中國紅富士蘋果糖、酸、多酚分析及產區溯源模型構建

劉毓超，王 輝，賈一鳴，張 曉，朱麗霞,3,

（1.塔里木大學食品科學與工程學院，新疆阿拉爾 843300；2.塔里木大學信息工程學院，新疆阿拉爾 843300；3.南疆特色農產品深加工兵團重點實驗室，新疆阿拉爾 843300）

蘋果是世界四大水果之一，在我國的種植面積與產量約占全世界總面積和總產量的50%[1]。而紅富士蘋果又是我國蘋果栽種面積最大的品種，其產量超過我國蘋果總產量一半之多[2]。我國紅富士蘋果主產區有黃土高原（陜、甘、晉、豫）、環渤海灣（遼、魯）、西南冷涼（云、川）和新疆特色產區等[3]。紅富士蘋果的生長因受海拔和氣候環境條件的影響，在不同種植地區的果實品質會存在一定差異。山東煙臺果實形態外觀端正，果肉甜脆[4]。云南昭通果實成熟后呈金黃色（部分）、果肉細膩[5]。陜西果實果形碩大且尺寸均勻、顏色鮮艷[6]。甘肅靜寧果實脆甜汁多[7]。河南靈寶果實果面紅潤、酸甜可口[8]。新疆阿克蘇果實皮薄肉脆，尤其果核周圍形成了透明無色罕見的“冰糖心”結構[9]。隨著我國蘋果研究的不斷深入和產業的不斷發展，對蘋果已從外在品質轉入更深層次的內在營養品質的研究[10]。蘋果營養品質包括風味[11]、滋味[11]、質地[12]、糖類物質[13]、有機酸[14]、多酚[15]、礦物質元素及微量元素[16]等。蘋果果實營養品質是其商品等級劃分的重要標志，從根本上決定其市場競爭力。近年來市場中出現假冒紅富士蘋果的現象，以新疆阿克蘇紅富士蘋果為例，不僅擾亂真正阿克蘇紅富士蘋果的銷售市場，而且還破壞了其國家地理標志保護產品的稱號，因此對各產區紅富士蘋果進行溯源并保護其地理標志顯得尤為重要[17]。

農產品產地溯源是農產品溯源體系的重要組成部分，有利于實施農產品原產地保護戰略，保護名牌，保護特色產品，穩定市場秩序[18]。常見的農產品溯源方法有感觀特性評價、特征成分指紋圖譜分析[19]、光譜分析[20]、基因技術[21]、穩定同位素法[22]、礦物元素分析[23]、微生物圖譜[24]等。張雁鳴等[25]利用穩定同位素對不同省份的西瓜進行了溯源研究，可以實現新疆、廣西、海南和山東4 個產地的西瓜樣本區分；李富榮等[26]檢測分析不同產地陳皮中32 種礦質元素含量的差異，篩選基于礦質元素指紋分析技術的有效產地溯源指標。上述溯源方法在檢測分析時需依靠相關高精檢測設備，但設備普及性相對較差，多數測試基于科研機構委托，使得市場應用受到限制，而且當地土地施肥、果實的果品和品級對溯源有不小的影響，使得溯源的精準度受制于果實品質品級。同時，這些檢測分析手段，忽略了農產品市場消費者感興趣的果品營養品質特色品質，使得地方果品特色品質的開發與市場應用受限。由此，基于地方果品營養品質，選用更為廣譜性的檢測分析方法，開發助于農產品特色品質挖掘與產業發展的新型溯源方式值得探索。

本文對多產區紅富士蘋果營養品質指標進行檢測并結合產區氣象因子分析，對比各產區果實糖、總酸、糖酸比、總酚、多酚等18 個營養品質指標差異。采用正交偏最小二乘判別分析和線性判別分析對果品地方特色品質評價指標進行篩選建模，同時篩選出的營養品質指標也可用于農產品溯源，不僅操作簡單，而且節省成本，在能起到農產品追溯區分的同時可以為農產品產地和品牌的保護作用提供支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

