脂蛋白相關(guān)lncRNA通過(guò)參與炎癥反應(yīng)致冠心病血管損傷的機(jī)制研究

劉旭光,陳 晨,吳 斌,胡家蕓,項(xiàng) 娜

冠心病是一種缺血性心臟病,在病理學(xué)上以動(dòng)脈粥樣硬化為特征,這是一種與炎癥密切相關(guān)的慢性病理過(guò)程[1-2]。目前,有關(guān)冠心病的治療(包括他汀類等藥物治療和冠狀動(dòng)脈旁路移植等非藥物治療)和對(duì)危險(xiǎn)因素(如吸煙、糖尿病并發(fā)癥或高血壓)的識(shí)別取得了一定研究進(jìn)展,但冠心病仍然是死亡的主要原因[3-4]。因此,尋找包括長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNA)在內(nèi)的新型生物標(biāo)志物對(duì)于預(yù)防和治療冠心病具有重要意義。lncRNA是長(zhǎng)度>200個(gè)核苷酸并廣泛分布在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中的非編碼RNA[5]。研究表明lncRNA在多能性的調(diào)節(jié)和心臟特異性基因的激活中發(fā)揮重要作用[6],lncRNA在調(diào)節(jié)各種細(xì)胞過(guò)程方面起著關(guān)鍵作用,如血管內(nèi)皮細(xì)胞(VECs)功能障礙、血管平滑肌細(xì)胞(VSMC)增殖和脂質(zhì)代謝[7-8]。血管內(nèi)皮細(xì)胞重塑被認(rèn)為是冠心病發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵[9]。氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)可以通過(guò)涉及成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2(FGF2)啟動(dòng)子甲基化和抑制FGF2轉(zhuǎn)錄的丙二醛依賴性途徑破壞人冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(HCAEC)的生長(zhǎng)和存活[10]。研究表明,lnc-MICALL2-2在冠心病病人中表達(dá)升高,其表達(dá)升高是冠心病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[11]。然而,lnc-MICALL2-2在冠心病誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮損傷及其特異性分子機(jī)制中尚未報(bào)道。本研究將ox-LDL誘導(dǎo)的HCAECs作為損傷模型,以探索lnc-MICALL2-2在冠心病發(fā)病機(jī)制中的生物學(xué)作用。本研究中使用HCAECs作為細(xì)胞,主要考慮:1)冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮損傷是冠心病發(fā)展的早期階段;2)HCAEC被廣泛用作工具細(xì)胞以探索氧化損傷,包括由ox-LDL引起的內(nèi)皮功能障礙[12];3)使用的ox-LDL誘導(dǎo)的HCAECs損傷模型更接近冠心病的病理狀況。

1 材料與方法

1.1 HCAECs的培養(yǎng)和鑒定

HCAECs購(gòu)于Sciencell,被選為血管內(nèi)皮細(xì)胞模型,細(xì)胞培養(yǎng)基由Procell生命科學(xué)技術(shù)有限公司(中國(guó)武漢)提供。HCAECs在具有37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。細(xì)胞在單層中生長(zhǎng),并在細(xì)胞附著率達(dá)到90%時(shí)進(jìn)行常規(guī)傳代。倒置顯微鏡(奧林巴斯公司,日本)用于觀察細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)。

血管性血友病因子(vWF)是血管內(nèi)皮細(xì)胞合成過(guò)程中釋放的蛋白質(zhì)因子。vWF參與血液凝固和血栓形成,并作為鑒定體外培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞的特征因素。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)免疫組織化學(xué)染色技術(shù)染色HCAECs。用Cy3染料(紅色)染色vWF,并用4′,6-二氨基-2-苯基吲哚染料(藍(lán)色)復(fù)染細(xì)胞核。

1.2 ox-LDL誘導(dǎo)的HCAECs模型構(gòu)建

ox-LDL在HCAECs功能障礙中起重要作用,并且與動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病和冠心病有關(guān)。在體外ox-LDL已被用于培養(yǎng)HCAECs,以模擬動(dòng)脈粥樣硬化的形成。ox-LDL(Biotechnology,中國(guó))在磷酸緩沖鹽溶液(PBS)中使用Cu2SO4(氧化劑)進(jìn)行氧化。添加過(guò)量的EDTA-Na2終止氧化。在瓊脂糖凝膠電泳上分析每個(gè)批次的遷移與低密度脂蛋白(LDL)。為了確定ox-LDL誘導(dǎo)HCAECs的合適濃度和暴露時(shí)間,將正常對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HCAECs的密度調(diào)整為2×105個(gè)/mL,在96孔板(3板,每板12孔)中培養(yǎng)。HCAECs與不同濃度的ox-LDL(0、25、50、100 μg/mL)分別孵育24、48、72 h。

