茶多酚對植物乳桿菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌生長的雙向調節作用

江福林，盧云浩，何 強,

（1.四川大學輕工科學與工程學院，四川成都 610065；2.成都大學食品與生物工程學院，四川成都 610106）

益生菌，是指攝入一定量會給宿主帶來健康益處的活的微生物，通常包括乳酸桿菌、雙歧桿菌、芽孢桿菌和酵母菌[1]。植物乳桿菌是益生菌中使用最普遍的細菌種類之一，因其良好的生物活性和保健功能被廣泛應用于各類食品生產中，如乳制品、發酵肉制品、飲料以及焙烤制品等[2-4]。然而，在食品加工過程中，益生菌的增殖及代謝活性會因處理溫度、加工方式、水分含量以及生長環境酸堿度等生產條件的影響而降低，進而給產品品質帶來負面影響[5]。此外，食源性致病菌及腐敗菌的污染也會導致品質劣變、安全性降低，引發食品安全問題[6]。因此，增強益生菌產品中益生菌的活性，同時抑制其中腐敗菌以及致病菌的生長繁殖，能夠提高產品的品質及安全性，增強其經濟效益。

茶多酚是茶葉中多酚類物質的總稱，其主要活性成分包括表兒茶素、表沒食子兒茶素（Epigallocatechin，EGC）、表兒茶素沒食子酸酯（Epicatechin gallate，ECG）和表沒食子兒茶素沒食子酸酯（Epigallocatechin gallate，EGCG）[7]。茶多酚具有良好的廣譜抗菌性，可以有效地抑制常見食源性致病菌的生長及毒素的產生[8]。如EGCG 可以抑制金黃色葡萄球菌對葡萄糖的攝入，并且能夠與細胞膜蛋白結合，導致細胞損傷及破裂[9]。王文娟等[10]也發現隨著茶多酚濃度增加，其對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和鼠傷寒沙門氏菌生長的抑制效果不斷增強。除了能限制致病菌等微生物的生長外，茶多酚還能發揮益生元的作用，刺激某些益生菌的生長，如嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌等[11]。Tabasco 等[12]研究發現，濃度為0.25～1.0 mg/mL 的多酚（包括兒茶素、表兒茶素和黃烷-3-醇）可以有效刺激乳酸菌的生長。此外，EGCG 能夠促進腸道內乳桿菌屬的增殖及短鏈脂肪酸和乳酸的合成[13]。然而，有研究表明，當濃度超過乳酸菌的耐受范圍，茶多酚仍然會發揮抗菌作用。如潘冬梅等[14]發現當培養基中的茶多酚添加量超過0.6%時會抑制植物乳桿菌的生長。因此，控制好茶多酚的用量是決定其發揮益生作用或抑菌作用的重要因素。

從上述研究可以看出，已有研究者關于茶多酚對益生菌的益生作用以及對致病菌的抑菌作用分別展開了研究，但目前關于茶多酚同時發揮益生作用和抑菌作用的邊界濃度的研究鮮有報道。基于此，本研究選擇益生菌植物乳桿菌、致病菌金黃色葡萄球菌和大腸桿菌作為目標菌株，探究茶多酚發揮雙向調節作用的邊界濃度，以期為茶多酚在益生菌產品中的應用提供參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarumCICC 6253）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureusATCC 29213）和大腸桿菌（Escherichia coliATCC 43889）中國工業微生物菌種保藏管理中心；茶多酚（純度：98%） 上海源葉生物科技有限公司；甲酸、乙腈 色譜純，成都金山化學試劑有限公司；MRS 肉湯培養基、MRS 瓊脂培養基、營養肉湯、營養瓊脂、乳酸桿菌選擇培養瓊脂（LBS）、Baird-Parker 瓊脂培養基（BP）、伊紅美藍瓊脂培養基（EMB）青島海博生物有限公司。

