冷等離子體聯合L-谷氨酸與鹽脅迫對紅小豆萌發富集γ-氨基丁酸的效果及工藝條件

許慶鵬，姜秀杰，張家瑜，魏春紅，周航慶，張東杰

（黑龍江八一農墾大學食品學院，黑龍江大慶 163319）

紅小豆是一種高蛋白、低脂肪、多營養的小雜糧，在國際上有“紅珍珠”的美稱。γ-氨基丁酸（γ-Aminobutyric acid，GABA）是一種非蛋白質氨基酸，在動植物中微量存在但具有不可替代的作用。作為植物中一種逆環境生長因子，GABA 在植物萌發生長階段大量富集。GABA 在動物體內是一種重要的抑制性神經遞質，除此之外，還有安神、保肝護腎、降糖降壓等多種生理功效。GABA 在2009 年被中國列為新資源食品，并規定其攝入量不得超過500 mg/d[1]。因此，利用植物富集法開發GABA 相關功能性食品更容易得到消費者青睞。

豆類的發芽是一種植物凝集素積累，改善營養均衡的最廉價處理方式。發芽可以使豆子中大分子物質如淀粉、蛋白質和脂肪分解為小分子，還使其中具有生物功能的活性成分如GABA、多酚等急劇升高。國內外學者研究發現以豆類為原料，提供其發芽所需的一般或特殊環境條件，使其抗逆環境基因表達，影響初級代謝、次級代謝物合成，培養成營養價值更高的豆芽[2]。周一峰等[3]研究正常發芽條件下花豆發芽過程中GABA 的變化，發現30 ℃浸泡14 h，35 ℃發芽22 h，GABA 的含量最高為0.40 mg/g。左娜等[4]研究發現通過谷氨酸鈉、抗壞血酸等誘導黃豆和綠豆發芽，GABA 富集量分別達到0.3025 mg/g 和0.2783 mg/g。Jiang 等[5]研究發現，真空聯合谷氨酸鈉脅迫發芽使紅小豆中的GABA 含量顯著提高，并對相關基因的表達研究發現谷氨酸脫羧酶（Glutamic acid decarboxylase，GAD）基因表達與GABA 的積累呈正相關。呂秋潔等[6]研究比較了L-谷氨酸（L-Glutamic acid，L-Glu）和谷氨酸鈉（Monosodium glutamate，MSG）誘導紫糙米發芽，發現LGlu 較MSG 更利于GABA 的積累。曾晴等[7]研究不同鹽種類對大豆發芽富集GABA 的影響，發現氯化鈉和氯化鈣脅迫發芽GABA 含量明顯高于氯化鉀、氯化鎂、氯化鐵等其他鹽類。因此，通過低氧、超聲[8]、凍融[9]、化學物質誘導等技術方法生產高GABA 豆芽或者其他食品是可行的且潛力巨大，尤其是在低溫大氣壓等離子體[10]、酸性電生功能水[11]等新興技術誘導糧食種子發芽生產高GABA 食品方面缺乏探索性研究。

冷等離子體（Cold Plasma，CP）被認為是物質的第四種狀態，僅次于固態、液態和氣態。物理上，它是部分或完全電離的氣體混合物，含有活性物質，如激發態粒子、活性氧（Reactive oxygen species，ROS）、活性氮（Reactive nitrogen species，RNS）和OH 自由基[12]。現代研究發現等離子體和種子發芽之間的相互作用包括種皮改性、反應物種、種子滅菌、熱量和紫外線輻射與分子現象（包括轉錄和表觀遺傳調控）相關的表達，可以促進生物活性物質積累，提高芽的生物活性[13-14]。因此使用CP 提高豆芽中生物活性成分是芽菜行業可持續發展的一項有前途的技術。與熱加工技術相比，冷等離子體技術具有節能環保、加工效率高、成本低、適用于大型系統等特點[15]。Chen 等[16]研究了冷等離子體處理對發芽糙米中GABA 含量變化的影響，糙米經冷等離子體處理（3000 kV，10 min）后發芽，其GABA 的含量達到最高為28 mg/100 g。CP 技術產品種類有很多，其中在大氣壓力下產生的非熱等離子體，稱之冷大氣壓力等離子體（Cold atmospheric pressure plasma，CAPP）[17]。考慮到未來工廠化生產的簡便性及可行性，CAPP 的優點在于不使用低壓設備和通入惰性氣體的方法下也可產生等離子體氣體，因此CAPP 更適用于高GABA 芽菜工廠化生產的實際情況。