冰乙酸、丙酮、硫酸、硼酸、鹽酸、β-羥基乙醇、鄰苯二甲醛、抗壞血酸 均為分析純，天津市致遠化學試劑有限公司；草酸、碘化鉀、碘酸鉀、酒石酸鉀鈉、硫酸鉀、氫氧化鈉、碳酸鈉、無水乙醇、亞甲基藍、亞鐵氰化鉀、乙酸鋅、福林酚 均為分析純，南京化學試劑有限公司；甲酸、甲醇 色譜級，天津賽孚瑞科科技有限公司；果糖、蔗糖、葡萄糖、山梨醇、兒茶素、表兒茶素、根皮苷、綠原酸、槲皮素糖苷類、槲皮苷、槲皮素鼠李糖苷、蘆丁、槲皮素 均為標準品（含量≥99.9%），Sigma-Aldrich 公司。

DZKW-D-2 電熱恒溫水浴鍋 中國北京永光明醫療儀器廠；CPA1245 萬分之一電子天平 德國Sartorius 公司；UV-2450 紫外分光光度計、LC-20A高效液相色譜儀 日本Shimadzu 公司；TGL-20B高速臺式離心機 中國上海安亭科學儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品采集 于2021 年11 月份分別在山東煙臺、甘肅靜寧、河南靈寶、陜西洛川、云南昭通、新疆阿克蘇6 個產區，選擇成熟度相似的富士蘋果若干（所選果樹樹齡相當，栽培管理和樹勢基本一致）、色澤相近、大小均勻、無機械損傷、無病蟲害的果實用于實驗。每個產區隨機抽取蘋果15 個，每3 個蘋果混合取樣（沿果實赤道線附近選取果肉），設置5 個重復實驗。將選取果肉切碎并放置（-80 ℃冰箱）備用，為后期測定相關指標做準備。

1.2.2 指標測定 總糖含量參考GB/T 10782-2006[28]的方法；總酸含量參考GB/T 12456-2008[29]的方法；總酚含量參考福林酚法[30]測定；多酚含量參考賈一鳴[31]多酚測定方法；單糖含量參考劉玉蓮等[32]單糖測定方法。

維生素C（VC）的測定：采用實驗室改良滴定方法進行測定。取8 g 樣品于150 mL 錐形瓶中，依次加入50 mL 2%草酸、1 mL 6%碘化鉀溶液并滴加3 滴1%淀粉指示劑（現配現用），再用標定好的0.001 N（0.000167 mol/L）碘酸鉀溶液滴定至鐵青色（30 s 不褪色即滴定終點），進行3 次測定，并記錄用量，同時做空白實驗，通過碘酸鉀滴定溶液消耗量計算維生素C 含量。

1.3 數據處理

測定的總糖、總酸、總酚、VC、多酚、單糖等，每個產區取15 個樣品分5 組測定，每組數據測3 個平行。測定數據利用SPSS 25.0 進行不同產區間的方差分析、顯著性分析和判別分析，相關性分析使用R 語言（pheatmap），用SIMCA13.0 進行正交偏最小二乘判別分析。

2 結果與分析

2.1 紅富士蘋果6 大主產區營養指標比較

由表2 可知，各地區果實營養品質指標存在差異，變異系數范圍8.77%～43.23%。變異系數最大的營養品質指標為綠原酸43.23%，平均值為0.09 mg/g，含量變化范圍0.02～0.18 mg/g；其次是山梨醇42.67%，平均值為5.18 mg/g，含量變化范圍2.74～10.20 mg/g；再是蘆丁37.82%，平均值為0.80 mg/g，含量變化范圍0.49～1.77 mg/g，變異系數最小的營養品質指標是糖酸比6.86，平均值為56.84，含量變化范圍43.54～61.98。縱觀18 種果實營養品質指標，變異系數越大的綠原酸、山梨醇、蘆丁、根皮苷和槲皮素等指標可以作為各產區果實的差異營養品質指標，且可以區分各產區果實。