SQP QUINTIX213-1CN 電子天平 德國賽多利斯科學儀器有限公司；ZWY-2102C 恒溫振蕩培養箱 上海智城分析儀器制造有限公司；BG-160 恒溫培養箱 上海博迅醫療生物儀器有限公司；D3024R臺式冷凍離心機 美國賽洛捷克（SCILOGEX）公司；Varian 1200LC/MS Var 液相色譜-質譜聯用儀美國Varian 公司；FiveEasy plus pH 計 德國梅特勒托利多公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 高效液相色譜-質譜法（HPLC-MS）測定茶多酚成分 用超純水配制濃度為1.0 mg/mL 的茶多酚，經0.22 μm 濾膜過濾，使用Eclipse Plus C18 色譜柱（Agilent，4.6 mm×250 mm×5 μm）測定茶多酚中所含兒茶素成分，并根據峰面積計算其相對含量[15]。色譜條件：柱溫30 ℃，流動相A 為0.5%甲醇-水溶液，B 為乙腈，流速1 mL/min，進樣量10 μL，檢測波長260 nm。洗脫程序為0～50 min，流動相B 由2%線性增至25%。質譜條件：負離子模式，輔助氣壓力3.0×105Pa，霧化氣壓力1.5×105Pa，毛細管電壓4.5 kV，毛細管溫度350 ℃，質量掃描范圍m/z 100～1000。

1.2.2 菌種活化 將保存在-20 ℃的植物乳桿菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌分別接種于MRS 肉湯培養基、營養肉湯培養基中，在37 ℃下培養24 h，反復活化2 次。實驗前用無菌磷酸鹽緩沖液（0.01 mol/L，pH6.8）將不同菌液進行適度稀釋，得到濃度約為0.5×108CFU/mL 的菌懸液。

1.2.3 單培養 將1 mL 植物乳桿菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌菌懸液分別接種于50 mL 含有不同質量濃度茶多酚（0、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0 mg/mL）的MRS 肉湯培養基中，于37 ℃、120 r/min 條件下培養24 h。培養結束后，對菌液進行適度稀釋，將稀釋菌液分別均勻涂布于MRS 瓊脂培養基（植物乳桿菌）和營養瓊脂培養基（金黃色葡萄球菌和大腸桿菌）上，于37 ℃下培養48 h 后，進行計數。實驗重復三次。

1.2.4 共培養 準確稱取0.10、0.20 g 茶多酚溶解于50 mL MRS 肉湯培養基中，得到濃度分別為0、2.0、4.0 mg/mL 的培養基。吸取植物乳桿菌和金黃色葡萄球菌菌懸液各1 mL 同時接種于該培養基中，于37 ℃、120 r/min 條件下培養。分別于0、5、15、20、25、30、35 h 取樣，測定pH 和活菌數。對共培養菌液進行適度稀釋，將稀釋菌液均勻涂布于LBS培養基和BP 培養基上，于37 ℃下培養48 h 后，對植物乳桿菌、金黃色葡萄球菌進行計數。植物乳桿菌與大腸桿菌的共培養采用同樣的方法，選用EMB瓊脂培養基對大腸桿菌進行計數。實驗重復三次。

1.2.5 微生物群落的測定

1.2.5.1 PCR 擴增和Illumina Miseq 測序 基于實驗1.2.3，收集茶多酚濃度為0、2.0 mg/mL 條件下，共培養0、35 h 時的菌液，于4 ℃、8000 r/min 下離心15 min，收集沉淀物用于后續實驗。分組如下：金黃色葡萄球菌-植物乳桿菌：S0：無茶多酚，0 h；S：無茶多酚，培養35 h；ST：含茶多酚，培養35 h；大腸桿菌-植物乳桿菌：E0：無茶多酚，0 h；E：無茶多酚，培養35 h；ET：含茶多酚，培養35 h。使用E.Z.N.A.?soil DNA 試劑盒（Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.）提取微生物群落總DNA。使用引物338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和806R（5'-GG ACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）對16S rRNA 基因V3～V4 可變區進行PCR 擴增。擴增程序如下：95 ℃預變性3 min，27 個循環（95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s），然后在72 ℃穩定延伸10 min。

將同一樣本的PCR 產物混合后使用2%瓊脂糖凝膠回收PCR 產物，利用AxyPrep DNA Gel Extraction 試劑盒（Axygen Biosciences，Union City，CA，USA）進行回收產物純化，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用Quantus? Fluorometer（Promega，USA）對回收產物進行檢測定量。使用NEXTFLEX Rapid DNASeq 試劑盒進行建庫：接頭鏈接；使用磁珠篩選去除接頭自連片段；利用PCR 擴增進行文庫模板的富集；磁珠回收PCR 產物得到最終的文庫。利用Illumina公司的Miseq PE300/NovaSeq PE250 平臺進行測序（上海美吉生物醫藥科技有限公司）。