目前，CP 已被證明在提高谷物GABA 積累方面具有潛在的作用，但對發芽豆類的研究較少。因此，本實驗旨在探究CAPP 處理對紅小豆發芽期GABA 的影響，為冷等離子體技術在提高谷物活性物質應用提供研究基礎。利用響應面試驗對CAPP處理的紅小豆發芽培養液進行優化，以期為高GABA芽菜生產提供一些理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅小豆 品種珍珠紅，大小均勻，直徑約0.5 cm，大慶農貿市場購置；γ-氨基丁酸（≥99.9%）Sigma公司；次氯酸鈉、苯酚、乙醇、硼酸 分析純，上海陸都化學試劑廠。

HH-2 數顯恒溫水浴鍋 金壇市科興儀器廠；CPX3800H-C 超聲波清洗機 EMERSON 公司；TU-1810PC 紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；LPWS 恒溫恒濕培養箱 上海陸譜科技有限公司；CPS-1 型大氣壓冷等離子體殺菌機 南京農業大學協同蘇州屹潤食品科技有限公司及南京屹潤等離子科技有限公司聯合開發。

1.2 實驗方法

1.2.1 紅小豆處理及萌發工藝流程 紅小豆種子→等離子體處理→培養液浸泡→培養箱發芽→測定芽豆GABA

1.2.2 冷等離子體處理 將隨機選取的紅小豆種子（每組約200 個）置于樣品盒中平鋪成一層，將樣品盒塑封。打開箱門，將樣品盒放在移動平臺上緩慢上升至極板距離為40 mm 處，設置冷等離子處理條件為：電壓90 kV，頻率120 Hz，反應時間20 min（放電時間60 s/次，放電次數20 次）。關閉箱門，開始反應。

1.2.3 培養液浸泡 將冷等離子體處理的紅小豆清水洗5 遍并除去懸浮癟粒，然后用0.1%的次氯酸鈉浸泡20 min，用蒸餾水沖洗3 遍，分別用CaCl2溶液、NaCl 溶液、L-Glu 溶液和蒸餾水浸泡15 h。

1.2.4 培養箱發芽 將浸泡后的紅小豆放入發芽盒，蓋上4 層紗布，放入溫度35 ℃濕度85%的培養箱中培養，平均每2 h 向培養箱中紅小豆噴淋1 次相應溶液。

1.2.5 單因素實驗設計

1.2.5.1 冷等離子體處理時間對GABA 含量的影響 控制等離子體電壓90 kV，頻率120 Hz，設置反應時間為：0 min（放電時間60 s/次，放電次數0 次）、10 min（放電時間60 s/次，放電次數10 次）、20 min（放電時間60 s/次，放電次數20 次）、30 min（放電時間60 s/次，放電次數30 次）。使用蒸餾水培養液浸泡和噴淋，放入培養箱中發芽，每12 h 取一次樣，測定紅小豆GABA 含量。

我帶著你，走在海邊，腦子里又想起了自己童年時的那片海，想起了海邊的那幾塊礁石。小時候，我們還常常爬到礁石上玩，可現在礁石不見了，有人說它們被淹沒到了海水里，有人說它們被加工成了度假村里的假山，也有人說它們被沖到另一個海灘去了……

1.2.5.2 冷等離子體處理電壓對GABA 含量的影響 控制等離子體頻率120 Hz，反應時間20 min，設置電壓為：30、60、90、120 kV。使用蒸餾水培養液浸泡和噴淋，放入培養箱中發芽，每12 h 取一次樣，測定紅小豆GABA 含量。

1.2.5.3 冷等離子體處理頻率對GABA 含量的影響 控制等離子體電壓90 kV，反應時間20 min，設置頻率為：60、90、120、150 Hz。使用蒸餾水培養液浸泡和噴淋，放入培養箱中發芽，每12 h 取一次樣，測定紅小豆GABA 含量。

