基于細胞體外培養篩選最適胎牛血清

游小燕，何琦琳，范驍玲，葛良鵬

1.重慶市畜牧科學院，重慶 榮昌 402460；2.農業農村部養豬科學重點實驗室，重慶 榮昌 402460；3.養豬科學重慶市市級重點實驗室，重慶 榮昌 402460

相對動物模型來說,體外培養的細胞模型排除了遺傳、營養、環境等因素的影響,實驗結果重復性好[1-2],還減少了實驗研究對動物模型的依賴[3-4]．自20世紀50年代以來,胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)作為最常用、最有效的添加物,在世界范圍內被廣泛應用于體外細胞培養[5]．胎牛血清富含血漿蛋白、多肽、激素、生長因子等活性成分,能改變培養基的黏度、滲透壓、緩沖能力等理化性質[6],可促進細胞的生長與增殖[7]．細胞生長的好壞與胎牛血清密切相關,在細胞體外培養過程中,若血清選擇不當,不僅會導致實驗結果不可用,還造成人力、物力等資源的浪費．

胎牛血清是一種成分復雜的混合物,雖然其組份大部分已知,但仍有部分活性物質因濃度低無法檢測或缺乏相關活性物質檢測標準等因素至今仍不清楚[8]．目前尚不能通過檢測胎牛血清活性成分組成與含量直接判斷血清質量好壞,也沒有標準表明某類型細胞適合什么樣的胎牛血清,特別是不同來源的胎牛血清,其補體、內毒素等含量差異較大,會直接影響細胞的生長與死亡,因此不同細胞類別選擇合適的胎牛血清便成為一個重要的問題．本文通過使用不同來源的胎牛血清培養小鼠骨髓瘤細胞(Sp2/0)與豬胎兒成纖維細胞(porcine fetal fibroblasts,PFF),探索細胞系與原代細胞對胎牛血清需求的差異,以期篩選出這兩種細胞的最佳血清,為這兩種細胞模型的研究與應用提供保障．

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞

Sp2/0購自美國細胞培養物收藏中心(ATCC),PFF來源于重慶市畜牧科學院自制的35胎齡榮昌豬胎兒成纖維細胞．

1.1.2 主要試劑

DMEM(Gibco,10829-018),Advanced RPMI 1640(Gibco,12633-012),GLutaMAX (Gibco,35050-061),NEAA (Gibco,11140-050),Sodium Pyruvate (Gibco,11360-070),Pen Step (Gibco,15140-122),FBS1(賽業,特級胎牛血清),FBS2 (BI,04-002-1C),FBS2-1(BI,04-002-1C,2052257),FBS2-2 (BI,04-002-1C,2053268),FBS2-3(BI,04-002-1C,1826596),0.05%胰酶(Gibco,25300-062)．

1.1.3 主要儀器

二氧化碳培養箱,Thermo fisher scientifle;倒置熒光顯微鏡,Leica;細胞計數儀,上海睿鈺生物科技有限公司．

1.2 方法

1.2.1 Sp2/0復蘇及培養

根據胎牛血清來源分別配制含10%FBS,1mmol/L Sodium Pyruvate,1x GLutaMAX,1x NEAA,1x Pen Step的RPMI1640完全培養基．從液氮中取出Sp2/0,38.5 ℃水浴快速解凍,加入預熱的RPMI1640完全培養基5 mL混勻,5 000 r/min 離心5 min,收集細胞．用1 mL預熱的RPMI1640完全培養基重懸細胞,將細胞接種至6孔板內,置于37 ℃,5%二氧化碳培養箱中培養．

1.2.2 PFF復蘇及培養

根據胎牛血清來源和批次分別配制含10%FBS,1mmol/L Sodium Pyruvate,1x GLutaMAX,1x NEAA,1x Pen Step的DMEM完全培養基．從液氮中取出PFF,38.5 ℃水浴快速解凍,加入預熱的DMEM完全培養基5 mL混勻,5 000 r/min 離心5 min,收集細胞．用1 mL預熱的DMEM完全培養基重懸細胞,將細胞接種至6孔板內,置于38.5 ℃,5%二氧化碳培養箱中培養．

1.2.3 Sp2/0細胞克隆培養

Sp2/0生長至65%融合時,用槍頭輕輕吹打細胞,收集細胞,用1 mL預熱的RPMI 1640完全培養基重懸細胞,并利用細胞計數儀進行細胞計數,將細胞按100個/孔,接種至6孔板內,根據血清來源分為2組,每組3個重復孔,6孔板置于37 ℃,5%二氧化碳培養箱中培養．

1.2.4 PFF細胞克隆培養

PFF生長至85%融合時,用0.05%胰酶消化收集細胞,用1 mL預熱的DMEM完全培養基重懸細胞,并利用細胞計數儀進行細胞計數,將細胞按500個/孔,接種至6孔板內,根據血清來源和批次分別分為2組和3組,每組3個重復孔,6孔板置于38.5 ℃,5%二氧化碳培養箱中培養．

1.2.5 細胞克隆觀察與計數

每天用倒置顯微鏡觀察細胞生長情況和克隆大小,在細胞接種培養的第7 d,拍照記錄細胞克隆大小,并在顯微鏡下用記號筆圈出細胞克隆,進行細胞克隆計數．

1.2.6 細胞數量與活率檢測

在細胞接種培養的第10 d,收集細胞,5 000 r/min 離心5 min,用1 mL溫熱的完全培養基重懸細胞,取20 μL細胞樣本與0.2%的Trypan Blue按1∶1混合,取20 μL混合樣本自動檢測細胞濃度與活率,利用細胞計數儀檢測細胞濃度,按照公式換算出細胞數量(N)：

