顆粒活性炭固定化菌修復石油污染地下水

孫 娟，魏鵬碩，鄭 瑾，王 寧，宋權威，汪肖洋，李 冉，王子豪，趙朝成，劉 芳，張秀霞

(1.中國石油大學(華東) 化學化工學院，山東 青島 266580；2.石油石化污染物控制與處理國家重點實驗室，北京 102206；3.中國石油集團安全環保技術研究院有限公司，北京 102206)

石油在推動全球工業化進程的同時由于泄漏可導致土壤環境被污染，并在降雨等因素作用下透過包氣帶污染地下水環境，目前已成為地下水中最常見的有機污染物之一[1-4]。據統計，中國現有加油站區地下水已受到不同程度的(占比50%～85%)石油污染[5]，煉油企業附近地下水受到石油污染，可能威脅飲用水安全[6]。因此，必須對污染地下水的石油進行及時、有效的清除。

目前，常用的石油污染土壤地下水的修復方法有地下水曝氣、化學氧化、微生物修復等[1]。其中，微生物修復具有產物無毒無害、經濟合理等優勢，已成為石油污染土壤修復的有效手段[7-10]。土壤中存在能夠降解石油的土著菌，如枯草芽孢桿菌和假單胞菌等[11-12]。但是，地下水環境與土壤差異明顯，地下水流動極易導致游離菌流失，從而影響微生物的修復效果[13]。而固定化微生物技術通過將微生物負載于固定化載體上，可以使微生物保持一定的密度和活性[14]，比游離菌具有更高的環境耐受性[15-19]，成為地下水生物修復研究的熱點。微生物固定化載體有聚氨酯泡沫、聚乙烯醇、海藻酸鈉和活性炭[20]等。固定化方法主要有吸附法、包埋法和共價交聯法等[21]。其中，共價交聯法一定程度上會抑制微生物活性，聚合物包埋法制備成本較高且力學穩定性差異較大，限制其應用[22]。利用活性炭等多孔載體吸附固定化，結合力會相對較弱，但其成本低，如活性炭價格僅為8～10元/kg，遠低于海藻酸鈉、殼聚糖等固定化包埋劑的價格；易操作且載體機械強度高，孔道結構利于氧氣、代謝物擴散，對微生物無毒性[23]，是實際應用最廣泛的固定化方法之一。但目前仍缺少活性炭固定化微生物修復石油污染地下水的系統研究，因此筆者選用前期研究篩選的具有良好吸附性能的椰殼活性炭作為微生物固定化載體[24-28]，并對其修復效能、作用條件和作用機理進行探討，為該顆粒活性炭固定化菌直接投加用于低溫地下水環境中的石油污染物高效去除提供理論依據。

1 實驗部分

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗油樣品

實驗油樣品采用市售0#柴油和委內瑞拉原油；實驗用地下水采集自煉油廠附近未受污染的天然地下水；模擬油污水樣品是通過將一定質量的原油/柴油直接加入裝有100 mL滅菌地下水的錐形瓶中進行配置并封口保存；油污土壤取自東營某煉油廠0～50 cm層土壤樣品，去除植物根系和石塊后經2 mm尼龍篩過篩備用。活性炭為市售椰殼活性炭(40～60目)，用去離子水沖洗6～8次，洗去炭黑等雜質后于105 ℃烘干后裝瓶備用。實驗用油樣品及地下水理化性質分別見表1、表2。

表1 實驗油樣品的性質

表2 實驗用地下水主要性質

1.1.2 培養基

(1)牛肉膏蛋白胨液體培養基：NaCl 10 g/L，牛肉浸膏5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，pH值 7.0；

(2)牛肉膏蛋白胨固體培養基：NaCl 10 g/L，牛肉浸膏5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，瓊脂15 g/L，pH值7.0；

(3)原油馴化培養基：NaCl 10 g/L，牛肉浸膏5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，原油10、15、20 g/L，pH值 7.0。