1.3 siRNA轉(zhuǎn)染

在轉(zhuǎn)染之前,將HCAECs的接種密度調(diào)整為5×105個(gè)/mL,將細(xì)胞和200 μL無(wú)血清Opti-MEM培養(yǎng)基加入6孔板中,加入終濃度為50 nmol/L的siRNA(Gemma Gene,中國(guó)上海),將lnc-MICALL2-2靶向siRNA轉(zhuǎn)染到HCAECs中。通過(guò)用逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)評(píng)估lncRNA的表達(dá)來(lái)證實(shí)敲低。用干擾片段轉(zhuǎn)染后,用100 μg/mL的ox-LDL處理細(xì)胞,在37 ℃和5%CO2條件下孵育48 h。實(shí)驗(yàn)分為對(duì)照組、ox-LDL組、NC-shRNA+ox-LDL組、sh-MICALL2-2+ox-LDL組。對(duì)照組:未經(jīng)處理;ox-LDL組:ox-LDL處理HCAECs;NC-shRNA+ox-LDL組:用NC-shRNA處理HCAECs;sh-MICALL2-2+ox-LDL組:用lnc-MICALL2-2處理HCAECs。

1.4 細(xì)胞活力測(cè)定

使用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK-8)檢測(cè)細(xì)胞活力。細(xì)胞置于96孔板上,37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜,與不同濃度的藥物孵育72 h,加入CCK-8 試劑,并將混合物在37 ℃下孵育0.5～4.0 h。使用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm處的吸光度值。與對(duì)照相比評(píng)價(jià)細(xì)胞生長(zhǎng)速率,并使用GraphPad Prism 7.0軟件計(jì)算50%抑制濃度(IC)值。

1.5 qRT-PCR檢測(cè)lncRNA-MICALL2-2水平

使用TRIzol試劑(Invitrogen)分離處理過(guò)的HCAECs的總RNA,使用PrimeScript RT試劑盒(中國(guó)大連,Takara)獲得cDNA。在lightCycler 480Ⅱ(羅氏,美國(guó))上進(jìn)行qRT-PCR,具有SYBR綠色染料檢測(cè)(TaKaRa Bio,美國(guó))。所有樣品一式3份測(cè)定,采用2-ΔΔCt方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,lncRNA分析中以U6 RNA為參考,以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為mRNA分析的參考。

1.6 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)炎癥相關(guān)因子

在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中收集上清液,離心上清液并轉(zhuǎn)移到干凈的試管中,采用ELISA測(cè)定法測(cè)量上清液中腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-10、IL-1β、血管細(xì)胞黏附分子-1(VCAM-1)、細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)和單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)含量,根據(jù)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行檢測(cè)。

1.7 熒光原位雜交技術(shù)(FISH)檢測(cè)lncRNA-MICALL2-2在細(xì)胞核中的定位

在室溫下,用4%多聚甲醛固定細(xì)胞20 min,用0.1%二甲苯基硅碳酸水洗滌5 min(2次),在37 ℃下進(jìn)行蛋白酶K消化20 min,用PBS洗滌5 min(2次),在室溫下用1%多聚甲醛固定10 min,再用PBS洗滌5 min(2次)。將樣品在-20 ℃下冷凍,并在70%、85%和100%乙醇中脫水5 min,將異硫氰酸熒光素(FITC)探針和探針稀釋劑混合成探針雜交混合物,并在73 ℃下在冰上變性8 min。將溶液滴到切片上并在42 ℃下孵育過(guò)夜,然后用預(yù)熱(42 ℃)50%甲酰胺洗滌3次(5 min)。采用二脒基苯基吲哚(DAPI)染色細(xì)胞核,并用PBS再次洗滌3次(5 min),然后用熒光顯微鏡觀察。

1.8 蛋白免疫印跡(Western Blot)試驗(yàn)

