DLEU1通過調控p38/JNK信號通路促進高血壓大鼠血管平滑肌細胞增殖和血管重塑的實驗研究

冉婭婭,鄧功建,宋歡歡

高血壓是心血管疾病的主要危險因素。全基因組關聯研究已經確定了許多與血壓調節相關的分子量>50 bp的單核苷酸多態性位點,這可以解釋高血壓的遺傳傾向[1]。在前期的研究中發現,長鏈非編碼RNA(lncRNA)-淋巴細胞白血病缺失基因1(DLEU1)的一個基因組位點與原發性高血壓密切相關,DLEU1在血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell,VSMCs)中高表達,并推測這可能與血壓升高和血管重塑有關,DLEU1基因可能是高血壓的潛在誘發因素。DLEU1的缺失、突變和失控與人類口腔鱗狀細胞癌相關,并被認為是潛在的腫瘤抑制基因[2]。此外,DLEU1基因在腎母細胞瘤中也被鑒定為腫瘤抑制基因[3],但潛在的機制仍然不確定。血管重塑在高血壓的發病過程中起著關鍵作用,其特征是血管結構異常、血管平滑肌細胞(VSMCs)增殖和遷移增加以及綜合表型改變。此外,許多研究也證實了p38和c-jun氨基末端激酶(JNK)在血管平滑肌細胞增殖、遷移和凋亡過程中的重要作用[4-5]。p38/JNK可能通過不同的分子機制參與多種血管疾病,是治療血管疾病的新靶點。然而,關于DLEU1對VSMCs功能的調節作用以及是否由p38和JNK介導仍不確定。因此,本研究旨在探討阻斷p38和JNK通路能否改變DLEU1轉基因大鼠(DLEU1 transgenic rats,DTRs)的血壓、心臟參數和血管結構。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

12只DTRs大鼠委托賽業生物科技有限公司構建并驗證。用戊巴比妥鈉(120 mg/kg)腹腔注射麻醉12周齡雄性DTRs大鼠,開胸取心,解剖主動脈進行后續實驗。用無創尾套法和BP-98A系統測量大鼠的收縮壓、舒張壓、平均血壓和心率。測量心臟不同成分的重量,評價心臟肥大程度。主動脈、心臟、腎臟組織用4%多聚甲醛固定,石蠟包埋切片。切片用蘇木精-伊紅(HE)染色確定主動脈、心臟和腎臟的形態結構,用Massontri鉻染色評估膠原面積和纖維化程度。使用Image-Pro Plus軟件測定血管的中層厚度、血管直徑、中膜面積、管腔面積和中膜/管腔面積比。計算同一組織切片內不同位置的5個隨機測量值的平均值,得到各降主動脈的中層厚度。為了確定JNK和p38的作用,將12只大鼠隨機分為對照組、DTRs組、p38組、JNK組。對照組:按照15 mg/kg體質量標準,對Wistar大鼠腹腔注射二甲基亞砜溶液;DTRs組:按照15 mg/kg體質量標準,對DTRs大鼠腹腔注射二甲基亞砜溶液;p38組:將1 μmol/L濃度的p38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)特異性抑制劑SB203580溶解于二甲基亞砜溶液中,按照15 mg/kg體質量標準進行腹腔注射;JNK組:將1 μmol/L濃度的JNK抑制劑SP600125溶解于二甲基亞砜溶液中,按照15 mg/kg體質量標準進行腹腔注射。所有動物實驗操作均通過大學動物倫理委員會審核。

1.2 細胞模型構建

人主動脈VSMCs購自美國加利福尼亞州卡爾斯巴德科學細胞公司。將VSMCs在添加2%胎牛血清、1%平滑肌細胞生長補充劑和1%青霉素/鏈霉素溶液的平滑肌細胞培養液中培養。通過轉染pcDNA3.1(+)_myc-His A-DLEU1進行DLEU1過表達VSMCs。陰性對照和DLEU1過表達質粒由GeneChem(中國上海)合成。在Opti-MEM1無血清培養基中,1 μg質粒與脂質體2000按生產說明書步驟,共同孵育20 min后,將細胞培養液換成含5%胎牛血清的DMEM培養液。通過實時熒光定量聚合酶鏈式反應(RT-PCR)檢測DLEU1過表達的mRNA水平,驗證DLEU1過表達細胞模型。