1.2.5.2 測序數據處理 使用FASTP 0.20.0[16]對原始測序序列進行質控，使用FLASH 1.2.7[17]進行拼接：過濾reads 尾部質量值20 以下的堿基，設置50 bp的窗口，如果窗口內的平均質量值低于20，從窗口開始截去后端堿基，過濾質控后50 bp 以下的reads，去除含N 堿基的reads；根據PE reads 之間的overlap關系，將成對reads 拼接成一條序列，最小overlap 長度為10 bp；拼接序列的overlap 區允許的最大錯配比率為0.2，篩選不符合序列；根據序列首尾兩端的barcode 和引物區分樣品，并調整序列方向，barcode允許的錯配數為0，最大引物錯配數為2。使用UPARSE 7.1 對相似度為97%的操作分類單位進行聚類并刪除嵌合序列[18]。利用RDP classifier 2.2 對每條序列進行物種分類注釋，比對Silva 16S rRNA數據庫（v138），設置比對閾值為0.7[19]。

1.3 數據處理

實驗結果均以平均值±標準差表示。使用SPSS 26.0 進行方差分析、顯著性分析，P<0.05 時為差異顯著；使用Origin 2021 進行繪圖。所有實驗重復三次，每個實驗設置三個平行樣品。使用美吉云平臺（https://cloud.majorbio.com/）對共培養微生物進行PCoA 分析，并基于Kruskal-Wallis 秩和檢驗進行組間物種差異分析。

2 結果與分析

2.1 茶多酚的色譜圖

茶多酚的HPLC 圖如圖1 所示，經對比鑒定，本實驗茶多酚的主要酚類物質為沒食子兒茶素（Gallocatechin，GC）、EGC、EGCG、ECG，各相對含量分別為4.25%、6.62%、38.87%和11.11%，總兒茶素含量為60.85%。

圖1 茶多酚的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of tea polyphenols

2.2 單培養條件下茶多酚對微生物的影響

在單培養條件下，茶多酚對益生菌植物乳桿菌、致病菌金黃色葡萄球菌和大腸桿菌生長的影響如圖2 所示。對植物乳桿菌而言，培養結束后，對照組的活菌數為9.15 lg CFU/mL；當茶多酚濃度小于2.0 mg/mL 時，與對照組相比，植物乳桿菌的活菌數增加量并不顯著（P>0.05）；而當茶多酚濃度為2.0、4.0 mg/mL 時，植物乳桿菌活菌數分別增加了0.25和0.21 lg CFU/mL，說明該濃度范圍的茶多酚對植物乳桿菌具有顯著的益生作用（P<0.05）。Zhao 等[20]在含副干酪乳桿菌的發酵豆漿中添加了2%（w/v）綠茶提取物，菌株的生物量增加了0.21 lg CFU/mL（P<0.05）。張雪婷等[21]也發現添加量為0.75%（w/v）的茶多酚能夠顯著提高嗜酸乳桿菌的存活率。多酚對乳酸菌的益生作用可以歸因于其抗氧化能力，因為酚類化合物可以防止膜脂質過氧化，保護膜的流動性[22]。另一方面，酚類化合物能夠引起乳酸菌的基因表達發生變化，例如負責碳水化合物代謝、特定酶合成以及細胞壁和膜合成的基因表達增加[11]。然而，當茶多酚濃度增大至6.0 mg/mL 時，植物乳桿菌活菌數減少了0.05 lg CFU/mL，說明此濃度的茶多酚抑制了植物乳桿菌的生長，這與Alberto 等[23]的研究結果一致，3 mg/mL 的沒食子酸使得希氏乳桿菌的存活率降低了26%，這可能是因為高濃度多酚破壞了細菌細胞壁的完整性，阻礙乳酸菌的代謝[24]。結果表明，茶多酚對植物乳桿菌生長的影響是呈濃度依賴性的，即適宜濃度的茶多酚能夠促進植物乳桿菌的生長，而高濃度則抑制生長。

圖2 茶多酚對植物乳桿菌、金黃色葡萄球菌和大腸桿菌活菌數的影響Fig.2 Effects of tea polyphenols on the viable counts of L.plantarum,S.aureus,and E.coli