1.2 實驗方法

1.2.1 石油降解菌的篩選、鑒定和復配

取5 g油污土于滅菌蒸餾水中，在30 ℃、轉速160 r/min下振蕩6 h，靜置30 min，取上清液加入液體培養基中，于30 ℃、轉速160 r/min下富集24 h。每次加2 mL富集液分別至3個濃度梯度的原油馴化培養基中，每梯度在30 ℃、轉速160 r/min條件下培養7 d。取2 mL已完成馴化的微生物培養液加入到新鮮液體培養基中培養24 h，稀釋涂平板，分離純化多次至得到單個純菌落。經16SrDNA種屬鑒定，6株單菌分別為銅綠假單胞菌屬(Pseudomonasaeruginosa)HL、克羅諾桿菌屬(Cronobacter)ZH、炭疽芽孢桿菌屬(Bacillusanthracis)DF、沙門氏菌屬(Salmonellasp.)L4、肺炎克雷伯菌屬(Klebsiellapneumoniae)D1和N3。對富集菌液用稀釋涂布法計數，繪制菌懸液在600 nm處的光密度(OD600)對應的微生物數量的標準曲線。以降油性能最佳的HL菌與其它單菌復配各菌群P，復配菌群各單菌添加量如表3所示。

表3 復配菌群各單菌添加量

1.2.2 固定化菌的制備及活性炭固定菌量測定

取適量椰殼活性炭于100 mL液體培養基中，滅菌冷卻后加入4 mL菌液于轉速160 r/min、15 ℃恒溫振蕩箱中分別固定6、12、18、24、30、36 h，測定上清液OD600值，相同條件不加活性炭為空白樣對照。固定化穩定后，于轉速1000 r/min離心10 min，過濾舍去上清液，用生理鹽水清洗3次，將離心所得沉淀真空冷凍干燥，即得固定化菌[9，29]；采用掃描電子顯微鏡觀察活性炭固定化菌結構。按照式(1)計算單位質量活性炭固定菌量(Γ，cell/g)。

(1)

式中：m為活性炭質量，g；V為菌液體積，mL；c1、c2為固定前后的菌濃度，cell/mL。

1.2.3 地下水中石油去除率測定

將4 mL降油菌液或者一定質量的固定化菌加至用100 mg石油和100 mL地下水模擬的含油地下水中，于15 ℃、轉速120 r/min的恒溫振蕩箱中反應7 d后，按照式(2)計算石油去除率(η，%)。

(2)

式中：ρ0、ρe分別表示加入菌液或固定化菌進行修復前、后地下水中的石油質量濃度，mg/L。

采用紫外分光光度計法測定地下水中石油質量濃度，原油和柴油的標準曲線方程分別如式(3)和(4)所示。

ρ01=0.0189x+0.0068

(3)

ρ02=0.0184x+0.0088

(4)

式中：ρ01為原油標準曲線中對應油質量濃度，mg/L；ρ02為柴油標準曲線中對應油質量濃度，mg/L；x為吸光度，abs。

前期實驗測得所用柴油溶解度為40 mg/L，原油溶解度為10 mg/L，石油在水中被降解前多以浮油形態存在，采用石油醚多次萃取后測得萃取率可達80%，設置空白樣對照，降低實驗過程中轉移、萃取損耗誤差，計算石油去除率。采用單因素實驗探究不同條件下固定化菌對地下水中石油的去除率。考察因素有：固定化菌投加量(0.5～3.0 g/L)，油質量濃度(500～3000 mg/L)，pH值(4～10)，溫度(15、30 ℃)。

1.2.4 含油地下水表征分析

對含油地下水分別采用單一活性炭、游離菌和固定化菌修復7 d后，采用Zeta電勢/動態光散射儀(Zetasizer Nano ZS型，英國馬爾文儀器有限公司產品)和激光粒度儀(Zetasizer Nano ZS90型，英國馬爾文儀器有限公司產品)分別測定地下水的Zeta電位及地下水中的油滴分散粒徑[30]；采用氣相色譜-質譜儀(7890A-5975C型，美國安捷倫科技有限公司產品)對含油地下水中不同石油烴類組分進行定性和定量分析[24]。

