齊時用LSD-t檢驗進行組間多重比較。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 藍光照射對大鼠的行為活動影響 正常對照組飼養期間精神狀態良好，毛發有光澤，行動、飲食正常；與正常對照組比較，光照1 d組及光照3 d組在體形、飲食及精神狀態上無明顯差異，但光照3 d 組對光聲刺激的反應遲鈍；光照7 d及14 d組精神較萎靡，毛發光澤度降低甚至枯槁無光澤，行動稍遲緩，對光聲刺激反應更為遲鈍，飲食量減少；光照7 d 及14 d 組體質量較正常對照組、光照1 d 及3 d 組減輕（P＜0.05），而光照1 d、3 d 組的體質量與正常對照組比較，在各時間點差異無統計學意義；各組大鼠在飼養3、7、14 d 體質量均較飼養0 d 增加（P＜0.05），見表1。

Tab.1 Comparison of body mass of rats between different feeding times of each group表1 各組大鼠不同飼養時間的體質量比較（n=8，g，）

Tab.1 Comparison of body mass of rats between different feeding times of each group表1 各組大鼠不同飼養時間的體質量比較（n=8，g，）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；F組間=4.840＊，F時間=2 294.410＊＊，F交互=102.980＊＊；a與正常對照組比較，b與光照1 d組比較，c與光照3 d組比較，d與光照7 d組比較，A與0 d比較，P＜0.05。

組別正常對照組光照1 d組光照3 d組光照7 d組光照14 d組F 0 d 186.88±6.42 186.63±5.66 187.50±3.78 186.13±3.94 187.38±6.23 0.089 1 d 190.25±6.30 190.13±5.96 190.75±4.03 189.13±3.94 190.38±6.23 0.101 3 d 196.63±6.17A 196.50±5.90A 193.13±4.85A 193.63±3.25A 195.50±6.12adA 0.734＊7 d 208.25±6.00A 208.50±5.10A 204.00±3.70A 198.25±4.50abcA 199.88±5.30abcdA 7.539＊＊14 d 230.50±6.12A 228.63±5.90A 223.13±3.44A 203.63±3.74abcA 202.25±5.18abcdA 34.697＊＊F 65.188＊＊45.107＊＊105.442＊＊25.906＊＊9.180＊＊

2.2 藍光照射對ERG的影響 與正常對照組比較，光照1 d 組ERG a 波、b 波潛伏期及振幅差異均無統計學意義；光照3、7 及14 d 組的ERG b 波潛伏期逐漸延長，a波、b波振幅逐漸降低（P＜0.05），見表2。

Tab.2 Comparison of latency and amplitude of ERG a wave and b wave between the five groups表2 各組ERG a波、b波潛伏期和振幅比較（n=8，）

Tab.2 Comparison of latency and amplitude of ERG a wave and b wave between the five groups表2 各組ERG a波、b波潛伏期和振幅比較（n=8，）

＊P＜0.05；a與正常對照組比較，b與光照1 d組比較，c與光照3 d組比較，d與光照7 d組比較，P＜0.05。

a波b波組別正常對照組光照1 d組光照3 d組光照7 d組光照14 d組F潛伏期/ms 18.53±3.48 18.09±3.34 25.9±2.28ab 29.38±5.39ab 41.96±5.26abcd 44.786＊振幅/μV 46.81±5.32 46.95±5.14 34.35±3.78ab 26.99±5.34abc 10.68±1.20abcd 90.300＊潛伏期/ms 40.08±5.80 39.44±4.78 37.81±5.67ab 50.57±3.91abc 63.91±5.56abcd 36.687＊振幅/μV 96.48±7.16 96.11±6.73 81.03±5.22ab 73.51±8.00abc 38.02±5.38abcd 37.006＊

2.3 藍光照射對視網膜的影響 正常對照組和光照1 d 組大鼠的眼底未見明顯異常，視網膜平伏，視網膜血管、視盤結構清晰可見，未見出血點及黃白色點狀顆粒；光照3 d 組大鼠眼底視網膜平伏，偶見出血點和散在的視網膜脫色素改變；光照7 d組大鼠眼底見視盤色淡，視網膜上見散在點狀出血點、黃白色點狀顆粒物，視網膜靜脈迂曲擴張，伴視網膜脫色素改變；光照14 d組眼底見視盤色淡，視網膜動脈呈銅絲樣甚至銀絲樣外觀，視網膜上見大量黃白色點狀滲出，視網膜靜脈迂曲擴張，伴大量視網膜脫色素改變，見圖2。