使用RIPA緩沖液裂解各組HCAECs細(xì)胞,獲得全細(xì)胞提取物,通過(guò)NE-PERTM核和細(xì)胞質(zhì)提取試劑盒(ThermoFisher Scientific)分離細(xì)胞質(zhì)和核蛋白,采用BCA Protein Assay試劑盒(Beyotime Biotechnology,China)測(cè)定總蛋白濃度。最后通過(guò)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白質(zhì)并轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上,將膜與抗體一起孵育并使用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。用ImageJ 軟件測(cè)量定量數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.9 活性氧(ROS)檢測(cè)

使用二氯熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)檢測(cè)HCAECs中ROS水平。在除去細(xì)胞培養(yǎng)基后加入用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋的DCFH-DA,將細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育30 min,用PBS洗滌細(xì)胞,在激光共聚焦顯微鏡(日本奧林巴斯)觀察免疫熒光。

1.10 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

采用凋亡測(cè)定試劑盒(Beyotime,C1062L)檢測(cè)HCAECs凋亡率。用PBS洗滌細(xì)胞3次,加入膜聯(lián)蛋白-V和碘化丙啶(PI),細(xì)胞在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育40 min,通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)量細(xì)胞凋亡率。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 ox-LDL促進(jìn)HCAECs炎癥反應(yīng)和血管損傷

體外進(jìn)行HCAECs實(shí)驗(yàn),大部分培養(yǎng)的細(xì)胞均對(duì)vWF呈陽(yáng)性(見圖1),表明HCAECs的培養(yǎng)產(chǎn)生了純度相對(duì)較高的血管內(nèi)皮細(xì)胞。CCK-8結(jié)果表明HCAECs的細(xì)胞活力隨著ox-LDL濃度的增加而降低,其中100 μg/mL的ox-LDL作用最顯著,與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),詳見圖2。ELISA檢測(cè)炎癥相關(guān)因子(TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10)和黏附因子(VCAM-1、ICAM-1和MCP-1)顯示,ox-LDL可明顯增加促炎因子IL-1β、TNF-α、IL-1β、IL-6及黏附因子VCAM-1、ICAM-1、MCP-1表達(dá),降低抗炎因子IL-10表達(dá),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),詳見圖3、圖4。表明ox-LDL促進(jìn)了炎癥反應(yīng)和血管損傷。

圖1 通過(guò)vWF對(duì)HCAECs進(jìn)行純化鑒定

圖2 CCK-8法檢測(cè)不同濃度ox-LDL刺激HCAECs的細(xì)胞活力

圖3 ELISA檢測(cè)炎癥相關(guān)因子

圖4 ELISA檢測(cè)細(xì)胞黏附因子

2.2 lncRNA-MICALL2-2在HCAECs中的表達(dá)差異

FISH結(jié)果表明,lncRNA-MICALL2-2主要定位于細(xì)胞核中(見圖5)。qRT-PCR檢測(cè)HCAECs細(xì)胞中l(wèi)ncRNA-MICALL2-2的含量表明,lncRNA-MICALL2-2在ox-LDL誘導(dǎo)的HCAECs損傷模型中上調(diào),用sh-RNA序列轉(zhuǎn)染HUVECs以敲低lncRNA-MICALL2-2的表達(dá),CCK-8結(jié)果表明敲低lncRNA-MICALL2-2后細(xì)胞活力增加,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),詳見圖6。表明敲低lncRNA-MICALL2-2降低了ox-LDL誘導(dǎo)的HCAECs中的血管內(nèi)皮損傷。

圖5 通過(guò)FISH檢測(cè)HCAECs中的lncRNA-MICALL2-2定位

圖6 各組HCAECs的細(xì)胞活力及l(fā)ncRNA-MICALL2-2表達(dá)比較

2.3 敲低lncRNA-MICALL2-2降低ox-LDL誘導(dǎo)的HCAECs血管內(nèi)皮損傷

Western Blot檢測(cè)結(jié)果表明,ox-LDL組磷酸化內(nèi)皮型一氧化氮合酶(p-eNOS)和內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)的蛋白表達(dá)水平下降,敲低lncRNA-MICALL2-2后,p-eNOS和eNOS水平升高。ox-LDL組內(nèi)皮素-1(ET-1)表達(dá)升高,敲低lncRNA-MICALL2-2后,ET-1表達(dá)被部分抑制,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖7、圖8。