由表3 可知，不同產區間果實總糖含量有所不同，新疆阿克蘇地區紅富士蘋果總糖含量最高為13.66%±0.72%，與其他產區果實總糖有顯著差異（P<0.05）；紅富士蘋果總酸含量各產區間存在顯著差異（P<0.05），最高為新疆阿克蘇地區總酸含量為0.25%±0.01%。糖酸比與果實的總糖總酸含量密切相關，新疆阿克蘇、甘肅靜寧和云南昭通紅富士蘋果糖酸比適中。研究表明，蘋果風味品質主要取決于糖、酸含量及其配比關系，低糖高酸的果實口感過酸，高糖低酸的果實口感淡薄，都不符合鮮食要求[33]。本研究發現新疆阿克蘇果實糖酸比趨于中等水平，該地區蘋果口感更佳，與何引[34]對不同地區紅富士蘋果風味研究相一致；各產區紅富士蘋果VC含量除甘肅靜寧和陜西洛川間無顯著差異外（P>0.05），其余各產區果實相互間具有顯著差異（P<0.05），且新疆阿克蘇紅富士蘋果VC含量最高為5.28±0.2 mg/100 g，研究發現[35]果實中VC的含量與當地果園土壤所施氮肥和灌溉水量的大小均有關系。

果糖含量對于其他三類可溶性糖在各產區紅富士蘋果中含量最高，其中陜西洛川地區紅富士果糖含量最高為82.49±0.56 mg/g 與其他產區具有顯著差異（P<0.05）。各地區蘋果果實中果糖的含量最高，葡萄糖和蔗糖含量次之，山梨醇含量較低。研究發現蘋果、梨、草莓屬于單糖積累型果樹，其中果糖是蘋果果實可溶性糖的主要組分，其次是葡萄糖、蔗糖[36]。Róth 等[37]研究發現，果糖是金冠、澳洲青蘋、富士系等果實中主要的可溶性糖組分，其次是蔗糖和葡萄糖，山梨醇組分占比最低。本實驗的結果與劉玉蓮等[38]研究結果一致。新疆阿克蘇、陜西洛川、云南昭通、山東煙臺地區在山梨醇含量上有顯著差異（P<0.05）且阿克蘇產區果實最高為9.44±0.51 mg/g，與周文靜等[39]研究發現“糖心”果實的出現，果實中山梨醇含量較高相符。又因阿克蘇糖心蘋果屬于晚熟作物，新疆阿克蘇屬于高緯度地區，太陽輻射強白天日照時間長、光照充分，果實內部糖分能夠大量積累，是由于有充裕的日照時間，從而促使果實能進行大量的光合作用，同時此地區夜晚時間相對較短，且晝夜溫差大，減少作物的呼吸作用，有利于果實內部糖分積累[40-41]。Bowen 等[42]研究認為沙質土壤、酸性土壤和鹽堿地以及老果園、有機質含量低的果園，常常會缺鈣，導致果實鈣含量偏低對“糖心”的形成和山梨醇的堆積有影響。鄭朝霞等[43]對陜西省蘋果主產區果園土壤特性進行研究，發現洛川地區土壤性質為中性偏堿，本研究發現陜西洛川產區果實山梨醇含量僅次于新疆阿克蘇產區。在上述四種可溶性糖中山梨醇的變異系數最大，說明不同產區紅富士蘋果間山梨醇含量差異較大。

