四逆湯通過自噬途徑對膿毒癥大鼠左心室功能的影響?

江四華，代卓青，劉 田，宋國林

1 貴州中醫(yī)藥大學(xué)，貴州 貴陽 550000； 2 貴州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，貴州 貴陽 550003

膿毒癥是指因宿主對感染的反應(yīng)失調(diào)進(jìn)而導(dǎo)致危機(jī)生命的器官功能障礙。流行病學(xué)調(diào)查顯示，膿毒癥心功能不全者病死率達(dá)70%～90%［1-3］。四逆湯源自《傷寒論》，由炙甘草、附子及干姜組成，四逆湯具有強(qiáng)心擴(kuò)冠、抗休克、改善心肌能量代謝障礙、調(diào)節(jié)免疫等作用［4-5］。自噬是細(xì)胞自我吞噬，將壞死的蛋白質(zhì)、殘留的細(xì)胞器、細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌病毒進(jìn)行降解和回收的一個循環(huán)過程。有研究［6］發(fā)現(xiàn)，在膿毒癥的病理生理過程中可以觀察到自噬水平發(fā)生變化，自噬在膿毒癥心功能障礙的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色，目前對自噬的檢測主要推薦LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、P62/SQSTM1等蛋白指標(biāo)。

1 材料

1.1 動物SPF 級SD 大鼠，雌性，體質(zhì)量200～250 g，由湖南長沙市天勤生物技術(shù)有限公司提供，動物實(shí)驗(yàn)合格證號：SCXK（湘）2014-0011。檢疫后送貴州中醫(yī)藥大學(xué)花溪校區(qū)動物試驗(yàn)中心飼養(yǎng)。

1.2 主要試劑6-氨基-3-甲基嘌呤（批號：5152-23-4）、一抗（批號：bsm-33309m）均由鼠抗MCE 公司提供。二抗：山羊抗兔IgG（北京中杉公司，批號：ZB-2301）。中藥材產(chǎn)地：制白附子四川、干姜貴州、甘草甘肅；制白附子、干姜由貴陽濟(jì)仁堂中藥飲片廠提供，甘草由四川千方中藥股份有限公司提供。

1.3 主要器材Vevo 2100 心臟超聲機(jī)（Visualsonics）。

1.4 中藥制備四逆湯中附子（先煎）45 g，干姜27 g，甘草18 g，按照5∶3∶2比例配置，加水500 mL，煎煮150 mL（藥物濃度0.5 g/mL）［7-8］。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 大鼠膿毒癥模型制備方法［9］采用盲腸結(jié)扎穿刺法造模。大鼠腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛（3.5 mL/kg）麻醉成功后將SD 大鼠仰面固定在鼠板上，沿腹壁正中（3 cm×3 cm）處刮毛、消毒、鋪巾，腹壁正中切開2 cm，拉出盲腸后在盲腸總長度50%處結(jié)扎，用國產(chǎn)25 號針頭在結(jié)扎線下5 mm處貫穿盲腸1次，造成2個漏口，回納盲腸后關(guān)腹，術(shù)后皮下注射生理鹽水（5 mL/100 g）復(fù)蘇。造模成功標(biāo)準(zhǔn)：大鼠出現(xiàn)精神萎靡不振、豎毛、嗜睡、眼鼻滲血、拉稀等膿毒癥表現(xiàn)。見圖1。

圖1 SD大鼠造模情況

1.5.2 分組與給藥 將150 只SD 大鼠隨機(jī)選取30 只作為空白組，其余120 只按盲腸結(jié)扎穿刺法造模，將造模成功90 只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表方法分為實(shí)驗(yàn)組、對照組、阻斷組各30 只。再將每組隨機(jī)分為8、16、24 h各10只。

實(shí)驗(yàn)組按1 mL/100 g 灌胃四逆湯，每隔8 h灌胃1 次（如取材時間與服藥時間重復(fù)，則服藥時間提前2 h）。空白組、對照組：按1 mL/100 g 灌胃生理鹽水，每隔8 h 1 次。阻斷組：四逆湯灌胃劑量、方法同實(shí)驗(yàn)組，再按15 mg/kg 腹腔注射3-MA［10］。

