雙氫青蒿素對AngⅡ誘導的心肌成纖維細胞及NLRP3炎性小體活性的影響

單鐵強,栗志英,張素華,蔡安盛,姚曉華,杜相珠,行紅燕,郭永澤,馬景紅

心臟在多種有害因素的長期或持續作用下,心肌細胞受損,而位于心肌細胞之間的成纖維細胞被過度活化,細胞增殖分裂能力及分泌活性均增強,加上在其他生物學因子的共同作用下,膠原等基質成分的分泌量大于降解量,造成其大量沉積且質地變硬,導致心肌發生纖維化病變[1-2]。此種病變使心肌細胞血氧缺乏,收縮能力下降,心肌傳導系統功能異常,病人容易出現心律失常、心功能衰竭甚至猝死等嚴重病情而危及生命[3-4]。因此,探尋有效抑制成纖維細胞過度活化的措施為治療心肌纖維化的重點。雙氫青蒿素(DHA)源自于青蒿素,除作為優選的抗瘧藥物外,還具有抗病原微生物、降低炎癥反應、抑制腫瘤及抗纖維化等藥效[5-6]。血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)作用于機體多種組織內的間質細胞,誘導其異常增殖、分裂及分泌過多的膠原等基質成分,促進組織發生纖維化病變[7-8]。本研究以新生鼠心室肌的成纖維細胞為研究對象,在體外采用AngⅡ誘導并制備纖維化細胞模型,經DHA干預后分析細胞增殖、轉分化及激活NOD樣受體熱蛋白結構域相關蛋白3(NLRP3)炎性小體的作用,為拮抗心肌纖維化的新藥研發提供新策略。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

新出生2 d的SD大鼠,由河北醫科大學組胚教研室贈送。

1.1.2 藥物與試劑

DHA購自陜西信康生物公司;AngⅡ、酶聯免疫分析膠原蛋白含量的試劑盒由合肥萊爾生物有限公司提供;α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、NLRP3、半胱氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)和白細胞介素-1β(IL-1β)第一抗體均由Abcam提供。

1.2 方法

1.2.1 消化組織、分離細胞

取5只新出生2 d的SD大鼠,充分麻醉,將其整只噴乙醇進行消毒后,置于超凈實驗臺上,剖開胸部露出心臟,剪下適當體積的心室肌組織塊,洗凈組織表面的血液和黏液,浸入盛有D-Hank′s的培養皿中,剪為細小顆粒后加入胰酶進行溫浴消化40 min,濾網除去殘渣,采用4 ℃、直徑12 cm的離心機,以600 r/min速率離心10 min,離心后的細胞加入適量孵育液置于細胞培養箱中,根據成纖維細胞與其他細胞貼壁時間差異,將其純化。少許細胞用作類型鑒定,其余用于后續實驗。

1.2.2 細胞增殖實驗

細胞孵育3 d時,消化、懸浮并移置96孔培養板中,分為正常組、DHA對照組、AngⅡ組、DHA處理組,每組6孔。正常組:細胞孵育液中孵育;DHA對照組:含有DHA的細胞孵育液中孵育;AngⅡ組:含有AngⅡ的細胞孵育液中孵育;DHA處理組:含有DHA和AngⅡ的細胞孵育中孵育。孵育液中DHA、AngⅡ的濃度分別為100 ng/mL、10-7mol/L。在細胞培養箱中孵育48 h后,向每孔里加入適量的噻唑藍溶液,反應4 h后棄掉每孔的液體,向每孔中加入等量的二甲基亞砜溶液,于暗室中孵育15 min,上機記錄每孔的吸光度值,計算出每組平均吸光度值。

1.2.3 檢測孵育液中膠原含量

4組成纖維細胞經48 h的孵育,通過酶聯免疫試劑盒檢測出4組孵育液中的Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白含量。