圖7 Western Blot檢測(cè)各組eNOS和p-eNOS蛋白表達(dá)

圖8 Western Blot檢測(cè)各組ET-1蛋白表達(dá)

2.4 敲低lncRNA-MICALL2-2可抑制ox-LDL誘導(dǎo)的HCAECs炎癥反應(yīng)和血管細(xì)胞黏附因子上調(diào)

在ox-LDL誘導(dǎo)的HCAECs細(xì)胞中VCAM-1、ICAM-1、MCP-1、TNF-α、IL-1β和IL-6表達(dá)水平升高,IL-10表達(dá)水平降低;在敲低lncRNA-MICALL2-2后,HCAECs細(xì)胞中VCAM-1、ICAM-1、MCP-1、TNF-α、IL-1β和IL-6表達(dá)水平降低,IL-10表達(dá)水平升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖9、圖10。

圖9 各組炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10表達(dá)水平比較

圖10 各組VCAM-1、ICAM-1、MCP-1表達(dá)水平比較

2.5 敲低lncRNA-MICALL2-2可降低ox-LDL誘導(dǎo)的HCAECs中ROS水平和細(xì)胞凋亡率

高水平ROS和細(xì)胞凋亡引起的氧化損傷也是細(xì)胞損傷的重要指標(biāo),因此本研究檢測(cè)了細(xì)胞內(nèi)ROS水平和細(xì)胞凋亡率。結(jié)果表明,ox-LDL組和NC-shRNA+ox-LDL組ROS水平明顯高于對(duì)照組,敲低lncRNA-MICALL2-2后,HUVECs中ROS水平下降。ox-LDL組和NC-shRNA+ox-LDL組細(xì)胞凋亡率均高于對(duì)照組,敲低lncRNA-MICALL2-2后,降低了ox-LDL誘導(dǎo)的HUVECs細(xì)胞凋亡率。此外,本研究檢測(cè)相關(guān)凋亡基因水平,結(jié)果顯示,ox-LDL組和NC-shRNA+ox-LDL組Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)水平升高,Bcl-2表達(dá)水平降低,敲低lncRNA-MICALL2-2后,Bax和Caspase-3表達(dá)水平降低,Bcl-2表達(dá)水平升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖11～圖15。

圖11 各組ROS水平比較

圖12 各組ROS染色圖

圖13 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組HCAECs凋亡情況

圖14 Western Blot檢測(cè)各組相關(guān)凋亡基因Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白表達(dá)水平

圖15 各組細(xì)胞凋亡率比較

2.6 敲低lncRNA-MICALL2-2可抑制ox-LDL誘導(dǎo)的HCAECs血管炎癥

ox-LDL組和NC-shRNA+ox-LDL組腺苷單磷酸活化蛋白激酶-α1(AMPKα1)水平下調(diào),敲低lncRNA-MICALL2-2后,HUVEC中AMPKα1升高。當(dāng)HUAECs受到ox-LDL誘導(dǎo)時(shí),NOX-2表達(dá)升高,當(dāng)敲低lncRNA-MICALL2-2后,NOX-2水平降低,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見圖16、圖17。

圖16 各組AMPKα1、NOX-2蛋白表達(dá)條帶圖

圖17 Western Blot檢測(cè)各組HUVECs中AMPKα1和NOX-2蛋白表達(dá)

3 討 論

冠心病仍然是全球住院和死亡的主要原因之一,研究表明,冠心病家族史、吸煙、肥胖、焦慮和抑郁都是冠心病的危險(xiǎn)因素。然而外部因素只能部分解釋冠心病的病因[13]。研究表明基因組和表觀遺傳學(xué)在冠心病病因?qū)W中起著至關(guān)重要的作用[14]。本研究顯示,lnc-MICALL2-2在ox-LDL誘導(dǎo)的HCAECs中表達(dá)升高,并且敲低lnc-MICALL2-2后可減輕ox-LDL誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和血管損傷。