1.3 溴脫氧核苷尿嘧啶(BrdU)實驗

將VSMCs接種于96孔板中,濃度為1×104個/孔,饑餓24 h后用10 μmol/L的BrdU標記細胞,并用固定液固定。將BrdU 5 mg用0.5 mL的1N-NaOH溶解,再加入蒸餾水5 mL。細胞培養結束前,加入終濃度為30 μg/L的BrdU,37 ℃孵育40 min。磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌、甲醇/乙酸固定、5%血清封閉、甲酰胺變性核酸。洗滌后孵育抗BrdU單克隆抗體。在顯微鏡下隨機計數10個高倍視野的細胞總數和BrdU陽性細胞數,計算細胞增殖率。洗滌后,將抗BrdU單克隆抗體孵育1 h,與山羊抗鼠免疫球蛋白G(IgG)偶聯。加入過氧化物酶底物,停止溶液終止反應。用分光光度計微板閱讀器在450 nm/550 nm波長處測定樣品的吸光度。

1.4 細胞周期及遷移檢測

將DLEU1過表達的VSMCs、胰酶消化后,在4 ℃、70%的冷乙醇中固定,去掉乙醇后再懸浮于200 μL磷酸鹽緩沖液中,在4 ℃黑暗環境中用200 μL碘化丙啶孵育。染色細胞過濾,用流式細胞儀檢測DNA熒光。將細胞種于24孔Boyden小室進行遷移實驗,將含有10%胎牛血清的DMEM放置在小室底部,用無胎牛血清的DMEM中懸浮VSMCs細胞,以8×104個/孔的密度加入上室,用4%多聚甲醛固定后,用0.4%結晶紫染色。取出濾器上部的細胞,用倒置顯微鏡計數遷移細胞數。

1.5 蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測

VSMCs細胞中提取蛋白樣本,用預冷的裂解緩沖液裂解細胞。離心后取上清液,用BioRad蛋白分析試劑盒測定蛋白濃度。將蛋白質樣品在8%～10%的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)上電泳后轉移到硝酸纖維素膜上,用5%的脫脂牛奶封閉。將膜與一抗在4 ℃孵育過夜,然后與二抗反應,用增強型化學發光試劑顯影印跡條帶,并用BioRad成像系統檢測,其中條帶信號強度用Quantity One軟件進行定量分析。JNK一抗、p38一抗、p27一抗、基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)一抗、基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)一抗、基質金屬蛋白酶抑制劑-1(TIMP-1)一抗、基質金屬蛋白酶抑制劑-2(TIMP-2)一抗均購于美國Abcam公司,稀釋濃度1∶1 000,以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內參。

1.6 免疫組織化學染色

對Ki67、α-平滑肌肌動蛋白(α-Actin)、平滑肌肌球蛋白重鏈(smMHC)和結蛋白進行免疫組織化學染色,石蠟包埋切片在85 ℃檸檬酸緩沖液中孵育5 min進行抗原修復。經5%正常山羊血清孵育后,用抗Ki67(GB111141,Servicebio)、α平滑肌肌動蛋白(GB111364,Servicebio)、平滑肌肌球蛋白重鏈(GB11805,Servicebio)的抗體共同孵育。脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記(TUNEL)法采用末端脫氧核苷酸轉移酶(TdT)介導的脫氧尿嘧啶(dUTP)缺口末端標記試劑盒檢測主動脈組織TUNEL陽性染色,在顯微鏡下拍攝圖像。