1.5.3 心臟超聲數(shù)據(jù)采集 將SD 大鼠腹腔內(nèi)注射10%水合氯醛（3.5 mL／kg）麻醉成功后使用電動剃毛刀刮去SD 大鼠胸前區(qū)（8 cm×8 cm）毛發(fā)，再涂上脫毛膏，3～5 min 后用紗布擦凈脫毛膏，并將SD 大鼠固定在鼠板上，使胸前區(qū)充分暴露于心臟探頭下，打開Vevo 2100 心臟超聲機(jī)，使用心臟探頭檢測大鼠8、16、24 h心臟不同切面數(shù)據(jù)。評價左心室收縮末期容積（left ventricular end systolic volume，LVESV）、左心室舒張末期容積（left ventricular end diastolic volume，LVEDV）、心輸出量（cardiac output，CO）、左心室射血分?jǐn)?shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF）。

1.5.4 心肌自噬蛋白P62、LC3-I、LC3-Ⅱ檢測 分別于干預(yù)8、16、24 h 取出各組大鼠心肌組織，采用BCA 法進(jìn)行蛋白定量分析，每孔取50 μg 蛋白上樣，經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，采用濕式電轉(zhuǎn)移法將目的蛋白轉(zhuǎn)移至PCDF 膜上，5%脫脂奶粉溫室封閉4 h，洗膜后加入一抗（稀釋1∶1000）室溫下3 h。再次洗膜，加辣根過洗膜后于暗室內(nèi)加入顯影劑并曝光掃描，采用凝膠成象系統(tǒng)分析圖象（Blo-RAO Gel Doc 2000），計算光密度值（OD值），重復(fù)3次。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 22.0 軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以表示，采用單因數(shù)方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LVEDV、LVESV、CO與LVEF1）干預(yù)8 h：LVEDV、LVESV、CO、LVEF 實(shí)驗(yàn)組均高于對照組（P＜0.05）；對照組與阻斷組比較，LVEDV 無顯著性差異，LVESV、CO 低于對照組（P＜0.05），LVEF高于對照組（P＜0.05）。2）干預(yù)16 h：LVEDV、LVESV、CO、LVEF實(shí)驗(yàn)組均高于對照組（P＜0.05）；對照組與阻斷組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。3）干預(yù)24 h：各組大鼠LVEDV、LVESV、LVEF 差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；實(shí)驗(yàn)組CO 高于對照組（P＜0.05），對照組CO與阻斷組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1、圖2。

表1 各組SD大鼠不同時間左心室心功能比較（xˉ±s）

圖2 各組SD大鼠心臟彩超

2.2 心肌自噬蛋白表達(dá)

2.2.1 LC3-I與LC3-Ⅱ 實(shí)驗(yàn)組干預(yù)8、16 h自噬蛋白LC3-I、LC3-Ⅱ表達(dá)強(qiáng)于對照組（P＜0.05），對照組與阻斷組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；24 h 各組LC3-I、LC3-Ⅱ表達(dá)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

表2 各組大鼠不同時間心肌組織LC3-I、LC3-Ⅱ與P62/SQSTM1表達(dá)（xˉ±s） μg/mL

2.2.2 P62 實(shí)驗(yàn)組干預(yù)8 h P62 表達(dá)與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），阻斷組P62表達(dá)高于對照組（P＜0.05）；干預(yù)16 h，P62蛋白表達(dá)實(shí)驗(yàn)組低于對照組（P＜0.05），對照組高于阻斷組（P＜0.05）；干預(yù)24 h，P62 蛋白表達(dá)實(shí)驗(yàn)組高于對照組（P＜0.05），對照組高于阻斷組（P＜0.05），見表2。

2.2.3 自噬蛋白表達(dá)與四逆湯干預(yù) 實(shí)驗(yàn)組大鼠心肌自噬蛋白LC3-I、LC3-Ⅱ在16 h表達(dá)最強(qiáng)，24 h 后降低，對照組、阻斷組總的趨勢是逐漸下降。實(shí)驗(yàn)組大鼠心肌自噬蛋白P62 總的趨勢是先下降后上升，在16 h 蛋白表達(dá)最低，對照組、阻斷組16 h蛋白表達(dá)最強(qiáng)，24 h后降低。從試驗(yàn)結(jié)果可以看出，在四逆湯的干預(yù)下，自噬蛋白表達(dá)符合正常自噬調(diào)控時間由線，見圖3—4。