1.2.5 高通量測序

冷凍干燥后的固定化菌樣品經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提基因組DNA，為確保樣本的微生物群落得到充分提取，對16SrDNA基因片段進行了擴增和測序，其中16S引物序列為27F(AGAGTTTGATCMTGGCTCAG)和1492R(TACGGYTACCTTGTTACGACTT)。聚合酶鏈式(PCR)反應條件為：預變性，95 ℃，5 min；變性，95 ℃，30 s；退火，55 ℃，30 s；延伸，72 ℃，1 min。重復變性到延伸流程進行35個循環，最終以72 ℃為修復延伸溫度進行10 min，采用Illumina MiSeq平臺對樣品微生物群落DNA片段進行雙端測序。最后使用QIIME軟件，獲取樣品在各個分類水平上的群落結構組成[9，31]。

2 結果與討論

2.1 微生物對地下水中石油的去除率

篩選出的6株單菌及其復配菌在15 ℃下通過生物降解對地下水中石油的去除率如圖1所示。由圖1(a)可以看出，銅綠假單胞菌屬(Pseudomonasaeruginosa)HL菌株石油去除率最高，為18.56%，且由排油圈實驗得出HL菌株發酵液分散油膜的能力最佳，表明其產表面活性劑能力更強，在降解石油的過程中發現其可將石油乳化為細小的油滴，可促進對石油的降解。其他菌株對石油的去除率為8.20%～11.97%。由圖1(b)可以看出，PseudomonasaeruginosaHL菌和Salmonellasp.L4菌復配菌群P5(HL/L4體積比為1∶1)對地下水中石油的去除率最高，為21.33%。復配菌液由于微生物之間存在協同與拮抗作用導致生物降解率升高或降低[31]，一定油濃度下復配菌種太多會由于競爭造成生物降解率明顯降低，如P10。

HL—Pseudomonas aeruginosa；N3—Klebsiella pneumoniae；ZH—Cronobacter；DF—Bacillus anthracis；D1—Klebsiella pneumoniae；L4—Salmonella sp.；P1—P10—Ten different compound flora

2.2 固定化菌的表征結果

游離菌經活性炭吸附固定不同時間后測定上清液OD600值，相同條件不加活性炭為空白樣對照，以二者OD600差值(ΔOD600)隨固定時間的變化表征固定菌量的變化趨勢(見圖2 (a))。活性炭吸附固定菌會導致上清液菌密度降低，OD600值減小，與空白樣間OD600差值會增大，圖中隨著固定化時間在1～6 h增加，ΔOD600增大，說明活性炭固定化菌量快速增加，6～30 h時出現脫附現象，脫附平衡后固定菌量再次上升，第6 h和第36 h時的ΔOD600相近。因此，6 h時活性炭固定菌量已達最大值，但由于固定時間較短，作用力較弱，隨即出現脫附現象，隨著固定時間的延長，活性炭固定化微生物在36 h時達到較穩定狀態并在12 h內基本不再發生脫附現象。因此將活性炭在15 ℃時固定化微生物的最佳時間確定為36 h。

圖2 活性炭固定化菌上清液OD600差值(ΔOD600)隨時間的變化及活性炭吸附前后SEM照片

椰殼活性炭具有蜂窩狀排列的孔結構，且孔內部有規則褶皺，利于微生物附著(見圖2(b))。在筆者之前的研究中已測得該椰殼活性炭O/C和(O+C)/C質量比要小于其他活性炭，炭化程度高，極性低，疏水性強[24]，固定微生物后確定活性炭褶皺表面分布有桿狀菌(見圖2(c))。雖然加入2種單菌的體積比為1∶1，但不能保證活性炭按此比例固定化菌體，因此對活性炭固定化菌進行高通量測序，分析活性炭固定化2種單菌的比例，假單胞菌(Pseudomonadaceae)占59.98%，而沙門氏菌(Salmonellasp.)占40.02%，固定化菌量約為1.18×1011cell/g。

