耐鹽反硝化菌屬富集培養研究

楊宏 吳文元 趙廣澤

（北京工業大學城市建設學部 北京 100124）

0 引言

高鹽對生物脫氮技術有著很大的影響，反硝化細菌作為細胞結構本身會受到滲透壓的影響，而且高鹽會抑制細菌的正常生長代謝，導致細菌脫氮能力降低甚至消失。在現有的工業生產中，像皮革生產、化肥制造、垃圾填埋、采油等行業產生的廢水為高鹽廢水［1］，用一般的活性污泥法進行處理時，細菌活性必然會受到抑制。DINCER 等［2］研究了鹽度對反硝化脫氮的影響，發現NaCl 濃度從0 提升至60 g/L 時，NO3--N 的去除率下降為原來的30%，可見鹽度對反硝化速率影響較大。反硝化細菌不是某一種細菌，而是具有反硝化能力的細菌集合。目前所知的反硝化細菌大約有50 多個屬，130 多個種［3］，其中也包括一部分嗜鹽菌，這部分反硝化菌可以在相對較高的鹽度下高效地發揮反硝化作用。有研究表明鹽單包菌（Halomonas）因產生滲透壓補償溶質而具有適應高鹽環境的能力，是中度嗜鹽菌的典型菌屬［4］。那么如何富集培養耐鹽反硝化細菌成為本次討論的重點。

本研究以實驗室初期篩選污泥為接種污泥，采用SBR 培養方式，探究污泥富集培養過程中污泥濃度、污泥量、反硝化速率等的變化規律，并結合高通量測序技術探究富集培養過程中菌群結構的變化，最終找出培養方案的不足并提出改進措施，以尋求高效可行的污泥培養方案。

1 材料與方法

1.1 接種污泥

污泥最初取自北京某污水處理廠回流污泥，經過1 個月左右的篩選培養，污泥的菌群結構發生了較大變化，其中反硝化菌屬以固氮弓菌屬（Azoarcus）為主，占比21.28%，Halomonas（12.4%）次之。本實驗將該污泥作為接種污泥。

1.2 實驗原水

實驗中發酵罐的體積為3 000 L，容積較大，故采用高濃度低流量進藥的方式。為了延長配藥周期，配制接近飽和的硝酸鹽原水，將碳氮比控制為3.3 左右，并加入微量元素［8］，以達到最佳的富集培養效果。具體配比見表1。

表1 實驗原水營養鹽配比

1.3 反應裝置

發酵罐實驗室反應裝置示意圖見圖1。

圖1 發酵罐裝置圖

如圖1 所示，污泥富集培養的主體裝置為3 000 L 的發酵罐，并設有pH、溫度在線監測儀表，攪拌裝置，水浴加熱裝置等。通過PCL 自控設備控制發酵罐內pH 為8.0～8.5 之間，溫度控制在25～30 ℃之間。設有懸浮標尺用以計算發酵罐內混合液體積。罐體下端設有取泥口，中間部分設有取樣口，便于監測污泥的增長狀態。

1.4 運行工況

反硝化細菌的培養采用SBR 運行方式，分為反應、靜置、排水、進水4 個階段。攪拌強度視污泥濃度而定，一般設為13～20 r/min。

（1）反應：根據上階段的反硝化效率，確定本階段的進藥流量；運行時硝酸鹽的積累量維持在20～30 mg/（L·h）。

（2）靜置：根據反應速率和硝酸鹽、亞硝酸鹽的積累量，確定攪拌停止時間，再靜置30～60 min，待上清液清澈后，便可排水。

（3）排水：排水過程中為了防止污泥的流失，用潛水泵將上清液抽走。要避免水流攪動導致污泥浮動，確定污泥不流失的最低排水液面。

（4）進水：將事先配制好的高濃度硝酸鹽原水以流加的方式加入發酵罐，通過計量泵調節進水流量，使之與反硝化速率匹配。

1.5 分析項目及檢測方法

實驗過程中涉及到檢測指標包括：NO2--N、NO3--N、COD、混合液懸浮固體濃度（MLSS）、揮發性有機物濃度（MLVSS）、pH 和溫度等，均采用標準監測方法進行測定［5］。樣品處理前每個水樣都經過0.45 μm 濾膜的預處理，避免水樣中游離細菌及固體懸浮物的影響。為保證檢測真實有效，每個水樣均保證一式三份進行檢測。此外，采用16S rRNA 高通量測序技術對反硝化污泥中微生物菌群的多樣性及菌群結構進行分析［6］，以探究反硝化菌群結構的適應性變化。