金黃色葡萄球菌和大腸桿菌是引起人類感染和食物中毒的常見腐敗菌和致病菌[25-26]，抑制其在食品中的生長繁殖對于食品衛生和消費者健康至關重要。茶多酚對金黃色葡萄球菌生長的影響如圖2 所示。可以看出，金黃色葡萄球菌的活菌數隨著茶多酚濃度的增加而不斷減少。培養結束后，金黃色葡萄球菌對照組的活菌數達到了9.30 lg CFU/mL，而茶多酚濃度為0.5 mg/mL 時，活菌數為4.82 lg CFU/mL，相比對照組而言減少了4.48 lg CFU/mL。當茶多酚濃度為2.0、4.0 mg/mL 時，金黃色葡萄球菌活菌數分別減少了5.14 和6.50 lg CFU/mL；在6.0 mg/mL時則檢測不到金黃色葡萄球菌活菌數。

茶多酚對大腸桿菌生長的影響如圖2 所示。與金黃色葡萄球菌類似，大腸桿菌的活菌數隨著茶多酚濃度的增加而不斷降低。培養結束后，對照組的活菌數為8.98 lg CFU/mL，當茶多酚濃度為2.0 mg/mL時，大腸桿菌活菌數減少了0.18 lg CFU/mL，不存在顯著性差異（P>0.05）；而當茶多酚濃度增大至6.0 mg/mL 時，大腸桿菌活菌數降低了0.66 lg CFU/mL。由此可以看出，金黃色葡萄球菌對茶多酚的敏感性大于大腸桿菌，這與Bouarab-Chibane 等[27]的研究結果一致，其發現EGCG 對金黃色葡萄球菌的抗菌活性高于大腸桿菌。兩株致病菌對多酚呈現出差異敏感性可能是因為二者細胞壁結構不同。與大腸桿菌不同，金黃色葡萄球菌不含覆蓋細胞壁的脂多糖外膜，因此，多酚可以更容易破壞金黃色葡萄球菌細胞壁的完整性，從而阻礙其代謝和生物合成[28-29]。

2.3 共培養條件下茶多酚對活菌數及pH 的影響

為了說明共培養過程中茶多酚對益生菌和致病菌生長的影響，進一步研究了茶多酚濃度為0、2.0、4.0 mg/mL 時植物乳桿菌與金黃色葡萄球菌或大腸桿菌共培養時的生長曲線。如圖3A～圖3C 所示，當植物乳桿菌與金黃色葡萄球菌以初始比例為1:1 共培養時，無論茶多酚是否存在，乳酸菌的數量均隨著培養時間的推移而不斷增加，最終活菌數分別為9.45、9.60 和9.57 lg CFU/mL，這與單培養時的結果一致，說明茶多酚促進了植物乳桿菌的增殖。有研究表明植物乳桿菌自身能夠合成相關酶類以代謝某些酚類化合物，進而促進生長代謝[11]。然而，在共培養過程中，含茶多酚的培養基中的金黃葡萄球菌數量不斷減少，且始終顯著低于對照組（P<0.05），說明其生長受到抑制。培養基pH 受植物乳桿菌代謝產酸的影響，隨著培養時間增加而不斷降低，最后趨于穩定，最終pH 分別為3.84、3.79 和3.78，說明茶多酚促進了植物乳桿菌的代謝產酸量。乳酸菌產生有機酸會降低生長環境 pH，對其競爭對手產生不利影響[30]。

圖3 茶多酚對益生菌與致病菌共培養過程中的活菌數和培養基pH 的影響Fig.3 Effects of tea polyphenols on the number of viable bacteria and pH of medium during the co-culture of probiotic with pathogen

當大腸桿菌與植物乳桿菌共培養時，也觀察到類似的現象。如圖3D～圖3F 所示，植物乳桿菌的活菌數隨著培養時間的增加而不斷增加，大腸桿菌活菌數和培養基pH 不斷下降，并且含茶多酚的培養基中的大腸桿菌數量顯著低于對照組（P<0.05）。值得注意的是，無論茶多酚是否存在，共培養中致病菌的數量都明顯低于單培養體系中的數量（P<0.05），說明植物乳桿菌與茶多酚可能存在協同抑菌效果。Bauza-Kaszewska 等[31]研究發現大腸桿菌與鼠李糖乳桿菌在含樹莓多酚的培養基中共培養時，大腸桿菌的存活率顯著降低（P<0.05），而鼠李糖乳桿菌的生長不受影響甚至得到促進。共培養條件下致病菌的生長受到抑制，一方面是因為酚類化合物可能會導致致病菌的細胞壁和DNA 受損，從而抑制其生長[32]；另一方面，乳酸菌的代謝產物，如細菌素和有機酸，可以限制致病菌在共培養時的生長繁殖[11]。結果表明，在共培養條件下，適宜濃度的茶多酚對益生菌植物乳桿菌、致病菌金黃色葡萄球菌和大腸桿菌具有雙向調節作用，即它在促進植物乳桿菌生長的同時能夠抑制金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的生長。