1.7 統計學處理

2 結 果

2.1 大鼠主動脈形態學

血管重塑是高血壓重要的結構改變和病理生理改變。對照組大鼠血管腔大小正常,內膜平滑無明顯增厚,DTRs組大鼠血管腔面積顯著減小,中膜增厚,p38組及JNK組DLEU1介導的血管中膜增厚的效應減輕,中膜/管腔面積比增加。詳見圖1。

圖1 各組大鼠主動脈形態學改變

2.2 各組大鼠腎臟組織學

腎臟組織學檢查顯示,DTR組大鼠腎組織中可見小動脈增生,血管壁和腎小球增厚。在p38和JNK抑制劑處理下,腎臟小動脈的病理改變有所改善。但各組大鼠的腎小球均無明顯損傷。詳見圖2。

圖2 各組大鼠腎臟組織學變化

2.3 DLEU1介導的p38/JNK磷酸化

RT-PCR檢測顯示,轉染過表達DLEU1質粒后,VSMCs中DLEU1的相對表達量顯著提高(P<0.05),這表明細胞模型構建成功。Western Blot檢測也發現,磷酸化p38(p-p38)和磷酸化JNK(p-JNK)蛋白的表達上調,表明DLEU1有激活VSMCs中p38/JNK通路磷酸化的作用。詳見圖3、圖4。

圖3 Western Blot檢測DLEU1介導的VSMCs中p-p38/ p-JNK蛋白表達

圖4 RT-PCR檢測VSMCs中DLEU1的相對表達量

2.4 各組細胞增殖率及細胞周期

BrdU實驗檢測細胞增殖結果發現,DLEU1過表達導致細胞增殖率顯著增加,經p38和JNK抑制劑處理后,細胞增殖率均有所下降(P<0.05)。流式細胞儀分析結果顯示,隨著DLEU1基因的過表達,S期細胞比例從33.12%顯著增加到46.16%,G0/G1期細胞比例從65.87%下降到42.40%。p38和JNK抑制劑可顯著阻斷細胞周期,處理后,G0/G1期細胞比例均有所上升,S期細胞比例無明顯變化。詳見圖5、圖6。

圖5 各組細胞增殖率比較

圖6 流式細胞儀檢測各組細胞周期的細胞比例

2.5 Western Blot檢測細胞中基質金屬蛋白酶相關蛋白表達

Western Blot檢測顯示,過表達DLEU1可顯著提高細胞中MMP-2和MMP-9的蛋白表達水平,阻斷p38和JNK可部分消除DLEU1對MMP-2和MMP-9蛋白表達的促進作用。而作為MMP-2和MMP-9抑制劑的TIMP-1和TIMP-2則表現出與MMP-2和MMP-9完全相反的變化。結果表明,DLEU1及其下游信號通路p38和JNK可通過TIMP-1/MMP-9和TIMP-2/MMP-2促進血管平滑肌細胞的重塑和增殖。詳見圖7。

圖7 各組基質金屬蛋白酶相關蛋白表達

2.6 p38/JNK在DLEU1介導的VSMCs遷移和表型改變中的作用

Boyden小室遷移實驗發現,DLEU1過表達可誘導更多的遷移VSMCs,這表明DLEU1誘導的遷移能力更強。經p38抑制劑和JNK抑制劑干預后,遷移細胞數量有所降低。觀察細胞形態發現,NC組VSMCs形態呈紡錘形,DLEU1過表達細胞多為成纖維細胞,經抑制劑處理后細胞形態恢復到對照狀態。Western Blot檢測顯示,骨橋蛋白(OPN)表達水平明顯上調,平滑肌22α(SM-22α)蛋白表達顯著下調。經p38抑制劑和JNK抑制劑干預后,OPN蛋白表達水平明顯降低,SM-22α蛋白表達水平上調。這些結果都表明,p38/JNK在DLEU1介導的VSMC遷移中起著關鍵作用。詳見圖8、圖9。