1.2.5.4 NaCl 濃度對GABA 含量的影響 控制等離子體電壓90 kV，頻率120 Hz，反應時間20 min。培養液分別使用25、50、75 mmol/L 的NaCl 溶液浸泡和噴淋，放入培養箱中發芽，每12 h 取一次樣，測定紅小豆GABA 含量。

1.2.5.5 CaCl2濃度對GABA 含量的影響 控制等離子體電壓90 kV，頻率120 Hz，反應時間20 min。培養液分別使用2、4、6 mmol/L 的CaCl2溶液浸泡和噴淋，放入培養箱中發芽，每12 h 取一次樣，測定紅小豆GABA 含量。

1.2.5.6 L-Glu 濃度對GABA 含量的影響 控制等離子體電壓90 kV，頻率120 Hz，反應時間20 min。培養液分別使用1、2、3 mg/mL 的L-Glu 溶液浸泡和噴淋，放入培養箱中發芽，每12 h 取一次樣，測定紅小豆GABA 含量。

1.2.6 紅小豆芽培養液優化設計 通過對單因素實驗結果的分析，按照Box-Behnken 試驗設計方案，以GABA 含量為響應值，對發芽時間、CaCl2濃度、L-Glu 濃度、NaCl 濃度四個因素分別取三個水平進行響應面試驗，通過Design Expert 13 軟件對29 組試驗數據進行分析，并預測等離子體處理富集γ-氨基丁酸的最佳工藝條件。試驗因素及水平如表1 所示。

表1 Box-Behnken 試驗因素及水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiment

1.2.7 GABA 含量測定 參照姜秀杰等[18]的方法稍作修改，將樣品烘干粉碎，過100 目篩。用蒸餾水定容到50 mL（樣品為1.0 g），30 ℃超聲提取2 h，濾紙過濾。8000 r/min 離心10 min，取上清液備用。將GABA 標品配制成0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL 的標準溶液繪制成標準曲線。取不同濃度標準液或樣品上清液1 mL，加入1 mL 硼酸緩沖溶液（pH9.0），2 mL 5%重篜酚溶液（w/v），1 mL 10%次氯酸鈉溶液，充分混勻。沸水浴10 min，冰水浴降溫約15 min，溶液顏色由黃色慢慢變為藍綠色，待化合物顏色穩定后加入60%乙醇2 mL，再次混合均勻。645 nm 波長下測定吸光度。

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 未處理與不同CAPP 時間處理對紅小豆發芽過程中GABA 含量的影響

本實驗中從種子吸水達到飽和的狀態開始計時，即發芽0 h。在正常發芽情況下，發芽72 h 紅小豆的營養生長階段基本結束并開始生殖生長階段[19]，此時其內部結構發生較大改變不再適合人類食用，因此發芽時間在72 h 之后的芽豆不再測定GABA。

GABA 屬于抗逆環境的活性物質，起促進生長代謝作用，隨發芽時間不斷延長，在芽成熟后植物體內便也達到平衡狀態[20-21]。觀察未處理與處理組紅小豆發芽過程中GABA 富集量的變化見圖1，在發芽0～72 h 內，紅小豆在正常發芽條件（未等離子體處理）下，隨發芽時間的延長GABA 含量不斷增加；CAPP 處理的紅小豆隨發芽時間的增加GABA 含量不斷增加，但在發芽48 h 后不再明顯升高。造成這種現象的原因是等離子體可以縮短種子萌發期，Filatova 等[22]研究等離子體有促進種子早熟作用，結果表明石竹種子在等離子體作用下，種子胚內的生命物質被激活，種皮軟化，從而加快了種子萌發和出苗的速度。

圖1 未處理和不同CAPP 時間對紅小豆發芽過程中GABA 含量的影響Fig.1 Effects of untreated and different CAPP time treatments on GABA content during germination of adzuki bean