2 結果與討論

2.1 富集培養過程中污泥的增長情況分析

如圖2 所示為反硝化污泥穩定富集培養階段的相關數據，污泥培養采用SBR 模式周期運行，圖中1～4 d（Ⅰ），5～8 d（Ⅱ），10～13 d（Ⅲ），14～17 d（Ⅳ），18～21 d（Ⅴ），22～24 d（Ⅵ）分別對應1 個運行周期。結合相關數據，就污泥濃度、MLSS、MLVSS 進行如下分析。

圖2 富集培養過程中MLSS、MLVSS 污泥濃度的變化情況

2.1.1 污泥濃度分析

如圖2 所示，在Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ3 個運行周期中，污泥濃度逐漸增大。需要說明的是，圖中的污泥濃度數值為不同體積下的實測值，說明在這3 個階段運行過程中，污泥增長迅速。對比Ⅱ、Ⅴ、Ⅵ3 個周期，污泥濃度在周期內呈現下降趨勢。不同的是Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ周期污泥濃度的基數相對較低，為7 000～14 000 mg/L之間，說明這個濃度范圍內更有利于污泥的增長。當污泥基數＞15 000 mg/L 時，污泥的比增長速率降低了。該結論與張鑫等［7］、何海超等［8］的研究結果相符。導致這種現象的原因可能是由于菌群密度較大，限制了污泥的生長。一方面，在高菌群密度情況下，反硝化速率較高，代謝產物分泌旺盛，再加上SBR 運行模式會導致代謝產物的大量積累，代謝產物中存在有害物質，限制了細菌的增長；另一方面，菌群之間會存在競爭生長，造成了環境容量限制。

2.1.2 MLSS 相關分析

有關MLSS 分析從兩方面展開，首先是運行周期內MLSS的變化。由圖2 中MLSS 增長曲線可以看出，在Ⅱ、Ⅴ、Ⅵ3 個周期中曲線的變化大致相同，整體呈現增長趨勢但是斜率越來越小，說明污泥的增長速率減慢，說明當污泥濃度＞15 000 mg/L時不利于污泥增長。而在Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ3 個周期中，MLSS 不僅整體呈現上升趨勢而且斜率也有所上升。如圖2 所示，在第2、12、15 天對應的斜率較大，此時的污泥比增長速率最大，這3 d對應的污泥濃度均在11 000～13 000 mg/L 之間，這與2.1.1 小節關于污泥比增長速率的分析存在交集，最終確定污泥比增長速率的最大值在12 000 mg/L 左右。其次是周期間的分析，在第14、18、22 天均存在MLSS 減少的情況，這是由于排水階段有污泥損失，第14 天減少MLSS 大約為4 000 g，第18、22 天減少量約為6 000 g，說明污泥濃度越大，污泥損失量越大。造成該現象的原因一方面是由于污泥濃度較大，可以允許排水的最低液位沒有及時做出調整，導致排水過程中泥面受到水力攪動，部分污泥隨之排出；另一方面，發酵罐中如果存在硝酸鹽的積累，會在靜置沉淀過程中反應，再加上發酵罐中鹽度較大，細菌多以絮體的形式存在［9］，液體較為渾濁黏稠，產生的氣體不易從絮體表面脫落，致使絮體密度降低，污泥上浮，導致細菌流失。

2.1.3 MLVSS 相關分析

實驗過程中對MLVSS 進行檢測，以此來反映污泥中有機物占比，間接反映出菌量。如圖2 所示，每個時間點對應的MLSS-MLVSS 為無機物的量。令A=MLSS-MLVSS，在每個運行周期內，A 值都呈現增大趨勢，產生這個現象的原因是運行過程中存在鹽度積累。由于發酵罐容積較大，采用高濃度進水的方式，進水中除了一些有用的營養鹽被細菌消耗掉之外，還有一些其他離子，如鈉離子、鉀離子等，這些離子會在發酵液中積累，因此鹽度每個周期內都會增加。第9 天時取泥，并對罐中污泥進行清洗，降低鹽度，所以第10 天時A 值較小，伴隨反應的進行A 值增大，對應的鹽度也越來越高。趙凱峰等［9］表明，污泥容積指數（SVI）隨著鹽度的升高而降低，與本實驗所得結論一致。6 個周期間，每個周期MLVSS 的量幾乎一致，也就是說在這6 個周期，雖然持續進藥，但MLVSS 沒有升高。這主要是由于SBR 運行模式下，細菌損失造成的。