圖8 各組SM-22α、OPN蛋白表達條帶圖

圖9 Western Blot檢測各組SM-22α、OPN蛋白表達

3 討 論

本研究發現,DLEU1過表達大鼠表現出顯著的血管重構特征,表現為血管腔面積顯著減小、中膜增厚。DLEU1可促進平滑肌細胞增殖、細胞周期進展、遷移能力提高和VSMC合成表型的改變。此外,本研究還發現p38/JNK的磷酸化是介導DLEU1誘導高血壓的關鍵步驟。根據p38/JNK抑制劑的應用結果,推測DLEU1需要p38/JNK通路介導才能起到促進高血壓進展、促進VSMCs增殖、遷移和從收縮表型向合成表型的轉變。

高血壓的特點是血管功能和結構紊亂。動脈血管壁可分為內膜、中膜和外膜3層,內膜、中膜和外膜含有內皮細胞、血管VSMCs和細胞外基質等多種細胞成分[6]。血管VSMCs是動脈的主要細胞成分,也是血管疾病的關鍵決定因素。血管VSMCs增殖與血管重塑和高血壓密切相關,疾病進展可導致內膜-中層厚度增加,并導致動脈僵硬和血壓升高。VSMCs遷移是血管發育過程中的正常過程,也是血管損傷后組織修復的正常過程。然而,病理性遷移是導致血管重塑的主要因素,也是導致廣泛內膜增厚的關鍵[7]。與本研究結果一致,高血壓易感基因DLEU1的過表達促進了VSMCs的增殖、遷移和向綜合型轉化。

本研究探討了參與該過程的潛在信號通路,發現在DLEU1過表達模型中p38/JNK有明顯的磷酸化活性。有研究發現,SB203580對乙酰膽堿誘導的WKY正常大鼠的血壓沒有影響[8]。由于p38/JNK通路在正常狀態下并不能被激活,因此,認為p38/JNK抑制劑對正常大鼠的血壓沒有影響。p38/JNK的抑制劑可阻斷DLEU1誘導的細胞增殖、遷移和表型轉化作用。p38/JNK通路的激活是決定VSMCs功能和人類微血管內皮細胞程序性死亡的關鍵,該通路激活后可通過抑制血小板衍生生長因子受體β、p38和JNK介導的信號,防止血VSMCs的增殖和遷移,抑制新生內膜的形成。主動脈VSMCs周期性機械牽張可引起JNK和p38依賴的細胞死亡,JNK和p38抑制劑可減少細胞死亡,這可能對急性血壓升高引起的主動脈夾層有一定的臨床價值。

基質金屬蛋白酶和金屬蛋白酶組織抑制因子已被廣泛認為與高血壓相關的主動脈和肺動脈基質重塑有關。TIMP-1和TIMP-2分別與基質金屬蛋白酶前體-9(pro-MMP-9)和基質金屬蛋白酶前體-2(pro-MMP-2)結合,并作為MMP-2和MMP-9的抑制劑[9]。TIMP-1/MMP-9和TIMP-2/MMP-2在不同類型的細胞中與p38和JNK有潛在的相關性。p38信號被證實是MC3T3-E1細胞分泌和激活MMP-2所必需的[10],特異性p38抑制劑SB203580可抑制大鼠肺成纖維細胞MMP-2的表達[11]。非小細胞肺癌細胞中的MMP-2和MMP-9都被認為是p38信號通路的下游效應分子[12]。下調p38MAPK和JNK可降低人肺腺癌細胞MMP-2和MMP-9的表達[13]。研究表明,JNK抑制劑可以降低表皮生長因子介導的HTR-8/SVneo滋養層細胞MMP-9/TIMP-1的比率[14]。本研究發現,p38/JNK參與了DLEU1誘導的高血壓VSMCs的增殖、遷移和表型改變。

綜上所述,本研究發現,高血壓時DLEU1介導的VSMCs增殖和表型改變需要p38/JNK通路介導。這為高血壓的遺傳學和生物學基礎提供了新的見解,并為進一步研究針對DLEU1和p38/JNK的干預策略以對抗高血壓提供了實驗基礎。