甘肅靜寧、河南靈寶、山東煙臺、新疆阿克蘇等產區果實兒茶素含量存在顯著差異（P<0.05），其中果實中兒茶素含量最低是新疆阿克蘇產區0.05±0.003 mg/g；表兒茶素、根皮苷與綠原酸在各產區果實之間含量差異并不顯著（P>0.05），槲皮素糖苷類、槲皮苷、槲皮素鼠李糖苷、槲皮素和蘆丁在果實中的含量各產區間互有差異，河南靈寶果實槲皮素糖苷類含量最高為0.21±0.025 mg/g，云南昭通中槲皮苷含量最高為0.23±0.006 mg/g，果實中槲皮素鼠李糖苷含量最高的地區是云南昭通為0.19±0.017 mg/g，陜西洛川果實中槲皮素含量最高為0.06±0.003 mg/g，蘆丁含量最高是河南靈寶產區果實為1.38±0.234 mg/g。結果說明不同產區富士蘋果果實中多酚物質種類及含量均有差異，變異系數為22.16%～43.23%，其中綠原酸含量變異程度最大，兒茶素含量變異程度最小。結合表2 分析，產區果實營養品質指標變異系數較大，差異較為顯著的指標均有代表該產區果實的特征，并能作為潛在區分各產區果實的有效因子。綜上所述，自然環境、氣候條件、土壤屬性及施肥和灌溉方式是造成各產區紅富士蘋果中營養品質差異主要原因。

2.2 紅富士蘋果6 大主產區各類指標相關性分析

對6 大產區紅富士蘋果各類指標進行相關性分析，圖1 結果表明各指標之間存在一定關性。總糖含量與蔗糖和山梨糖醇含量在P<0.01 差異水平下，呈極顯著相關，尤其與山梨醇含量的相關性最強（r=0.64）。在P<0.01 差異水平下，總糖含量還與總酸和VC含量呈極顯著正相關，與總酚、兒茶素、槲皮素糖苷類、槲皮素鼠李糖苷、根皮苷含量呈極顯著負相關。果實的風味品質與其糖、酸等物質含量和配比關系緊密相關，適度的甜酸度的果實更容易讓人接受[44]。蔗糖含量與葡萄糖、果糖、山梨醇含量表現出顯著正相關（P<0.05），且與葡萄糖和山梨醇含量相關性極強（r=0.90、r=0.95），這與酶活性和糖代謝相關基因的差異有關，如蔗糖磷酸合酶（SPS）、蔗糖合酶（SS）是蔗糖積累的關鍵酶，酸性轉化酶（AI）和NAD-SDH 主要調控己糖積累[45]。薔薇科植物光合產物主要以蔗糖形式在源-庫之間轉運。此外，庫細胞中韌皮部運輸效率、糖的跨膜運輸能力以及環境條件和栽培技術等外界因素也決定了果實糖分的積累[46]。VC含量與蔗糖、葡萄糖、山梨醇含量呈極顯著正相關（P<0.01），與兒茶素和蘆丁含量呈極顯著負相關（P<0.01）。說明在果實中果實中VC含量與它們的含量彼此之間相互影響，研究表明VC與果實生長期的長短有密切關系，在果實的生長期中糖代謝又是關鍵的果實代謝途徑。因而它們彼此之間存在緊密聯系[47]。總酚含量與兒茶素和槲皮素糖苷類呈極顯著相關（P<0.01），相關系數分別為0.67 和0.52，與蔗糖和山梨醇呈極顯著負相關（P<0.01），相關系數分別為-0.49 和-0.53，與根皮苷、綠原酸、槲皮素呈顯著相關（P<0.05）。兒茶素和表兒茶素含量都與根皮苷、槲皮素糖苷類和槲皮素鼠李糖苷含量呈極顯著正相關（P<0.01），其中表兒茶素含量還與槲皮素含量呈極顯著負相關（r=-0.50）。根皮苷含量與綠原酸、槲皮素糖苷類和槲皮素鼠李糖苷含量呈極顯著正相關。說明多酚類物質含量彼此會受影響和約束。

圖1 六大主產區紅富士蘋果品質指標相關性分析Fig.1 Correlation analysis of quality indexes of red Fuji apples in six major producing areas