1.2.4 蛋白免疫印跡(Western Blot)實驗

將各組細胞置于冰塊上進行裂解,裂解液采用4 ℃、直徑20 cm的離心機,設置速度14 000 r/min,時間30 min,檢測上清液中的蛋白含量。40 μg蛋白中加入10 μL上樣緩沖液,沸水浴中變性,冷卻后加入凝膠孔中,依次通過電泳、膜轉移、封閉,清洗后浸入α-SMA(1∶800)、NLRP3(1∶1 000)、Caspase-1(1∶1 000)、IL-1β(1∶1 200)以及β-actin(1∶1 500)一抗液中4 ℃過夜,清洗后浸入第二抗體液(1∶1 500)中2 h,通過成像儀獲取目標蛋白的灰色條帶,分析并比較其灰度均值。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.1 成纖維細胞的培養和鑒定

新消化下來的細胞呈球狀,孵育2 d后,細胞貼壁鋪展,體積增大,單個細胞為有突起的不規則狀,詳見圖1A;爬片的細胞依次經蘇木精和伊紅染色后,藍色的圓核位于細胞中央,可見核仁,核周圍為淺色的胞質,詳見圖1B;細胞與波形蛋白免疫染色后為陽性,詳見圖1C。

圖1 成纖維細胞生長狀態和類型鑒定(×400)

2.2 心肌成纖維細胞增殖情況

4組心肌成纖維細胞經過48 h的孵育,通過比較每組細胞的吸光度值來衡量其增殖情況。正常組和DHA對照組吸光度值比較差異無統計學意義(P>0.05),AngⅡ組吸光度值高于正常組(P<0.05),DHA處理組吸光度值低于AngⅡ組(P<0.05)。詳見表1。

表1 4組吸光度值、Ⅰ型膠原含量、Ⅲ型膠原含量比較

2.3 細胞分泌膠原蛋白含量比較

正常組和DHA對照組Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白含量比較差異均無統計學意義(P>0.05),AngⅡ組Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白含量均高于正常組(P<0.05),DHA處理組Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白含量均低于AngⅡ組(P<0.05)。詳見表1。

2.4 細胞表型分子α-SMA表達比較

正常組和DHA對照組細胞表型分子α-SMA表達比較差異無統計學意義(P>0.05);與正常組比較,AngⅡ組細胞表型分子α-SMA表達升高(P<0.01);與AngⅡ組比較,DHA處理組細胞表型分子α-SMA表達降低(P<0.01)。詳見圖2、表2。

表2 4組細胞α-SMA、NLRP3、Caspase-1及IL-1β相對表達比較

圖2 4組細胞α-SMA、NLRP3、Caspase-1及IL-1β表達條帶圖

2.5 細胞內NLRP3、Caspase-1和IL-1β表達比較

正常組和DHA對照組細胞內NLRP3、Caspase-1和IL-1β表達比較差異均無統計學意義(P>0.05);與正常組比較,AngⅡ組細胞內NLRP3、Caspase-1和IL-1β升高(P<0.01);與AngⅡ組比較,DHA處理組細胞內NLRP3、Caspase-1和IL-1β降低(P<0.01)。詳見圖2、表2。

3 討 論

心肌纖維化為在多種有害因素(如血氧不足、炎癥、代謝紊亂等)的刺激下,心肌間質中的主要細胞成纖維細胞的活性異常增強,出現細胞增殖以及合成和釋放Ⅰ、Ⅲ型膠原等基質成分過度沉積所致。通常表現為心壁增厚和僵硬程度增加,為冠心病、心律失常、心肌重構以及心功能不全等多種心臟疾病進展的共同病理基礎[9-10]。心肌組織發生纖維化的過程與多種細胞因子[如促纖維化因子轉化生長因子-β(TGF-β)、AngⅡ]以及炎性因子[腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-1(IL-1)]等的參與和調節關系密切[11-12]。AngⅡ作為心肌組織局部的一種調節因子對心肌組織發生纖維化具有助推作用,其自身或與其他細胞因子結合刺激成纖維細胞分裂增殖、轉分化、合成并釋放膠原等基質成分,進而促進組織纖維化病變的進程[13-15]。因此,采用AngⅡ制備纖維化細胞模型已被普遍應用。本實驗利用AngⅡ體外刺激后,細胞數目增加,表型分子α-SMA表達升高,釋放到孵育液中Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的含量增多,這充分表明AngⅡ已經成功地誘導成纖維細胞為纖維化細胞。

