七氟醚后處理聯合右美托咪定對心肌缺血/再灌注損傷小鼠的心肌保護作用機制

金 輝,肖志博,葛樹勝,吳小精,尹順花,李 媛

衰老是心血管疾病發展的重要危險因素,可引起心臟結構的改變和功能的不斷退化[1-2]。衰老改變心臟能量代謝和線粒體功能,導致心功能下降,還將引起心肌細胞死亡和不良結構重塑,從而加重心肌梗死、心力衰竭和其他心血管疾病對心臟的損傷[3-4]。心肌梗死后恢復缺血心肌的血液供應對于限制急性心肌梗死造成的損害至關重要,但再灌注階段,心肌血流的恢復會對心肌造成二次損傷,該過程被稱為心肌缺血/再灌注損傷(myocardial ischemia-reperfusion injury,MI/RI)[5]。右美托咪定(dexmedetomidine,Dex)是一種高度選擇性的α2-腎上腺素能受體激動劑,具有鎮痛、鎮靜和阿片類藥物特性,適用于重癥病人的鎮靜[6]。Dex對缺血/再灌注(I/R)損傷的心臟保護作用已有廣泛研究[7],證實Dex前處理或后處理對I/R損傷心肌細胞均具有保護作用[8]。但Dex對I/R損傷的保護作用還僅限于動物模型水平的研究,暫未大規模應用于臨床[9-10]。而在臨床實踐中發現,揮發性麻醉劑可改善缺血后的心臟功能并減少梗死發生,這種現象被稱為麻醉后處理(anesthetic postconditioning)的保護效應[11-12]。有證據證明,七氟醚(sevoflurane,Sev)后處理(sevoflurane postconditioning,Sev-postC)可減輕病人的心肌再灌注損傷[13],但其確切的分子機制尚未完全闡明。巨噬細胞遷移抑制因子(macrophage migration inhibitory factor,MIF)是一種多效性炎癥細胞因子,廣泛表達于各種細胞類型[14]。MIF響應各種刺激,可由低氧誘導因子-1α(HIF-1α)誘導,從細胞內分泌至胞外,通過調節其他促炎細胞因子的釋放來控制炎癥反應進程[15]。最近許多研究證明,MIF在保護缺血后的心肌方面具有一定作用,且該作用獨立于其促炎特性。這些研究表明,經過短暫缺血(≤30 min)的心臟會釋放MIF,隨后MIF將激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)并抑制JNK通路和氧化應激,從而保護心臟免受I/R損傷[16]。另有研究表明,MIF參與麻醉劑異氟烷預處理誘導的心肌細胞保護[17]。這些特征提示MIF在缺血預處理誘導的心肌保護中發揮潛在的作用。

基于上述證據,MIF可能在Sev-postC減輕缺血心肌損傷的過程中也發揮重要作用。本研究擬通過構建在體MI/RI小鼠模型,觀察聯合用藥Dex與Sev-postC對心肌的保護作用。同時,通過體外構建缺氧/復氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)心肌細胞模型,并敲低或過表達心肌細胞中的MIF因子,檢測敲低或過表達MIF后對Sev與Dex的協同增效作用的影響,探索Sev協同增效作用的分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及材料

20只31周齡雄性C57BL/6J小鼠,體質量(250±10)mg,無特定病原體(SPF)級,購自海南藥物研究所有限責任公司。H9c2細胞購自武漢普諾賽公司;Dex和Sev購自北京陽光生物公司(貨號分別為YT-1732234和YZ-1612540);V-異硫氰酸熒光素(annexin V-FITC)/碘化丙啶(propidium iodide,PI)雙標記流式細胞術檢測試劑盒(貨號A13199)、Lipofectamine 3000購自Thermo Fisher(美國,貨號L3000075);CCK-8細胞計數試劑盒(貨號96992);兔抗大鼠MIF、兔抗大鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、山羊抗兔IgG(H+L)辣根過氧化物酶(HRP)二抗購自Abcam(美國);MIF siRNA和siRNA NT寡核苷酸以及pcDNA3.1(+)和pcDNA3.1(+) MIF OE質粒合成或構建于上海生工生物公司;血清肌鈣蛋白I(cTnI)、乳酸脫氫酶(LDH)、腦鈉肽(BNP)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)購自武漢華美生物公司。