2.3 紅富士蘋果6 大主產區各類指標正交偏最小二乘判別分析

正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）和PCA相似，也是基于降維的多維向量分析方法。但是OPLS-DA 為有監督的分析，可以預設分類，彌補了PCA 方法的不足，強化組間差異，同時可以量化特征化合物造成組分差異的程度。由圖2A 可知，各主產區紅富士蘋果營養品質指標含量存在顯著性差異，OPLS-DA 分析可以實現6 大產區紅富士蘋果的良好分離。OPLS-DA 模型為Q2值0.794，矩陣R2X值0.885，區分參數R2Y 值0.874，說明該模型對6 大產區紅富士蘋果具有良好的穩定性和較好的預測能力。變量投影重要性（variable important in projection，VIP）可以進一步量化OPLS-DA 的每個變量對樣品分類的貢獻。VIP 值越大，變量在不同樣品間的差異越顯著，通常可以將VIP>1 表示為關鍵變量。由圖2C 所示，VIP>1 品質指標為果糖、槲皮苷、槲皮素、蘆丁、槲皮素鼠李糖苷、VC、葡萄糖、總酚，以上8 個指標可以作為更好區分不同產區果實的品質指標。由表4 可知，在OPLS-DA 模型中，利用18 種營養品質指標對阿克蘇、靈寶、洛川、煙臺和昭通產區果實判別正確率達100%，靜寧產區果實判別率為60%，無法判別的產區果實，產區果實總體判別正確率為93.33%。

圖2 不同產區紅富士蘋果品質指標OPLS-DA 建模結果Fig.2 Modeling results of OPLS-DA for quality indicators of Red Fuji apples in different producing areas

2.4 基于線性判別分析的紅富士蘋果產地判別模型

應用線性判別分析函數對不同產區紅富士蘋果進行判別分析，通過共線性診斷分析，選取檢測的18 項指標作為自變量，不同紅富士蘋果產地作為分組變量，建立紅富士蘋果不同產地判別模型如下：

圖3 為判定函數1 和判定函數2 區分阿克蘇、靜寧、靈寶、洛川、煙臺和昭通產區紅富士蘋果的散點圖。通過威爾克Lambda 分析，假設顯著性水平（α=0.05），判別函數1 和判別函數2 對分類結果達到顯著水平，其判別結果可接受。判別函數1 的方差百分比為48.7%，相關性為0.998；判別函數2 的方差百分比為32.4%，相關性為0.997；選取判別函數1 作為主要判別函數對紅富士蘋果不同產地判別的主要依據。根據不同紅富士蘋果產區，劃分為阿克蘇、靜寧、靈寶、洛川、煙臺和昭通6 類。在F值（3.84～2.71）下選取VC、山梨醇、兒茶素、槲皮素糖苷類、槲皮苷、槲皮素鼠李糖苷、蘆丁和槲皮素8 個指標可以明顯判別出紅富士蘋果的產地，這說明威爾克Lambda 判別分析有效。

圖3 判別函數區分紅富士蘋果產區散點圖Fig.3 Scatter map of red Fuji apples producing area by discriminant function

式中，1～6 分別代表阿克蘇、靜寧、靈寶、洛川、煙臺和昭通地區；A 為測定VC值、B 為測定山梨醇值、C 為測定兒茶素值、D 為測定槲皮素糖苷類值、E 為測定槲皮苷值、F 為槲皮素鼠李糖苷值、G 為測定蘆丁值、H 為測定槲皮素值。

不同產地紅富士蘋果的判別分析結果如表5 所示。根據判別模型對阿克蘇、靜寧、靈寶、洛川、煙臺和昭通6 個產區的紅富士蘋果樣品進行分類，利用回代檢驗（原始）和留一交叉驗證對判別模型進行檢驗。阿克蘇、靜寧、靈寶、洛川、煙臺和昭通6 個產區的紅富士蘋果樣品回代檢驗的整體判別率均為100%，對于以上6 個產區留一交叉驗證的判別率也均為100%（表5）。