未處理與不同CAPP 時間處理的紅小豆在同一發芽時間GABA 富集量的變化見圖1。在發芽0～24 h 階段，正常發芽的紅小豆GABA 含量緩慢上升，而等離子體處理組GABA 含量增加明顯。造成該現象的原因可能是CAPP 處理的紅小豆吸水速度快，吸水程度高，快速激活了種子中的內源酶。種子吸收水分程度取決于三個因素：種子的組成、種皮的濕潤性和水分[23]。相同種子和水分情況下，等離子體處理可以改變種子表面的化學結構和粗糙度，導致種子的濕潤性發生巨大變化。已有研究證實空氣等離子體處理后種皮與水的表觀接觸角急劇減小，導致種子的濕潤性增加[24-25]。ALVES JUNIOR 等[26]更深入研究等離子體處理對豆科種子吸水兩大部位（珠孔和肺門）的變化，發現離子體處理增加肺門的水分吸收量，同時珠孔表現出更開放的形態。在發芽24～48 h 時，CAPP 處理20 min 和30 min 的紅小豆GABA富集效果都較好。在發芽48～72 h 時，只有CAPP處理20 min 組的GABA 富集效果較好，且含量較高。造成這種情況的原因可能是等離子體處理種子的時間越長，ROS 和RNS 對種子的刺激越大，傷害越深。因此，在紅小豆發芽前期等離子體刺激越大合成GABA 越多。當等離子體時間為20 min，在發芽48 h 就達到頂峰，為104.601±1.192 mg/100 g。發芽72 h 時最高為106.718±1.030 mg/100 g，但從成本方面考慮選擇等離子體處理時間為20 min，發芽時間48 h。

2.2 CAPP 電壓對紅小豆發芽過程中GABA 含量的影響

控制冷等離子體裝置的時間為20 min，頻率為120 Hz 不變，觀察紅小豆正常發芽與不同等離子體電壓在發芽過程中GABA 富集量的變化。由圖2可知，使用不同電壓等離子體處理的紅小豆，其GABA 含量隨發芽時間延長而不斷增加，最后趨于平衡。其中等離子體電壓為120 kV 處理紅小豆，其GABA 含量呈先上升后下降趨勢。除電壓為120 kV外，各組等離子處理的紅小豆都呈上升趨勢，且電壓越大，紅小豆GABA 含量越高。原因可能是種子在等離子體處理過程中，電壓越高空氣被電離的混合物越多，混合物中多種活性基團和粒子能夠與種皮及表面微生物的發生更強烈的反應[27]，從而促進種子吸水，阻礙微生物生長，使種子更易發芽，GABA 含量升高。若對紅小豆離子體處理電壓過高，則沒有上述的生長代謝趨勢，反而有部分的豆子表面出現明顯的電流打擊的傷痕，其傷口破壞了豆子的免疫屏障，容易被有害微生物入侵。當等離體電壓為120 kV，紅小豆發芽時間為24～72 h 階段內，其GABA 呈先下降后不變的趨勢，說明電壓過大時對種子的萌發以及GABA 富集有抑制作用，其抑制機理有待深入研究。何瑞等[28]研究也發現相同結果，當大氣壓等離子體處理電壓為3.4 kV 時最有利于穿心蓮種子萌發，繼續加大電壓，當大氣壓等離子體處理電壓為5.95 kV 時則對穿心蓮種子的萌發有強烈抑制作用。因此控制一個合適的等離子體電壓才能最有利于種子萌發，針對不同種子其最佳等離子體電壓也不同。因此，針對CAPP 處理紅小豆種子最佳電壓為90 kV。

圖2 CAPP 電壓對紅小豆發芽過程中GABA 含量的影響Fig.2 Effect of CAPP voltage on GABA content during germination of adzuki bean

2.3 CAPP 頻率對紅小豆發芽過程中GABA 含量的影響

控制冷等離子體裝置的時間為20 min，電壓為90 kV 不變，觀察不同等離子體頻率條件下紅小豆發芽過程中GABA 富集量的變化。由圖3 可知，不同頻率的等離子體處理紅小豆，隨萌發時間的延長，其GABA 含量呈先升高后平穩的趨勢。等離子體處理頻率越高其GABA 富集的含量也越高。120 Hz 和150 Hz 等離子體處理紅小豆，發芽48 h 之后GABA含量分別達到最高為104.601±1.192 mg/100 g 和101.467±2.225 mg/100 g，兩者無顯著性差異，繼續發芽其GABA 含量也無明顯變化。已有研究表明通過優化原料基質特性（如水分含量）和調整等離子體電源設置（電壓，頻率）以增加反應物質的產生，可以提高微生物滅活效率[29]。但因紅小豆表面呈拓撲結構，具有空隙和波紋化的粗糙表面可以在一定程度上保護植物細胞和表面微生物免受等離子體產生的ROS 和RNS 侵害[30]。改變冷大氣壓等離子體機器的頻率是加速種子吸水，發芽，增加植物幼苗生長的有效手段。頻率小于90 Hz 時等離子體的處理效率較低，對微生物抑制作用較低，對刺激紅小豆發芽作用也較弱，頻率在120～150 Hz 時等離子體處理對紅小豆的刺激較大，有利GABA 的富集。因此，為延長機器使用壽命，等離子體處理紅小豆的最佳頻率為120 Hz。