2.3 固定化菌對地下水中石油的去除效果

2.3.1 固定化菌投加量對地下水中石油去除率的影響

固定化菌投加量對地下水中石油去除率的影響結果如圖3所示。地下水中原油和柴油去除率均隨固定化菌投加量增加而增大。當固定化菌投加量由0.5 g/L增大到1.0 g/L時，原油去除率由58.06%增加至83.63%，柴油去除率由52.15%增加至75.20%；繼續增加菌投加量，地下水中2種油的去除率增速均變緩。這是因為在一定范圍內，隨著活性炭固定化菌投加量的增大，活性炭上的吸附位點和固定化的微生物量均增多，而且地下水體系供給微生物生長繁殖的營養充足，所以被吸附和降解的油量均增加；繼續增加固定化菌投加量，微生物由于數量增加可能產生競爭和抑制，且水中油濃度已經降至較低，所以單位固定化菌對石油的吸附量和降解量均出現增長緩慢甚至下降趨勢[24]，使整體去除率增長緩慢。因此，活性炭固定化菌最佳投加量為1.0 g/L。

圖3 固定化菌投加量對石油去除率(η)的影響

2.3.2 油質量濃度對地下水中石油去除率的影響

固定化菌投加量為1.0 g/L時對地下水中原油和柴油的去除率隨水中油質量濃度的變化如圖4所示。由圖4可以看出，隨著油質量濃度的增加，活性炭固定化菌對2種油的去除率均出現先增大后減小的趨勢。當油品質量濃度由500 mg/L增加至1000 mg/L時，原油去除率由74.78%增加到85.02%，柴油去除率由68.53%增至74.05%；隨著油質量濃度繼續升高，地下水中油去除率降低。這是因為一定量的活性炭固定化菌能提供的吸附位點和菌量一定，當地下水中油質量濃度不高時，油質量濃度的增加可以促進菌株生長，從而提高油的去除率[32]；但當地下水中油質量濃度過高時，油主要以浮油形態存在，在水中的分散度降低，浮于水面的固定化菌吸附位點不足，活性炭吸附作用變弱，且較高的油質量濃度對活性炭上的菌群存在一定的毒害作用[33]，抑制菌株生長繁殖，因此油的總體去除率降低。

圖4 不同油質量濃度(ρ)條件下活性炭固定化菌對地下水中石油的去除率(η)

2.3.3 pH值對地下水中石油去除率的影響

在固定化菌投加量1.0 g/L、油質量濃度為1000 mg/L條件下，活性炭固定化菌對地下水中石油的去除率隨地下水pH值的變化如圖5所示。由圖5可以看出：在pH值為7時，活性炭固定化菌對地下水中原油、柴油的去除率最高，分別為84.96%和74.53%；當pH值小于7時，固定化菌對地下水中石油的去除率與pH值呈正相關；當pH值大于7時，石油去除率隨pH值的升高而降低。這是因為在中性條件下固定化菌活性最高，對地下水中石油去除率最高；而在高pH值下固定化菌表面存在大量負電荷，導致其與油滴之間的靜電排斥作用增強，吸附量變低[9，34-35]。因此，活性炭固定化只能在一定程度上降低外部環境對微生物的不良影響，酸堿度相對過高時固定化菌對地下水中石油的去除率仍然會降低。

圖5 不同地下水pH值條件下活性炭固定化菌的石油去除率(η)

2.3.4 溫度對地下水中石油去除率的影響

在固定化菌投加量1.0 g/L、油質量濃度1000 mg/L、pH值為7條件下，活性炭固定化菌對地下水中2種油的去除率隨溫度的變化如表4所示，并與相同條件下含相同菌量的復配游離菌、相同質量的活性炭的去除效果進行比較。由表4可以看出，固定化菌對地下水中原油在溫度為15、30 ℃時的去除率分別為85.02%和85.27%，對柴油去除率分別為74.53%和75.20%。這是因為隨著溫度由15 ℃升高到30 ℃，游離菌活性增強，通過微生物對地下水中油的生物降解導致原油、柴油的去除率分別增加14.09、13.83百分點；而升溫降低了油的黏度引起活性炭吸附容量降低[35]，活性炭對地下水中油的吸附作用降低，造成原油、柴油的去除率分別降低9.66、12.43百分點；因此整體表現為固定化菌對地下水中原油、柴油的去除率僅分別增大0.25、0.67百分點。

表4 不同溫度(T)條件下地下水中石油去除率(η)