N=D×V

式中,D表示細胞濃度,V表示細胞體積．

1.2.7 統計分析

2 結果與分析

2.1 不同來源血清對細胞生長性能的影響

由表1可知,無論采用國產FBS1還是進口FBS2培養Sp2/0,其細胞克隆數、細胞數量和細胞活率差異均無統計學意義(p>0.05),但進口FBS2培養的PFF,其細胞克隆數、細胞數量和細胞活率顯著高于國產FBS1,差異有統計學意義(p<0.05)．

表1 細胞生長性能測定

2.2 不同批次血清對PFF細胞克隆的影響

PFF細胞培養第7 d,通過倒置顯微鏡可以觀察到：每個批次的血清都有細胞克隆出現,但FBS2-1的細胞克隆明顯小于其他組(圖1和圖2),且FBS2-1的細胞克隆數極顯著低于FBS2-2和FBS2-3(p<0.01),FBS2-2培養的細胞克隆數極顯著低于FBS2-3(p<0.01),但FBS2-2的細胞克隆大．

圖1 培養7 d的細胞克隆

***表示p<0.001,差異有統計學意義．圖2 細胞克隆數統計圖

2.3 不同批次血清對PFF細胞數量的影響

PFF細胞培養10 d,消化收集細胞,利用細胞計數儀檢測細胞濃度,并換算出細胞數量．由圖3可知,FBS2-1培養的細胞數量極顯著低于FBS2-2和FBS2-3(p<0.01),FBS2-3培養的細胞數量極顯著低于FBS2-2(p<0.01)．

2.4 不同批次血清對PFF細胞活率的影響

PFF細胞培養10 d,消化收集細胞,臺盼藍染色,細胞計數儀檢測細胞活率．由圖4可知,FBS2-1培養的細胞活率僅為37.27%,極顯著低于FBS2-2和FBS2-3(p<0.01);FBS2-2與FBS2-3培養的細胞活率差異無統計學意義(p>0.05)．

***表示p<0.001,差異有統計學意義．圖3 細胞數量統計圖

***表示p<0.001,差異有統計學意義．圖4 細胞活率統計圖

3 討論與結論

血清含有人工合成營養液所缺乏的生長激素、生長因子等,為體外細胞培養提供了賴以生存和增殖的物質基礎,參與調控細胞生長、增殖、分化等多種生命活動,被廣泛應用于細胞的體外培養．根據動物品種不同,血清可分為兔血清、馬血清、牛血清等．牛屬于大動物,血清來源較為豐富,根據牛日齡的差異,血清又可分為小牛血清、新生牛血清和胎牛血清,其中胎牛因未與外界接觸,病原微生物少,血液中富含促生長因子,免疫球蛋白和補體因子(如γ-球蛋白)等[9-10]．血清中還含有近1 800種蛋白[11-12],4 000余種代謝物[13],且血清有助于提高培養基的pH緩沖能力,減少細胞因移液、吹打、消化等造成的物理損傷[14]．自Puck等[15]將胎牛血清添加到培養基中以來,胎牛血清已廣泛應用于人、動物以及昆蟲的細胞培養．

在本次研究中,無論采用國產還是進口的胎牛血清培養Sp2/0,其細胞克隆數、細胞數量和細胞活率差異均無統計學意義(p>0.05)．這與李自良等[16]的研究結果相類似．究其原因可能是Sp2/0與MDCK同屬細胞系,部分遺傳物質已發生改變,且帶有癌變的特點,能在體外培養條件下無限制地傳代,對血清的依賴降低,因此能在各類型血清中較好地生長增殖．研究中還發現：進口胎牛血清培養的豬胎兒成纖維細胞,其細胞克隆數、細胞數量和活率均極顯著高于國產胎牛血清(p<0.01)．劉瑞風等[17]利用不同來源胎牛血清培養骨髓間充質干細胞,發現在使用FBS1培養過程中,骨髓間充質干細胞逐漸死亡,而FBS2培養的骨髓間充質干細胞不但能很快貼壁和迅速增殖,而且傳代培養后能保持很強的分裂增殖能力．推測可能是因為豬胎兒成纖維細胞與骨髓間充質干細胞屬于原代細胞,保持了體內的生物學特性．因不同來源胎牛血清,其采集方式與生產加工工藝不同,所含促細胞生長因子等活性物質的組份與比例也有所不同,導致原代細胞的生長、增殖受血清來源影響較大．

不同來源胎牛血清質量差異大,即使同一品牌、同一貨號,因供血動物性別、生理、營養等條件不同,也會存在批次間的差異[18]．本次研究利用豬胎兒成纖維細胞對同一品牌、同一貨號,3個不同批次的胎牛血清進行了測試,結果顯示：FBS2-1形成的細胞克隆小,且細胞克隆數極顯著低于FBS2-2和FBS2-3(p<0.01);培養10 d后,FBS2-1的細胞數量和細胞活率極顯著低于FBS2-2和FBS2-3(p<0.01),雖然FBS2-2的細胞克隆數極顯著低于FBS2-3(p<0.01),但是FBS2-2的細胞克隆大,且細胞數量極顯著高于FBS2-3(p<0.01)．本次實驗篩選出FBS2-2是豬胎兒成纖維細胞的最適血清,可大量采購,為豬胎兒成纖維細胞的培養與應用提供物質保障．