顆粒蛋白前體在兒童免疫性血小板減少癥中的應用價值*

石 磊,景春梅,劉 茜,王 偲

(重慶醫科大學附屬兒童醫院檢驗科/國家兒童健康與疾病臨床醫學研究中心/兒童發育疾病研究教育部重點實驗室/兒科學重慶市重點實驗室,重慶 400014)

免疫性血小板減少癥(ITP)是一種兒童常見的出血性疾病,其以外周血血小板減少為主要特點。臨床表現為皮膚及黏膜瘀點、瘀斑,臟器出血等,主要發病機制為免疫介導的血小板破壞增多、骨髓巨核細胞成熟障礙導致血小板產生不足[1]。兒童ITP大多數是一種良性自限性疾病,為排他性診斷,目前,尚無特異性指標可確診ITP。部分再生障礙性貧血(AA)患兒早期也可僅表現為血小板降低,紅系和粒系兩系下降不明顯或正常,與ITP的外周血血常規檢測結果很難鑒別,易被誤診為ITP[2]。ITP和AA的鑒別診斷主要依靠骨髓穿刺檢查,但由于不同部位造血能力不同,穿刺部位及閱片技術等因素均可能影響骨髓檢查結果[3]。此外,骨髓穿刺檢查是侵襲性操作,對血小板計數(Plt)明顯降低、出血傾向嚴重者也存在一定風險。ITP與AA的發病機制和治療均存在明顯區別,因此,早期鑒別診斷對及早進行不同的治療方案具有重要意義。本研究探索一種簡便的輔助檢查方法,旨在為ITP和AA的有效鑒別診斷提供參考依據。

顆粒蛋白前體(PGRN)是一種能在外周血檢測的自分泌生長因子,表達于上皮細胞、吞噬細胞、造血細胞、免疫細胞等,是一種重要的免疫調控因子。據文獻報道,PGRN參與了多種感染性疾病、腫瘤及自身免疫性疾病的發生、發展[4-8]。YU等[9]對大于14歲ITP患者的研究結果顯示,與健康者及非免疫性血小板減少患者比較,ITP患者血漿PGRN水平顯著升高。但目前尚少見關于兒童ITP血清PGRN水平的相關文獻報道。因此,推測PGRN可能是兒童ITP的一種有價值的新型生物標志物。本研究檢測了兒童ITP血清PGRN水平,探索了PGRN對兒童ITP的診斷,以及與AA的鑒別診斷價值。

1 資料與方法

1.1研究對象 選取2021年7月至2022年12月本院收治的初診兒童ITP患兒 60例(ITP組)、AA患兒45例(AA組),以及健康兒童45例(健康對照組)作為研究對象。ITP診斷標準符合《中國兒童原發性免疫性血小板減少癥診斷與治療改編指南(2021版)》[10]：(1)至少2次血常規檢測Plt減少;(2)脾臟一般無增大;(3)骨髓涂片檢查顯示巨核細胞總數增多或正常伴有成熟障礙;(4)排除其他繼發性血小板減少癥。AA診斷標準符合《兒童再生障礙性貧血診療規范(2019年版)》[11]：(1)血常規檢查紅細胞、粒細胞和血小板減少,校正后的網織紅細胞小于1%;(2)骨髓穿刺檢查示有核細胞增生程度活躍或減低,骨髓小粒造血細胞減少,非造血細胞比例增高,紅系、粒系、巨核系三系明顯減少;(3)骨髓活檢顯示有核細胞增生減低,巨核細胞減少或缺如等;(4)排除先天性和其他獲得性骨髓造血衰竭疾病。ITP組和AA組患兒采血檢測前均未接受過輸血、化療和刺激造血治療等。本研究經本院醫學研究倫理委員會審批通過(2019-114)。