酶標儀(型號800TS)購自美國BioTek公司;流式細胞儀(型號Attune NxT)購自美國Thermo Fisher公司;麻醉蒸發器(型號BS-S6100 Plus)購自廣州碧森醫療公司(中國)。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物分組

造模手術前對小鼠適應性飼養1周。每籠4只小鼠,飼養于溫度和濕度受控的SPF級鼠房,具備12 h/12 h光照/黑暗循環,小鼠可以隨意進食和飲水。將所有小鼠隨機分為假手術(Sham)組、I/R損傷模型(Model)組、Dex組、Dex聯合Sev-postC(Dex+Sev-postC)組,每組5只。

1.2.2 MI/RI損傷小鼠模型的構建

將小鼠置于30 ℃加熱墊上。小鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉(60 mg/kg)麻醉。麻醉后,夾趾試驗無反應,行氣管插管。呼吸機參數設置為與麻醉小鼠的呼吸頻率同步,然后,將氣管插管連接到呼吸機。術前開始記錄小鼠心電圖。Model組經胸骨左緣第三肋間開胸,用7-0絲線結扎左冠狀動脈左前降支(left anterior descending,LAD)。30 min后,松開結扎線進行再灌注。成功建立模型后,通過心電圖識別ST段。Sham組小鼠打開其胸部,僅將7-0絲線放置于LAD相應部位但未結扎。手術后,連續監測小鼠心電圖1 h未見再灌注性心律失常和心臟出血時,關閉胸腔,但不縫合心包;之后向經歷手術的小鼠肌內注射青霉素(400 kU/kg)防止感染,待其清醒后再從30 ℃加熱墊上移開,隨后進行24 h再灌注[18]。再灌注結束后,小鼠腹腔注射2%戊巴比妥(60 mg/kg)麻醉下采集其腹主動脈血樣,然后行腹腔注射2%戊巴比妥(100 mg/kg)安樂死小鼠,取其心臟進行后續檢測。

圖1 各組HE染色圖

MI/RI造模手術后,Sham組和Model組小鼠均腹腔注射生理鹽水,Dex組小鼠術后腹腔注射10 μg/kg的Dex[7],Dex+Sev-postC組小鼠在灌注前持續吸入2.5% Sev 15 min,然后開始再灌注[19]。

1.2.3 蘇木精-伊紅(HE)染色和Masson染色

HE染色:心臟經10%中性甲醛溶液于4 ℃固定48 h以上,隨后進行石蠟包埋和切片,制備成5 μm切片。切片經二甲苯脫蠟,梯度乙醇水化后,使用蘇木精染色液染色5 min,然后分化液分化3 s,再進行切片復藍約3 s。隨后依次用85%和95%乙醇脫水各4 min。之后,切片用伊紅染色液染色5 min,無水乙醇脫水3次,每次5 min,二甲苯透明化2次,每次2 min。最后,切片用中性樹膠封片。在Nikon光學顯微鏡下鏡檢并進行病理學分析和拍照。Masson染色:5 μm切片使用Masson A溶液染色15 h,然后在65 ℃烘箱中加熱30 min,隨后用自來水沖洗切片。將Masson B溶液和C溶液混合,并染色切片1 min,用1%鹽酸乙醇處理1 min。用Masson D溶液染色6 min,再用Masson E溶液浸泡1 min,用Masson F溶液浸泡15 s。之后,切片用1%冰醋酸分化3次,每次8 s;無水乙醇脫水3次,每次5 min。二甲苯透明化后,用中性樹膠封片。在Nikon光學顯微鏡下光鏡鏡檢并進行病理學分析和拍照。

1.2.4 酶聯免疫吸附試驗(ELISA)

小鼠腹主動脈血樣以3 000×g離心,收獲血清樣品。按照ELISA試劑盒的說明書對血清cTnI、LDH、BNP、CK-MB進行測定。使用BioTek酶標儀在450 nm下讀取吸光值。