2.4 NaCl 對紅小豆發芽過程中GABA 含量的影響

將等離子體處理的紅小豆分為4 組，依次噴灑不同濃度的NaCl 溶液，觀察不同濃度NaCl 溶液處理的紅小豆發芽過程中GABA 的富集情況。由圖4可知，CAPP+NaCl 處理組的GABA 含量高于等離子體處理組。隨著NaCl 的濃度增加，GABA 的含量呈先升高后減小的趨勢，當發芽時間為48 h，NaCl 濃度為50 mmol/L 時，GABA 含量達到最高為122.456±1.888 mg/100 g。這是因為NaCl 對植物富集GABA的兩條途徑都有促進效果。AL-QURAAN 等[31]研究NaCl 對發芽小麥進行處理發現5 個品種小麥的GAD基因表達上調。因此，在GABA 支路途徑中NaCl 會上調紅小豆GAD的相關基因表達，提高GAD酶活性，富集GABA。在多胺降解途徑中，XING等[32]研究表明在NaCl 處理下，大豆胚根的二胺氧化酶（Diamine oxidase，DAO）活性增強，促進多胺（Polyamines，PAS）降解，富集GABA。Yang 等[33]研究發現NaCl 處理使豆芽氨基醛脫氫酶（Aminoaldehyde dehydrogenase，AMADH）、GAD 和DAO活性分別提高了39.7%、28.4%和21.2%。除此之外，還有研究表明NaCl 刺激植物產生氧化應激，不僅會提高超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性，還能增加苯丙氨酸氨裂解酶，肉桂酸4-羥化酶和4-香豆酸輔酶A 連接酶的活性和表達，這些反應與表達也會減小GABA 合成抑制劑的作用[34-35]。因此，25～75 mmol/L 的NaCl 培養液有利于CAPP 紅小豆富集GABA，50 mmol/L NaCl 培養液效果最佳。

2.5 CaCl2 對紅小豆發芽過程中GABA 含量的影響

將正常發芽的紅小豆分為4 組，依次噴灑不同濃度的CaCl2溶液，觀察不同濃度CaCl2溶液處理的紅小豆發芽過程中GABA 的富集情況。由圖5可知，CAPP+CaCl2處理的豆子隨發芽時間延長，GABA 呈先升高后降低的趨勢。2 和4 mmol/L CaCl2處理的紅小豆在發芽在48 h 后才有明顯差異，4 mmol/L CaCl2處理的紅小豆富集效果更好。4 mmol/L CaCl2處理的紅小豆在發芽48 h 時達到最高為114.62±1.593 mg/100 g。植物中的GABA 合成主要來自GABA 支路中由谷氨酸脫羧酶（GAD）催化的不可逆的α-谷氨酸脫羧反應[36]。GAD 是一種Ca2+/鈣調蛋白依賴型酶，具有一個鈣調蛋白結合區，其活性受Ca2+/Ca M 控制[37]。王珊珊等[38]研究表明提高培養液中Ca2+濃度，促進Ca M 區域與鈣離子結合可以提高GAD 的活性，從而加快谷氨酸合成GABA。朱云輝等[39]研究發現Ca2+濃度達到6.0 mmol/L 時，發芽苦蕎中GABA 含量達到最大，此后隨著Ca2+濃度增大，GABA 含量呈減小趨勢。因此，CaCl2在2～6 mmol/L范圍內處理紅小豆發芽有助于富集GABA，4 mmol/L的CaCl2培養液效果最佳。

圖5 CaCl2 對紅小豆發芽過程中GABA 含量的影響Fig.5 Effect of CaCl2 on GABA content during germination of adzuki bean