冠心病是一種慢性炎癥性疾病。炎癥反應(yīng)在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊和斑塊破裂的形成和發(fā)展中起重要作用,是冠心病的發(fā)病機(jī)制之一。血管炎癥反應(yīng)涉及白細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)之間的復(fù)雜相互作用[15]。氧化的脂質(zhì)代謝物可以激活血小板級(jí)聯(lián)反應(yīng)并引發(fā)血栓炎性因子釋放。血小板上清除劑受體的ox-LDL結(jié)合可導(dǎo)致ROS的產(chǎn)生、巨噬細(xì)胞活化和細(xì)胞凋亡。此外,血小板活化可以誘導(dǎo)趨化因子,促進(jìn)炎癥和促血栓形成微環(huán)境[16]。在體外主要使用ox-LDL建立動(dòng)脈粥樣硬化模型,大量證據(jù)表明在ox-LDL低濃度下,可以成功誘導(dǎo)前動(dòng)脈粥樣硬化性HCAECs功能障礙、死亡和病理性新生血管形成[17]。ox-LDL損傷參與冠心病發(fā)生與進(jìn)展,研究表明,血清ox-LDL為早期冠心病的危險(xiǎn)因素[18]。本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn),體外敲低lnc-MICALL2-2的表達(dá)減弱了ox-LDL引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷,為新型表觀遺傳靶點(diǎn)在ox-LDL介導(dǎo)的冠心病病因中的作用提供了初步證據(jù)。

血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙被認(rèn)為是冠心病的早期病理過(guò)程[19]。研究表明,用不同濃度的ox-LDL(30～200 μg/mL)誘導(dǎo)可引起HCAECs的炎癥損傷并產(chǎn)生動(dòng)脈粥樣硬化表型,伴有相關(guān)炎性因子的表達(dá)水平增加,如IL-6、IL-1β和TNF-α[20]。研究表明,lncRNA可以直接參與血管內(nèi)皮細(xì)胞的分化和增殖或影響參與免疫調(diào)節(jié)的血管內(nèi)皮細(xì)胞[21]。在本研究中,與正常培養(yǎng)的細(xì)胞相比,抑制lnc-MICALL2-2顯著提高了細(xì)胞活力,而且減弱了ox-LDL誘導(dǎo)的冠心病的細(xì)胞增殖,降低了炎性因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)的表達(dá)。

一氧化氮(NO)可以維持血管的正常收縮和松弛,NO主要由eNOS合成。本研究結(jié)果顯示,ox-LDL組eNOS和p-eNOS表達(dá)水平下降,在敲低lnc-MICALL2-2后,eNOS和p-eNOS表達(dá)水平升高。表明ox-LDL可誘發(fā)NO釋放障礙以及eNOS和p-eNOS的表達(dá),從而導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷。此外,ET-1的異常表達(dá)被認(rèn)為與各種心血管疾病的發(fā)展和進(jìn)展有關(guān)[22]。本研究中ox-LDL組ET-1表達(dá)增加,敲低lncRNA后,ET-1水平下降。表明lnc-MICALL2-2敲低后抑制ET-1水平并保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞。VCAM-1存在于內(nèi)皮細(xì)胞表面,在動(dòng)脈粥樣硬化中起重要作用[23]。ICAM-1也是一種內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子,在動(dòng)脈粥樣硬化組織中增加[24]。本研究中VCAM-1、ICAM-1和MCP-1水平在ox-LDL的誘導(dǎo)下升高,敲低lnc-MICALL2-2部分抑制內(nèi)皮因子的增加。ROS水平和凋亡率也是血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的重要指標(biāo)。研究顯示,高水平的ROS和凋亡率可誘發(fā)血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙,同時(shí),ROS和細(xì)胞凋亡也是血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷過(guò)程中的重要因素[25-26]。本研究ROS水平和細(xì)胞凋亡率是由ox-LDL誘導(dǎo)的,在敲低lnc-MICALL2-2后,ROS水平及細(xì)胞凋亡率降低。研究表明,體內(nèi)AMPKα1蛋白表達(dá)的降低導(dǎo)致NOX-2蛋白表達(dá)的增加,這些蛋白質(zhì)的變化導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙和血管內(nèi)皮炎癥[27]。本研究結(jié)果顯示,敲低lnc-MICALL2-2增強(qiáng)AMPKα1的蛋白表達(dá)并抑制NOX-2蛋白表達(dá)水平。

綜上所述,lnc-MICALL2-2在冠心病中表達(dá)升高,敲低lnc-MICALL2-2后可改善ox-LDL誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng),保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷。本研究表明lnc-MICALL2-2可能在冠心病中發(fā)揮作用,可能是治療冠心病誘發(fā)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的新靶點(diǎn)。