圖3 自噬蛋白LC3-Ⅰ/Ⅱ與P62表達(dá)

圖4 四逆湯干預(yù)下自噬蛋白LC3-Ⅰ/Ⅱ與P62表達(dá)

3 討論

膿毒癥導(dǎo)致的多器官功能障礙是死亡的主要原因之一，尤其心功能障礙中左心室功能障礙占大多數(shù)，然而，膿毒癥合并左心室功能障礙的機(jī)制仍不清楚，對其治療仍有不足。

目前，評價左心室功能運(yùn)用最廣泛的是超聲心動圖，不僅可評價左室整體收縮功能，還可評價左室舒張功能和局部心肌運(yùn)動［11］，其中LVESV、LVEDV、CO、LVEF 是評估左心室收縮功能的常見指標(biāo)。干預(yù)8、16 h實(shí)驗(yàn)組LVESV、LVEDV、CO、LVEF等均優(yōu)于對照組、阻斷組。說明四逆湯能夠緩解膿毒癥SD大鼠左心室收縮功能。干預(yù)24 h，除CO外其余指標(biāo)各組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。而實(shí)驗(yàn)組CO 高于對照組、阻斷組（P＜0.05），這可能與膿毒癥SD大鼠每搏量及心率變化有關(guān)。

自噬是是維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境自穩(wěn)的一種自我保護(hù)機(jī)制。據(jù)相關(guān)研究顯示，檢測自噬蛋白P62、LC3-Ⅰ/Ⅱ表達(dá)可以反映自噬參與膿毒癥與心功能障礙的調(diào)控水平［12-13］。

LC3 又被稱為微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3，主要功能是促進(jìn)自噬小體體積增大，識別并包裹自噬底物，因此作為自噬起始標(biāo)志物，最具代表性［14］。研究發(fā)現(xiàn)盲腸結(jié)扎穿刺法誘導(dǎo)的膿毒癥小鼠中自噬LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ蛋白在造模后4～6 h 開始增加，在CLP 術(shù)后12～18 h 自噬被充分激活，達(dá)到最高峰，24 h 自噬恢復(fù)最初水平；也有研究顯示在盲腸結(jié)扎穿刺術(shù)后24 h 自噬未完全消失，說明自噬調(diào)控具有時間性，出現(xiàn)這兩種不同結(jié)果的原因可能是組織標(biāo)本采集時間不一［15-17］，本研究結(jié)果基本符合自噬調(diào)控時間曲線。

在自噬過程中，P62 不僅是自噬蛋白，還是自噬底物，能使LC3 與多聚泛素化蛋白連接，通過泛素信號通路將受損的細(xì)胞器或蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到自噬體中，最終被降解［18］，當(dāng)自噬激活時，P62 在細(xì)胞內(nèi)持續(xù)降解，其表達(dá)量相應(yīng)減少，自噬抑制時P62 逐漸在細(xì)胞內(nèi)累積，其表達(dá)量增加［19］，故自噬蛋白P62 表達(dá)量與自噬活性呈負(fù)相關(guān)［20］。理論上24 h自噬消失，實(shí)驗(yàn)組、阻斷組、對照組自噬P62 蛋白表達(dá)一致，而本研究實(shí)驗(yàn)組表達(dá)最強(qiáng)，對照組、阻斷組表達(dá)最低，可能與自噬滯留有關(guān)，因?yàn)樽允墒且粋€復(fù)雜過程，受多種信號通路調(diào)控，24 h 對照組、阻斷組可能存在自噬滯留現(xiàn)象，故出現(xiàn)對照組、阻斷組自噬蛋白P62 表達(dá)降低現(xiàn)象。本研究結(jié)果顯示，P62蛋白的表達(dá)基本符合自身調(diào)控規(guī)律。

綜上所述，四逆湯可通過自噬途徑調(diào)控膿毒癥SD大鼠左心室功能，而且在16 h自噬活性最高，該結(jié)果可為臨床四逆湯何時介入治療提供參考。