1.2.5 細胞培養和H/R細胞模型的構建

細胞實驗分為4組,其中對照(Control)組細胞培養于添加10%胎牛血清(FBS)的完全DMEM培養液中,并在常氧條件下培養于通入5%CO2的37 ℃恒溫、濕潤的細胞孵育箱中正常培養。H/R損傷細胞模型組(H/R組):使用H9c2心肌細胞在體外誘導H/R損傷細胞模型。H9c2細胞培養于含有10% FBS的完全DMEM培養液中,置于上述細胞培養箱中培養。將2×106細胞種于6孔板,適應性貼壁培養24 h后,更換細胞培養液為無血清、無葡萄糖的DMEM培養液,并將細胞培養物轉移至37 ℃恒溫濕潤的低氧細胞培養箱中,缺氧培養8 h。然后更換為DMEM完全培養液,并將細胞培養物轉移至常規細胞培養箱中正常培養2 h。Dex組:細胞經歷缺氧培養8 h,然后復氧培養2 h后,加入1 μmol/L的Dex處理12 h,隨后終止藥物作用,再繼續培養12 h[20]。Dex聯合Sev處理(Dex+Sev)組向細胞加入1 μmol/L的Dex后,將細胞培養板放置在37 ℃恒溫、密封的玻璃腔室中,通過麻醉蒸發器向玻璃腔室加入濃度為3.4%的Sev處理細胞6 h,然后在正常培養條件下繼續維持培養細胞18 h[21]。Dex聯合Sev處理并分別轉染敲低對照組(Dex+Sev+siRNA NT組)或敲低MIF組(Dex+Sev+MIF siRNA組)、過表達對照組(Dex+Sev+pcDNA3.1組)、過表達MIF組(Dex+Sev+pcDNA3.1-MIF組)細胞先進行siRNA轉染或過表達質粒轉染,然后再開始H/R體外誘導和藥物處理。

1.2.6 轉染

在H9c2細胞中敲低MIF:MIF siRNA引物序列為5′-AGCAGCTGGCGCAGGCCACCG-3′;siRNA NT引物序列為5′-CGTCCTGTGGTGCTCTACACC-3′。

在H9c2細胞中過表達MIF:將MIF的開放閱讀框(ORF)克隆至pcDNA3.1(+)載體中,構建過表達MIF的pcDNA3.1-MIF OE質粒。MIF ORF正向引物序列為5′-TAGTGGCACGAGCGACCC-3′,反向引物序列為5′-TTGGCTGCGTTCATGTCGT-3′。

使用Lipofectamine 3000轉染H9c2細胞,轉染與細胞鋪板同時進行,轉染時將2×106H9c2細胞種于6孔板的每皿中,使得貼壁后的細胞匯合度達到45%～50%,同時更換細胞培養液為無血清、無抗生素的DMEM培養液。分別將10 μL Lipofectamine 3000和4 μg去內毒素的pcDNA3.1(+)或pcDNA3.1-MIF OE質粒DNA溶解于50 μL無血清、無抗生素的DMEM中;分別將5 μL的Lipofectamine 3000和100 pmol/L的MIF siRNA或siRNA NT溶解于50 μL無血清、無抗生素的DMEM中。然后輕輕混勻脂質體和DNA溶液并準確孵育20 min,隨后于3 min內將混合液緩慢滴加至細胞培養物中,轉染6 h后更換為含10% FBS的完全DMEM培養液,轉染48 h后收獲細胞樣品,進行后續指標檢測。

1.2.7 CCK-8細胞存活能力測定

將3×104細胞種于96孔板的每孔中,并按照實驗要求對各組細胞進行處理。結束處理后再連續培養36 h。將含有10% CCK-8試劑的完全DMEM培養液加入每孔中,于37 ℃再孵育細胞2 h。然后使用BioTek酶標儀在450 nm下讀取吸光值。

1.2.8 FITC-Annexin V/PI雙標記流式細胞術測定

按照實驗要求對各分組細胞進行處理。消化6孔板每皿細胞,制備成單細胞懸液。然后立即加入冰預冷的PBS,于4 ℃離心,棄上清,重復3次清洗細胞。加入Annexin V-FITC/PI雙標記流式細胞術檢測試劑盒自帶的、4 ℃預冷的Annexin-Binding Buffer,并將細胞稀釋至1.5×106/mL,每組樣品取100 μL細胞懸液進行后續處理:向其中加入5 μL的Annexin V-FITC和5 μL的PI,室溫避光孵育15 min,然后向加入400 μL的Annexin-Binding Buffer,置于冰上待測。上機Thermo Fisher流式細胞儀對細胞凋亡情況進行分析。

1.2.9 蛋白免疫印跡法(Western Blot)