Fig.2 Fundus color photos of BN rats of the five groups圖2 各組BN大鼠眼底彩照

2.4 視網膜病理學觀察 HE染色顯示正常對照組視網膜形態正常，視網膜各層結構清楚，光感受器內、外節排列整齊規則，外核層排列整齊規則；光照1、3 d 組大鼠視網膜各層結構清晰，但在光照3 d 組見RPEc層基底部色素顆粒明顯增多，外核層可見輕度細胞核固縮現象；光照7、14 d 組大鼠視網膜光感受器內節（IS）/外節（OS）空隙增大、結構排列紊亂，外核層細胞核固縮，RPEc層基底部色素顆粒沉積及RPEc下局灶性隆起，見圖3。與正常對照組比較，光照3、7 及14 d 組視網膜變薄（P＜0.05），但光照3、7及14 d組視網膜厚度差異無統計學意義，見表3。

Tab.3 Comparison of retinal thickness and ROS content between five groups表3 各組大鼠視網膜厚度及視網膜ROS含量的比較（n=8，）

Tab.3 Comparison of retinal thickness and ROS content between five groups表3 各組大鼠視網膜厚度及視網膜ROS含量的比較（n=8，）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，a與正常對照組比較，b與光照1 d組比較，c與光照3 d組比較，d與光照7 d組比較，P＜0.05。

組別正常對照組光照1 d組光照3 d組光照7 d組光照14 d組F視網膜厚度/μm 46.67±3.71 45.54±3.18 41.87±1.58a 40.89±1.32ab 39.87±1.85ab 11.740＊視網膜ROS含量/（U/mg）151.75±9.68 157.24±6.63 200.73±9.38ab 277.09±19.07abc 324.85±15.95abcd 257.39＊＊

Fig.3 Retinal HE staining of BN rats(×40)圖3 BN大鼠視網膜HE染色（×40）

2.5 各組大鼠視網膜ROS 含量比較 與正常對照組比較，光照3、7、14 d 組大鼠視網膜ROS 含量升高（P＜0.05），且光照1、3、7、14 d組視網膜ROS含量逐漸升高（P＜0.05），見表3。

3 討論

視網膜是高耗氧量及高代謝組織，視網膜光感受器細胞IS含有大量的線粒體、核糖體等，視網膜光感受器OS 主要由膜盤構成，含有視色素，接受光線刺激后經一系列反應完成光傳導［7］。RPEc 含有脂褐素、黑色素、豐富的線粒體、內質網等，具有儲存轉運視色素、吞噬感光細胞外節脫落的膜盤、清除氧自由基、分泌細胞因子等功能，在參與、維護視網膜功能及視覺形成中有重要作用［8］。黑色素具有很強的清除ROS、氧自由基及吸收高輻射射線能量的作用［9］。有色鼠眼部的黑色素主要分布在虹膜、RPEc及脈絡膜中，當光線進入鼠眼后，首先由虹膜遮擋部分光線；RPEc及脈絡膜無法像虹膜那樣直接遮擋光線，而是RPEc及脈絡膜中豐富的黑色素通過清除氧自由基發揮了視網膜光損傷的保護作用［2，6］。研究顯示，藍光可引起大鼠或小鼠視網膜結構和功能的損傷，其中視網膜光感受器細胞和RPEc凋亡損傷是導致視網膜光損傷的重要機制［4-5］。Li 等［10］發現SD大鼠連續8周暴露于5.03 Lux的藍光3、6、12 h后，視網膜光感受器細胞和RPEc出現退行性改變，首先光感受器細胞OS 的膜盤腫脹、空泡樣改變，光感受器細胞IS線粒體腫脹、減少，隨后出現光感受器細胞核固縮，進而誘導光感受器細胞的凋亡；隨著光感受器細胞的凋亡，RPEc 層變薄，數量減少、細胞破碎裂解。Lin 等［11］將BN 大鼠每日暴露于150 Lux 的藍光中3 h并在大鼠暴露藍光7、14 d后發現BN大鼠出現視網膜靜脈迂曲擴張和白色點狀滲出，視網膜變薄，視網膜IS/OS 層變薄。本研究利用（1 000±100）Lux藍光照射BN 大鼠，發現大鼠在光照3 d 后對光聲刺激的反應更遲鈍，尤以在光照7、14 d后其精神狀態、飲食、毛發光澤及對光聲刺激明顯減弱，體質量減輕；眼底可見較為明顯的視網膜靜脈迂曲擴張、視網膜點狀出血及局灶性視網膜色素上皮脫失，視網膜變薄，IS/OS 層排列紊亂、萎縮，外核層核固縮，推測大鼠在光照7 d 時已出現光感受器細胞和RPEc 損傷，視覺受到影響，與Lin等［11］的研究結果相似。在本研究中BN大鼠在藍光照射3 d后眼底已經出現了視網膜外核層的輕度核固縮、視網膜脫色素，并伴有RPEc層基底部色素顆粒增多；光照7 d后RPEc層基底部色素顆粒的沉積更為明顯，考慮光照3 d時已出現光感受器細胞的輕度損傷。