2.5 紅富士蘋果6 大主產區環境因子與各類指標相關性分析

對生長期紅富士蘋果各產區溫差，降雨量2 項環境因子（表1）和18 種營養品質指標（表3）進行相關性分析，結果（圖4）表明，在P<0.05 的條件下，果實生長期溫差與紅富士蘋果的蔗糖含量呈顯著正相關（r=0.82）；果實生長期降雨量與紅富士蘋果的總酸含量和總糖含量呈顯著負相關（r=-0.86，r=-0.81），多酚類物質與降雨量呈正相關，與果實生長期溫差呈負相關。干旱地區降雨量相對較少，其果實總糖含量，總酸含量越大與降雨量顯著負相關，這與孫智廣等[48]研究結果相似；蔗糖含量與溫差呈顯著正相關，說明溫差越大，降雨量越少果實的糖分代謝越強，這與殷淑燕等[49]研究結果一致。

圖4 紅富士蘋果主產區環境因子與指標相關性分析Fig.4 Correlation analysis of environmental factors and indicators in main Red Fuji apples producing areas

表1 不同蘋果（生長期）產區信息Table 1 Information on different apple (growing season)producing areas

表2 不同產區品質指標結果分析Table 2 Analysis of quality index results in different production areas

表3 各主產區紅富士蘋果品質指標對比Table 3 Comparison of quality indicators of red Fuji apples in the main producing areas

表4 不同產區紅富士蘋果OPLS-DA 判別分析結果Table 4 OPLS-DA discriminant analysis results of red Fuji apples in different producing areas

表5 不同產區紅富士蘋果的判別結果Table 5 Discrimination results of red Fuji apples from different producing areas

3 結論

本研究對新疆阿克蘇、甘肅靜寧、山東煙臺、陜西洛川、河南靈寶和云南昭通等6 大主產區紅富士蘋果18 個營養品質指標分析，明確了紅富士蘋果種營養品質指標存在地域差異。在糖類方面，阿克蘇紅富士蘋果山梨糖醇含量偏高，陜西洛川紅富士蘋果果糖含量偏高；在多酚物質方面，甘肅靜寧紅富士蘋果綠原酸含量偏高，河南靈寶紅富士蘋果兒茶素和根皮素等含量偏高，云南昭通紅富士蘋果槲皮苷和表兒茶素等含量偏高，山東煙臺紅富士蘋果蘆丁等含量偏高，陜西洛川紅富士蘋果根皮苷含量偏高；新疆阿克蘇紅富士蘋果總糖含量偏高，甘肅靜寧紅富士蘋果總酚含量偏高，煙臺紅富士蘋果糖酸比含量偏高。采用正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）和線性判別分析建立模型，OPLS-DA 模型可以將6 大主產區紅富士蘋果樣品93.33%準確識別，通過VIP 值確定了果糖、槲皮苷、槲皮素、蘆丁、槲皮素鼠李糖苷、VC、葡萄糖、總酚8 個有效區分指標。基于線性判別分析，選取VC、山梨醇、兒茶素、槲皮素糖苷類、槲皮素鼠李糖苷、槲皮苷、蘆丁和槲皮素8 個特征營養品質指標建立的判別模型，6 個產區紅富士蘋果回代檢驗（原始）和留一交叉驗證的整體判別率均為100%。本論文再次證明環境因素對果實糖積累有影響，得到總糖和總酸含量與降雨量顯著負相關（P<0.05），蔗糖含量與溫差呈顯著正相關。因此，利用多品質指標化學計量法對不同產區紅富士蘋果判別是有效可行。對于構建判別模型時，所選用的樣本數量越多，該模型也越有說服力，為確保判別模型的準確判別率，今后還需要繼續增加樣品數量，來不斷修正判別模型的各項系數。建立多指標判別模型對富士蘋果產區進行劃分，有利于實現我國果實品質調控和品牌維護，為不同產區富士蘋果溯源和質量控制提供了基礎依據。