向每皿6孔板細胞樣品中加入100 μL含有蛋白酶抑制劑預混液的RIPA裂解液裂解細胞并提取細胞總蛋白樣品,使用BCA蛋白質定量試劑盒定量總蛋白質的濃度,每個樣本取25 μg總蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)凝膠電泳,采用半干轉印法進行轉膜。使用含10%脫脂牛奶的TBS-T緩沖液于室溫對聚偏二氟乙烯(PVDF)膜封閉1 h。然后在4 ℃條件下孵育一抗過夜?？贵w稀釋度:兔抗大鼠MIF(1∶2 000稀釋),兔抗大鼠-GAPDH(1∶5 000稀釋)。第2天加入二抗山羊抗兔IgG(H+L)HRP二抗(1∶10 000稀釋),于37 ℃孵育1 h。用TBS-T緩沖液洗膜后,滴加ECL發光底物進行化學發光。在Bio-Rad多色熒光成像分析系統下進行圖像采集。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 Sev-postC增強Dex對I/R心肌的保護作用

HE染色結果顯示,Sham組小鼠心肌纖維排列規則,無破損或壞死間隙,心肌細胞核呈梭形或橢圓形;Model組小鼠心肌纖維結構斷裂溶解,心肌間隙擴大,梗死處有炎性細胞浸潤;Dex組小鼠心肌纖維斷裂和炎癥細胞浸潤有所改善;Dex+Sev-postC組小鼠心肌纖維結構破壞得到明顯改善,基本無炎癥細胞浸潤,很少見壞死間隙。詳見圖1。Masson染色顯示,Sham組心肌組織無纖維化,無膠原蛋白沉積;Model組心肌組織纖維化程度明顯,心肌細胞明顯減少,膠原蛋白沉積增加;Dex組小鼠心肌細胞減少得到改善,膠原蛋白沉積減少;Dex+Sev-postC組心肌組織纖維化得到明顯改善,心肌細胞排列整齊,幾乎無膠原蛋白沉積。詳見圖2。ELISA檢測血清心肌損傷指標cTnI、LDH、BNP、CK-MB結果顯示,與Sham組比較,Model組cTnI、LDH、BNP、CK-MB水平均明顯上升(P<0.01);與Model組比較,Dex組和Dex+Sev-postC組cTnI、LDH、BNP、CK-MB水平明顯下調(P<0.05或P<0.01);與Dex組比較,Dex+Sev-postC組cTnI、LDH、BNP、CK-MB水平明顯下調(P<0.05或P<0.01)。詳見圖3。

圖2 各組Masson染色圖

圖3 各組血清cTnI、LDH、BNP、CK-MB水平比較

2.2 敲低MIF能夠抑制Sev對Dex心肌保護的增強效應

Western Blot檢測H9c2細胞中MIF表達,與siRNA NT組比較,MIF siRNA組MIF表達明顯降低(P<0.01)。細胞存活能力測定結果顯示,與Control組比較,H/R組細胞存活能力明顯降低(P<0.01);與H/R組比較,Dex組、Dex+Sev+siRNA NT組和Dex+Sev+MIF siRNA組細胞存活能力明顯上升(P<0.05);與Dex+Sev+siRNA NT組比較,Dex+Sev+MIF siRNA組細胞存活能力明顯下調(P<0.05)。細胞凋亡率測定結果顯示,與Control組比較,H/R組凋亡率明顯升高(P<0.01);與H/R組比較,Dex組、Dex+Sev+siRNA NT組和Dex+Sev+MIF siRNA組細胞凋亡率明顯降低(P<0.01);與Dex+Sev+siRNA NT組比較,Dex+Sev+MIF siRNA組細胞凋亡率明顯升高(P<0.05)。詳見圖4～圖6。