1.2方法

1.2.1標本采集與檢測 采集3組研究對象靜脈血2 mL于乙二胺四乙酸二鉀紫色抗凝管中,室溫放置,6 h內采用日本Sysmex XE-2100血細胞分析儀進行血常規檢測,記錄Plt和平均血小板體積(MPV)。檢測試劑及質控品均為原裝配套試劑,每天檢測前做好室內質控。對Plt減少的標本均采用重新檢測和血液涂片瑞氏染色鏡檢的方式復檢。同時,采集3 mL靜脈血于促凝管中,3 000 g離心6 min后收集血清,-80 ℃保存。血清PGRN測定使用Human Progranulin Quantikine ELISA kit(R&D systems,Minneapolis,MI,USA),嚴格按說明書操作。

1.2.2治療及隨訪 對10例ITP患兒使用靜脈注射免疫球蛋白[0.8～1.0 g/(kg·d)]1～2 d后隨訪檢測血清PGRN水平變化。

2 結 果

2.13組研究對象一般資料比較 ITP組患兒中男39例,女21例;中位年齡33.5個月;AA組患兒中男23例,女22例;中位年齡89.0個月;健康對照組研究對象中男28例,女17例;中位年齡40.5個月。3組研究對象Plt、MPV及血清PGRN水平比較見表1。ITP患兒測出MPV 5例,AA患者測出MPV 20例。

表1 3組研究對象Plt、MPV及血清PGRN水平比較

2.23組研究對象PGRN水平比較 ITP組患兒血清PGRN水平[91.04(66.40,126.39)ng/mL]明顯高于AA組[61.05(48.36,75.25)ng/mL]及健康對照組[59.54(48.33,63.21)ng/mL],差異均有統計學意義(P<0.05) 。見圖1。

注：與ITP組比較,aP<0.05。

2.3ITP患兒治療前后PGRN水平比較 ITP患兒使用靜脈注射免疫球蛋白治療后血清PGRN水平[(93.19±26.51)ng/mL]明顯低于治療前[(122.28±40.70)ng/mL],差異有統計學意義(P<0.05) 。見圖2。

注：與治療前比較,aP<0.05。

2.4PGRN鑒別健康兒童與ITP、ITP與AA的診斷效能 當PGRN臨界值為71.85 ng/mL時鑒別診斷ITP與健康兒童的AUC為0.903,靈敏度為66.7%,特異度為97.8%;當PGRN臨界值為86.45 ng/mL時鑒別診斷ITP與AA的AUC為0.826,靈敏度為53.3%,特異度為97.8%。見圖3、4。

圖3 PGRN鑒別兒童ITP與健康兒童的ROC曲線

圖4 PGRN鑒別兒童ITP與AA的ROC曲線

3 討 論

兒童ITP是兒童期發生的一種獲得性、免疫性疾病,常表現為皮膚及黏膜瘀點、瘀斑,以外周血血小板減少為主要特點,其發病機制尚未完全明確。骨髓涂片檢查表現為巨核細胞總數增多或正常,伴有成熟障礙。目前,ITP主要是進行排除性診斷,結合臨床癥狀和實驗室檢查結果進行臨床確診。AA是一種骨髓衰竭性疾病,骨髓造血功能低下,主要與自身免疫破壞、造血微環境功能缺陷及造血干細胞內在缺陷等有關。兒童ITP診斷需排除血小板生成減少類疾病所致的血小板減少,如AA、急性白血病等,目前,主要通過骨髓穿刺涂片鑒別。但骨髓穿刺檢查為有創性檢查,相關指南不建議對具有典型表現的ITP患兒進行骨髓穿刺,需根據病情開展血常規、生化、免疫指標等常規檢查[12]。本研究探索一種外周血中的生物標志物幫助提高ITP和AA的鑒別診斷,以最大限度地避免不必要的骨髓穿刺檢查。

PGRN廣泛表達于骨骼肌、上皮細胞、巨噬細胞等多種組織和細胞[7],其在腫瘤、炎癥及維持和調節正常組織增殖、再生、修復和機體防御反應方面均發揮著重要作用。PGRN具有抑炎和促炎雙重作用,與其所在的微環境中炎癥介質和炎癥部位之間的競爭有關。在調控機制方面PGRN還能促進調節性T淋巴細胞(Treg)的分化和功能,抑制效應T淋巴細胞的活化及增殖。