溫度為15 ℃時，游離復配菌通過生物降解對地下水中原油去除率為23.82%，活性炭通過吸附作用對原油去除率為70.26%，固定化菌對地下水中原油去除率為85.02%，固定化菌相比游離菌提高61.2百分點。可見，活性炭的吸附固定作用為固定化菌除油的關鍵環節。由于該椰殼活性炭對2種油的吸附均可在數小時達到平衡[24]，因此，活性炭固定化菌可通過快速吸附、緩慢降解最終去除地下水中的石油。

綜上所述，活性炭固定化菌在不同溫度下對2種油均具有很好的去除效果。

2.4 含油地下水表征分析結果

2.4.1 Zeta電位及油滴粒徑

含油地下水中分別加入活性炭、游離復配菌及活性炭固定化菌的Zeta電位及分散油滴平均粒徑如表5所示。由表5可以看出，含原油地下水加入固定化菌后Zeta電位由-31.17 mV降至-5.29 mV，絕對值降至最低，且其油滴平均粒徑最小，為1.17 μm。這說明固定化菌在處理原油污染地下水時，更有利于原油以小粒徑分散的油滴存在[36]，而不是以大片的油膜存在于地下水中，從而使地下水中的油更容易與微生物接觸而被降解。與原油相似，柴油經活性炭固定化菌處理后Zeta電位由-28.13 mV降至-17.07 mV，油滴平均粒徑為3.45 μm。這說明在微生物作用下，柴油以細小粒徑的分散油滴狀態存在，有利于其與微生物接觸而被降解。

表5 添加不同物質對石油污染地下水Zeta電位及分散油滴粒徑的影響

2.4.2 烴類組分表征結果

氣相色譜-質譜分析結果顯示柴油和委內瑞拉原油中正構烷烴主要是n-C9～n-C33，多環芳烴(PAHs)則主要有萘、菲、芴、蒽、芘和二苯并噻吩等。地下水中的原油和柴油分別經活性炭、游離菌和固定化菌修復后各烴類組分含量均有不同程度的降低(見圖6)，固定化菌對地下水中的石油烴組分具有很好的吸附、降解作用。

N—Naphthalene；P—Phenanthrene；A—Anthracene；PY—Pyrene；D—Dibenzothiophene；F—Fluorene；C—Chrysene

對于原油，活性炭固定化菌對n-C9～n-C33有明顯的去除作用，修復后正構烷烴組分含量最低(見圖6(a1))；而對于柴油，游離菌降解后正構烷烴組分含量最低(見圖6(b1))，這可能是由于游離菌對柴油有更好的分散作用。從圖6(a2)可以看出，活性炭吸附以及固定化菌修復均對地下水中原油多環芳烴具有很好的去除作用。經計算，活性炭、游離菌和活性炭固定化菌分別去除了原油中31.08%、44.98%、63.84%的正構烷烴和68.37%、48.81%、84.65%的多環芳烴，分別去除了柴油中12.72%、45.63%、25.76%的正構烷烴和64.38%、58.74%、64.33%的多環芳烴。固定化菌對原油中正構烷烴和多環芳烴的去除率比游離菌分別提高18.86和35.84百分點。因此，活性炭固定化顯著提高了降油菌群對地下水中烴類組分尤其是多環芳烴組分的去除率。

3 結 論

(1)通過批量實驗從油污土壤中篩選出高效降油菌銅綠假單胞菌屬(Pseudomonasaeruginosa)HL與沙門氏菌屬(Salmonellasp.)L4菌株復配，在溫度15 ℃、轉速120 r/min條件下通過生物降解對初始油濃度為1000 mg/L的地下水中原油去除率為21.33%；采用吸附法固定于椰殼顆粒活性炭，固定化菌量為1.18×1011cell/g。

(2)固定化菌在溫度15 ℃時，固定化菌投加量1.0 g/L、油質量濃度1000 mg/L、pH值為7的最優條件下對低溫地下水中原油和柴油的去除率分別為85.02%和74.53%；對原油污染地下水中的正構烷烴和多環芳烴的去除率比游離菌分別提高18.86和35.84百分點。

(3)固定化菌通過快速吸附地下水中的石油，增加微生物和石油之間的接觸，從而增加微生物對溢油的降解和地下水中石油的去除率，對于低溫條件油污地下水的修復是一種經濟、高效又低碳的處理方式。