圖4 siRNA NT組與MIF siRNA組MIF表達比較

圖5 各組細胞存活能力、細胞凋亡率比較

圖6 流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率

2.3 過表達MIF能夠進一步增強Sev對Dex心肌保護的增強效應

Western Blot檢測H9c2細胞中MIF表達,與pcDNA3.1組比較,pcDNA3.1-MIF OE組MIF表達明顯升高(P<0.01)。細胞存活能力測定結果顯示,與Control組比較,H/R組細胞存活能力明顯降低(P<0.01),Dex+Sev+pcDNA3.1組和Dex+Sev+pcDNA3.1-MIF組與Control組比較差異無統計學意義(P>0.05);與H/R組比較,Dex組、Dex+Sev+pcDNA3.1組和Dex+Sev+pcDNA3.1-MIF組細胞存活能力明顯上升(P<0.05或P<0.01);與Dex組比較,Dex+Sev+pcDNA3.1組和Dex+Sev+pcDNA3.1-MIF組細胞存活能力明顯升高(P<0.05)。細胞凋亡率測定結果顯示,與Control組比較,H/R組細胞凋亡率明顯升高(P<0.01),Dex+Sev+pcDNA3.1-MIF組與Control組比較差異無統計學意義(P>0.05);與H/R組比較,Dex組、Dex+Sev+pcDNA3.1組和Dex+Sev+pcDNA3.1-MIF組細胞凋亡率明顯降低(P<0.01);與Dex組比較,Dex+Sev+pcDNA3.1組和Dex+Sev+pcDNA3.1-MIF組細胞凋亡率明顯降低(P<0.01);與Dex+Sev+pcDNA3.1組比較,Dex+Sev+pcDNA3.1-MIF組細胞凋亡率明顯降低(P<0.05)。詳見圖7～圖9。

圖7 pcDNA3.1組與pcDNA3.1-MIF OE組MIF表達比較

圖8 各組細胞存活能力、細胞凋亡率比較

圖9 流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率

3 討 論

衰老是心血管疾病發展的重要危險因素,衰老能加重心肌梗死、心力衰竭和其他心血管疾病對心臟的損傷[3-4]。目前對Dex的心臟保護作用已有很多臨床前研究,如小鼠心臟缺血15 min/再灌注45 min后開始Dex治療能有效縮小梗死面積[7]。而且在合并癥存在的情況下Dex也能發揮心肌保護功能。在2型糖尿病大鼠中,Dex后處理可縮小心肌梗死面積[22]。另外,即使存在急性高血糖,但Dex仍能保護I/R損傷大鼠的心肌[23]。有冠狀動脈內皮功能障礙的大鼠心臟發生I/R損傷后,Dex能夠發揮抑制心肌死亡和保護心臟功能的作用[24]。Dex的心臟保護作用有望轉化為臨床應用。本研究結果再次證實Dex對I/R的心肌具有明顯的保護作用,Dex處理能夠明顯緩解模型小鼠心肌細胞的損傷和膠原蛋白的沉積,明顯減輕心肌損傷,提示Dex對I/R心肌的有效保護作用。

臨床實踐中發現麻醉后處理,特別是Sev-postC能夠有效緩解病人的心肌I/R損傷。Sev-postC通過上調O-GlcNAc轉移酶介導的O-GlcNAc-RIPK3減少心肌I/R損傷誘導的心肌壞死性凋亡[25]。Sev-postC通過一氧化氮(NO)-依賴性機制恢復自噬通量防止心肌I/R損傷[19]。Sev-postC通過激活Janus激酶2(JAK2)-信號轉導和轉錄激活因子3(STAT3)通路保護心肌免受I/R損傷[26]。本研究探索聯合應用Dex與Sev能否緩解心肌I/R損傷,結果顯示Sev-postC能夠發揮與Dex協同保護心肌的作用。與單純Dex處理比較,聯合Dex與Sev-postC能夠明顯緩解I/R損傷小鼠心肌纖維化和心肌損傷。

本研究進一步分析了Sev-postC的分子作用機制。有研究顯示,Sev-postC發揮心肌保護功能的分子作用通路主要有Toll樣受體4(TLR4)/髓樣分化因子88(MyD88)/核轉錄因子κB(NF-κB)通路[27],microRNA-145/顆粒酶K(GZMK)分子作用軸[28],以及低氧誘導因子-1(HIF-1)/B淋巴細胞瘤-2基因/腺病毒E1B相互作用蛋白3(BNIP3)通路[29]等。MIF是一種多效性炎癥細胞因子。最近許多研究表明,MIF在缺血預處理誘導的心肌保護中發揮潛在的作用[17]。本研究發現,Sev能夠通過MIF因子發揮與Dex的協同保護作用。敲低MIF后,Sev對Dex心肌保護的協同作用將被抵消;而過表達MIF將進一步增強Sev對Dex心肌保護的協同保護功能。

雖然本研究未深入探討Sev是否通過microRNA發揮調節MIF因子表達并協同Dex對心肌實現保護功能。但初步證明Dex聯合Sev-postC能夠進一步發揮對I/R心肌的保護功能,而且這種協同增效的作用是通過MIF因子實現的,這為臨床應用Dex與Sev等緩解心肌再灌注損傷提供了有力的臨床前動物模型水平的研究數據?？傊?本研究證實Sev-postC通過MIF因子增強Dex對MI/RI小鼠的心肌保護作用。