2.2 反硝化速率的變化規律

污泥培養馴化階段硝化速率變化曲線見圖3。

圖3 污泥培養馴化階段反硝化速率變化曲線

如圖3 所示，污泥的反硝化速率呈現穩定的上升趨勢，第24 天時，反硝化速率達到300 mg/（L·h）。在第9 天時，反硝化速率有一個明顯的降低，一方面是取泥導致污泥量減少，從而使得整體反硝化速率降低；另一方面是由于洗泥造成的，自來水水溫較低并且水中含有少量余氯，會使得反硝化細菌活性受到抑制。結合比反硝化速率來看，倘若只是污泥減少導致的反硝化速率降低，那么比反硝化速率不會降低，然而實際比反硝化速率降低了，說明是兩者綜合作用的結果。實驗中比反硝化速率是以MLVSS 為基礎計算出來的，比反硝化速率呈現穩步上升的趨勢，最高可達到65 mg N/（g MLVSS·h），結合高通量測序可知是由于菌群結構發生了較大變化，優勢菌群為鹽單胞菌（Halomonas），占比57.79%，該菌可以在較高的鹽度下高效地發揮反硝化作用。

2.3 微生物群落多樣性分析

2.3.1 菌群多樣性分析

培養前后樣本菌群結構多樣性變化見表2。

表2 培養前后樣本菌群結構多樣性變化

實驗過程中，為探究培養過程中污泥菌群結構的變化，進行了高通量跟蹤測定，第1 天與第24 天進行取樣，分別命名為D1、D2。如表2 所示，D1 的Shannon 指數為4.33，大于D2的Shannon 指數，并且D1 的Simpson 指數低于D2 Simpson 指數，說明D1 的多樣性大于D2，也就是說運行24 d 后，菌群多樣性降低了。這主要是由于富集培養過程中條件（溫度、pH、底物類型等）單一，只有某幾種微生物在適宜的環境下生長，其他更多的微生物受到限制，從而降低了菌群多樣性。

2.3.2 優勢菌群結構分析

D1、D2 樣本微生物菌群結構（門水平）見圖4，D1、D2 樣本中微生物種類及占比情況（屬水平）見圖5。

圖4 D1、D2 樣本微生物菌群結構（門水平）

圖5 D1、D2 樣本中微生物種類及占比情況（屬水平）

如圖4 所示，在門水平上，D1、D2 樣本沒有較大差異，都以Proteobacteria 為主，在D1、D2 樣本中分別占比85.7%、86.58%，LIAO 等［10］稱大多數的反硝化細菌屬于Proteobacteria菌門。其他菌門占比較低，應該是由于單一環境下，其他菌門細菌的生長受到限制。

如圖5 所示，在屬水平上，D1 的反硝化菌屬以Azoarcus（21.28%）為主，Halomonas（12.4%）次之，經過了24 d 的富集培養后，D2 的Halomonas 樣本占比57.79%，Azoarcus 占比降至7.95%。有報道稱Halomonas 菌屬可以在高鹽環境中進行高效的反硝化作用，并且對于亞硝酸鹽具有很強的耐受能力和還原能力［11-13］。物競天擇，適者生存，對于微生物而言亦是如此。可見該培養模式下，可以富集培養高效的耐鹽反硝化細菌。

3 結論

（1）當污泥濃度超過15 000 mg/L 時，污泥的增長速率會下降。要想實現污泥的連續生產培養，污泥濃度應控制在12 000 mg/L 左右，以獲得最大的污泥增長率。

（2）高濃度進藥的培養方式會導致鹽度積累，導致污泥容積指數（SVI）降低，無機組分含量升高。

（3）SBR 運行模式會存在污泥流失的風險，在培養過程中應注意把握好污泥沉降性、沉淀時間和允許排水最低液面三者之間的關系。

（4）富集培養過程中反硝化速率增長較快，比效率最高可達到65 mg N/（g MLVSS·h），并且菌群結構在培養過程中因鹽度積累發生變化，形成了以Halomonas 為主的耐鹽反硝化污泥。