ERG a波記錄是光感受器細胞的功能，而b波主要記錄雙極細胞、Müller細胞的功能。研究顯示，光損傷后大鼠光感受器細胞IS結構紊亂，雙極細胞在光感受器細胞發生凋亡前已出現損傷，隨后Müller細胞網絡支架坍塌，形成類似于“星形細胞瘢痕”［12-13］。本研究中大鼠光照3 d 時，ERG a 波、b 波的振幅明顯下降，潛伏期延長，推測在大鼠光照3 d后，視網膜光感受器細胞凋亡，視網膜外核層出現核固縮，導致視網膜光感受器細胞損傷；而雙極細胞、Müller細胞的損傷則影響了光線在神經感覺層的傳導，且隨著藍光光照的時間延長，視網膜光感受器的損傷更為明顯，這與筆者觀察到的大鼠視網膜的病理結構表現相符。

藍光誘導的氧化應激反應在視網膜光感受器的細胞凋亡中具有重要作用［14-15］，黑色素可有效保護光照后的視網膜組織，減少氧化應激反應對視網膜的光損傷［2，4，16］。Marie 等［17］研究發現，藍光照射后RPEc產生了大量ROS并發生氧化應激反應，導致視網膜線粒體功能障礙及細胞凋亡。Nakamura 等［18］采用1 100 Lux 的藍光對C57BL/J 小鼠進行照射，發現小鼠在藍光照射3 d后視網膜RPEc和光感受器細胞出現嚴重的凋亡，主要表現為光感受器細胞層和RPEc層變薄，結構紊亂。可見光照射有色鼠及白化鼠后，有色鼠的視網膜光損傷程度明顯低于白化鼠，可能是有色鼠的RPEc 黑色素減少視網膜組織的氧化應激反應，快速有效的清除氧自由基，保護視網膜［2，19］。本研究中大鼠視網膜組織ROS 含量隨著藍光照射時間延長逐漸增加，考慮大鼠在連續藍光照射后視網膜組織發生氧化應激反應，損傷大鼠視網膜光感受器細胞及RPEc。體內未及時清除的ROS在加重氧化應激反應的同時［20-21］，亦可抑制RPEc中溶酶體吞噬光感受器細胞OS，引起脂褐質的堆積［22］，脂褐質中含有N 視黃基視黃乙醇胺對藍光特別敏感，可進一步引起RPEc凋亡、線粒體DNA功能障礙及氧化應激反應加重［2，17，22］，形成惡性循環。在氧化應激的環境下，視網膜光感受器細胞OS損傷導致大量膜盤脫落，RPEc 本身遭受氧化損傷，同時RPEc及其黑色素需要超負荷清除產生的ROS、吞噬脫落的光感受器細胞OS，最終RPEc功能失代償，細胞凋亡甚至裂解，加重脂褐質的堆積，因此在RPEc基底部可見大量的脂褐質、色素顆粒沉積并引起炎性因子的積聚，破壞RPEc層及脈絡膜毛細血管復合體的完整性，出現RPE基底部的局灶性隆起，甚至為新生血管的形成提供一個空間平臺。本研究觀察到光照3 d組大鼠RPE 層基底部色素顆粒增多、積聚，尤以光照7 d組大鼠及光照14 d組大鼠的更為明顯，并伴眼底視網膜脫色素的表現，甚至在光照14 d 組大鼠中可見RPEc層局灶性隆起，加速了wAMD的發生發展。

綜上，藍光持續照射BN大鼠可產生氧化應激反應，導致慢性視網膜光損傷，且隨著照射時間延長，視網膜光損傷程度愈重。這種藍光導致的慢性視網膜光損傷值得引起研究者的重視，后期將繼續深入研究其發病機制，為進一步研究視網膜光損傷的防治手段提供理論基礎。