以往文獻報道,PGRN在大于14歲的ITP患者血漿中明顯升高,通過ITP動物模型證實了PGRN具有促進血小板升高的作用,在ITP中具有保護性調控作用;發現PGRN基因的缺失會導致動物脾臟細胞中Treg比例下降,提示PGRN可能通過調控Treg數目參與了ITP的病理生理過程[9]。兒童與成人ITP由于感染、免疫、環境及基因因素不同,其臨床表現、治療反應也存在差異[13]。

本研究結果顯示,ITP患兒血清PGRN水平明顯高于健康對照組,與成人ITP的研究結果一致[9],提示PGRN參與了兒童ITP的發生、發展過程。本研究中隨訪了10例ITP患兒接受靜脈注射免疫球蛋白治療后血清PGRN水平明顯下降,進一步提示PGRN參與了兒童ITP的發生、發展過程。在今后的研究中將結合患兒體內其他細胞因子變化進一步探討PGRN在兒童ITP中發展的機制。

本研究進一步探討了PGRN在兒童ITP的變化和用于鑒別診斷AA的價值。通過ROC曲線分析了PGRN的診斷效能,當PGRN臨界值為71.85 ng/mL時鑒別診斷ITP與健康兒童的AUC為0.903;當PGRN臨界值為86.45 ng/mL時鑒別診斷ITP與AA的AUC為0.826。

ITP發病機制復雜,缺少靈敏且獨特的檢測標志物。關于血小板參數,如MPV、血小板分布寬度(PDW)、大血小板比率(PLCR)、未成熟血小板分數(IPF)等,鑒別ITP與其他疾病已有相關文獻報道。NEGASH等[14]發現,檢測MPV、PDW、PLCR等有助于預測血小板減少患者是ITP或低增生性血小板減少,MPV、PLCR用于鑒別ITP與低增生性血小板減少時的AUC分別為0.876和0.816。KHAN等[15]研究表明,MPV、PDW、PLCR用于初診ITP時靈敏度和特異度均較低,不能作為一個較好的篩查工具。因為在臨床工作中當血標本Plt較低時血細胞分析儀常無法測出MPV、PDW等參數,這些病例的血小板參數就無法獲得。本研究中ITP組和AA組均有部分病例MPV、PDW等參數未能測出。IPF用于鑒別ITP與健康兒童及骨髓衰竭性疾病時也有不同的研究結果,美國一項對兒童的研究表明,IPF能較好地鑒別診斷ITP與骨髓衰竭性疾病,并能識別出血風險增加的患者[16]。巴西學者發現,IPF在健康組和ITP組中也存在明顯差異[17]。德國學者用2種血液分析儀測定了IPF用于鑒別ITP與骨髓衰竭性疾病,其中一種儀器具有較好的鑒別能力,另一種儀器則無預測價值。其假設這或許是因為ITP和骨髓衰竭性疾病中存在未成熟血小板重疊的生物現象,現在還不能靠改進的技術方法完全解決[18]。本研究結果表明,血清PGRN水平可作為鑒別ITP與健康兒童、AA的一個可靠指標。

本研究也存在一定局限性：(1)本研究為單中心研究,今后期待納入更多中心的病例進行研究;(2)未對納入病例進行足夠時間的隨訪,未能明確PGRN水平是否與兒童ITP患兒的預后及病程長短相關,將是下一步研究的方向;(3)本研究只納入了ITP和AA,在今后的工作中將研究PGRN用于鑒別ITP與遺傳性血小板疾病、原發性免疫缺陷[19]及其他容易混淆的引起兒童血小板減少的疾病。

總之,兒童ITP患兒血清PGRN水平升高,且PGRN可作為鑒別兒童ITP與健康兒童、AA的一個較好的指標。