NLRP3炎癥小體是一種能夠對多種因素刺激(包括AngⅡ)作出反應的關鍵炎性介質,組織中此小體表達增高能夠加速所在器官發生纖維化病變[16-17]。相關研究結果表明,博來霉素能誘導肺泡上皮細胞向間充質細胞轉分化,細胞內NLRP3小體各成分表達升高并激活其下游的炎性因子IL-1β和白細胞介素-18(IL-18),加速了肺臟的纖維化;當NLRP3小體被抑制或敲除后,減弱二氧化硅誘導的上皮間充質轉分化和炎性因子的表達[18]。四氯化碳誘導大鼠肝臟發生纖維化后,檢測纖維化組織中NLRP3小體各成分表達升高并激活其下游的炎性因子IL-1β;采用香葉木素干預后,NLRP3小體各成分以及IL-1β表達降低,肝纖維化程度也得到了明顯改善[19]。趙雅欣等[20]研究表明,AngⅡ能誘導乳鼠心肌組織中的成纖維細胞增殖,上調細胞內的NLRP3、Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原的蛋白和mRNA表達;用RNA干擾(RNAi)沉默NLRP3后,細胞內的NLRP3、Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原的蛋白和mRNA表達下調。單鐵英等[21]已證實AngⅡ能提高子宮內膜間質細胞增殖能力,促進其分泌Ⅰ型膠原和纖黏連蛋白的含量,激活細胞內NLRP3炎癥小體。本研究結果顯示,AngⅡ能刺激成纖維細胞內NLRP3、Caspase-1及IL-1β的含量升高,這說明AngⅡ能激活該細胞內NLRP3炎性小體的活性。

DHA是用青蒿素首次合成的還原衍生物,其醫治瘧疾的藥效優于青蒿素。除此之外,DHA還具有降低炎癥反應、多途徑抑制腫瘤及減輕組織纖維化程度等作用[22-23]。實驗研究顯示,結扎大鼠膽管制備肝纖維化的過程中,腹腔注射DHA能有效降低肝組織中α-SMA及Ⅰ型前膠原蛋白的含量,抑制肝纖維化并提高其功能指標[24]。通過博來霉素誘導大鼠肺組織發生纖維化病變時,干預后發現早期大鼠血清中的炎性因子IL-1β、白細胞介素-6(IL-6)及TNF-α水平降低,后期肺組織中羥脯氨酸含量降低,膠原沉積面積縮小,提示DHA能減輕早期肺泡炎癥和后期肺纖維化[25]。研究證實DHA通過抑制腎組織成纖維細胞數量及其轉分化、Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原和纖連蛋白的含量來緩解輸尿管梗阻導致的腎組織纖維化[26]。體內、體外實驗均表明,青蒿素不僅能拮抗AngⅡ刺激人腎皮質近曲小管上皮細(HK-2)內NLRP3炎性小體活性,而且也能通過降低大鼠行次全切腎組織中NLRP3炎性小體各成分的含量來阻止其組織內的炎癥和纖維化改變[27-28]。

綜上所述,AngⅡ能刺激成纖維細胞的增殖、表型轉化,分泌Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原蛋白以及增加細胞內的NLRP3、Caspase-1和IL-1β的表達;DHA能夠明顯拮抗AngⅡ刺激成纖維細胞的上述活性。說明DHA能有效通過降低細胞內NLRP3炎性小體的活性拮抗AngⅡ誘導成纖維細胞的纖維化改變。