2.4 微生物群落分析

為了避免傳統計數造成的誤差，使用高通量測序進一步研究了益生菌與致病菌共培養時微生物的組成。采用PCoA 和ANOSIM 分析不同樣本之間的差異性，P<0.05 表示差異顯著，且R值越大，組間差異越大。如圖4 所示，在金黃色葡萄球菌和植物乳桿菌共培養體系中，樣品S0 與S、ST 呈離散分布（R=0.778，P=0.004），在大腸桿菌和植物乳桿菌共培養體系中也可以觀察到類似的結果（R=0.679，P=0.003），說明共培養35 h 后微生物群落組成發生明顯變化，并且各組之間存在顯著性差異。

圖4 基于OTU 水平的PCoA 分析Fig.4 PCoA at the OTU level

樣本與物種關系圖是一種描述樣本與物種之間對應關系的可視化圈圖，該圖能夠反映每組樣本的優勢物種組成比例以及各優勢物種在不同樣本中的分布比例[33]。由圖5 可知，在兩組共培養體系中，乳桿菌屬的相對豐度均顯著增加（P<0.01），并且在培養結束后成為優勢微生物，而葡萄球菌屬和大腸埃希氏菌屬的相對豐度則顯著減少（P<0.01）。

圖5 基于屬水平的樣本與物種關系圖Fig.5 Relationship between sample and specie at the genus level

基于樣本中群落豐度數據，評估了不同樣本之間物種差異的顯著性，結果如圖6 所示。當植物乳桿菌和金黃色葡萄球菌共培養結束后，乳桿菌屬在樣本S（不含茶多酚）和ST（含茶多酚）的相對豐度差異在5%水平上顯著，在樣本S 與S0、ST 與S0 的相對豐度差異在1%的水平上顯著。葡萄球菌屬在各樣本之間的差異水平與乳桿菌屬相同。在植物乳桿菌和大腸桿菌的共培養體系中，乳桿菌屬和大腸埃希氏菌屬在樣本E 與E0、ET 與E0 的相對豐度差異均在1%水平上顯著。因此，高通量測序結果進一步闡明，在共培養條件下，兩株致病菌的生長因茶多酚的存在而受到抑制，而植物乳桿菌仍然可以很好地增殖，這與2.3 的研究結果一致，說明了茶多酚對益生菌和致病菌的生長具有雙向調節作用。

圖6 基于屬水平的組間物種差異Fig.6 Species differences among groups at the genus level

3 結論

本研究探討了不同質量濃度的茶多酚對益生菌植物乳桿菌、致病菌金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的影響。在單培養體系中，適宜濃度（2.0～4.0 mg/mL）的茶多酚能夠顯著促進植物乳桿菌的增殖，而高濃度則體現抑制效果。茶多酚對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌具有顯著的抑菌活性，且對金黃色葡萄球菌的抑菌性顯著強于大腸桿菌。當益生菌與致病菌共培養時，受茶多酚和生長環境pH 的雙重影響，致病菌數量隨著培養時間延長而不斷減少，益生菌數量則不斷增加，并且茶多酚能夠促進益生菌的生長。綜上所述，適宜濃度的茶多酚對益生菌和致病菌的生長具有雙向調節作用，該研究結果對于茶多酚在益生菌產品中的應用具有積極意義，有望提升食品的生物安全性。

本文初步研究了茶多酚對益生菌和致病菌的雙向調節作用，但其調節機制尚不明確，后續可以從代謝、基因表達等層面深入闡明茶多酚發揮雙向調節作用的詳細機制。另外，將雙向調節濃度下的茶多酚應用于食品實際生產中，探究其對食品品質及風味的影響也是未來的研究重點。