2.6 L-Glu 對紅小豆發芽過程中GABA 含量的影響

將正常發芽的紅小豆分為4 組，依次噴灑不同濃度的L-Glu 溶液，觀察不同濃度L-Glu 溶液處理的CAPP 紅小豆發芽過程中GABA 的富集情況。由圖6 可知，隨發芽時間的延長，GABA 的含量呈先增加后下降的趨勢，當使用L-Glu 濃度為1、2 mg/mL處理CAPP 紅小豆時，發芽48 h 達到最大為117.518±1.634、118.264±1.804 mg/100 g。L-Glu 是谷氨酸脫羧酶（GAD）的唯一底物[40]。在外源溶液中添加LGlu 可以提高植物的滲透調節能力，增加底物從而增加GABA 含量。長時間限制谷氨酰胺合成，或減少蛋白質合成，或增加蛋白質降解，可使GABA 富集，這是由于谷氨酸含量增多可使GABA支路中碳流量增加，并調節谷氨酸脫羧酶的活性[41]。陳慧等[42]用1.0 mg/mL 的MSG 溶液處理蠶豆發芽，結果發現GAD 活性變化趨勢與GABA 含量變化相似。因此，使用1～3 mg/mL 的L-Glu 培養液可以提高紅小豆GAD 的酶活，增加GABA 含量。2 和3 mg/mL 的L-Glu 培養液效果都較好，且差別不大。

圖6 L-Glu 對紅小豆發芽過程中GABA 含量的影響Fig.6 Effect of L-Glu on GABA content during germination of adzuki bean

2.7 響應面優化GABA 富集工藝

2.7.1 回歸模型的建立及方差分析 通過單因素實驗結果，發現冷等離子體處理90 kV，120 Hz，20 min 紅小豆種子有利于發芽和富集GABA，且NaCl、CaCl2和L-Glu 溶液三種誘導環境下，紅小豆發芽后GABA 的富集量都明顯提高。確定了4 個因素對L-Glu 聯合鹽脅迫發芽CAPP 紅小豆富集GABA 的影響的4 水平，對29 個試驗組進行3 次重復測量，響應面試驗設計及結果見表2。

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 Response surface design and results

在此基礎上，利用Design-Expert 13 軟件對響應面進行設計與分析，并建立回歸模型，得出二元回歸方程為：

回歸模型方差分析結果見表3。由表3 可知，一次項A、D 與交互項AD 和二次項A2、B2、C2、D2表現為高度顯著（P<0.01），一次項B 與交互項CD表現為顯著（P<0.05）。模型總體極顯著（P<0.0001），說明預測結果與真實結果有相關性，決定系數R2=0.8970，失擬項不顯著（P>0.05），說明殘差是由隨機誤差引起。因此可知該模型擬合度較高，且誤差在可接受范圍內，表明可用于預測L-Glu 聯合鹽脅迫發芽CAPP 紅小豆富集GABA 工藝參數。根據二元回歸方程中一次項系數絕對值的大小，判定各因素對響應值影響的主次順序為發芽時間（A）>NaCl 濃度（D）>CaCl2濃度（B）>L-Glu 濃度（C）。

表3 響應面回歸模型方差分析Table 3 Analysis of variance with response surface regression model

2.7.2 響應面交互作用分析 響應面是用于描述因素與響應值之間關系的三維空間曲面圖，可直觀反映出各因素之間的交互作用，及其對L-Glu 聯合鹽脅迫發芽富集CAPP 紅小豆GABA 含量的影響程度。圖7～圖8 呈現的是對紅小豆富集GABA 有顯著交互作用的響應面和等高線圖。響應面坡度越陡峭，則表明響應值越敏感。

圖7 發芽時間和NaCl 濃度交互作用的響應面圖Fig.7 Response surface plots of the interaction between germination time and NaCl concentration

圖8 CaCl2 和NaCl 濃度交互作用的響應面圖Fig.8 Response surface plots of the interaction between CaCl2 and NaCl concentrations

發芽時間、NaCl 濃度二次項對發芽紅小豆GABA 含量有顯著影響，且等高線圖呈橢圓狀。由圖7 可知，A、D 因素在較高水平條件下，響應值隨著每個因素水平的增大而增大，當響應值增大到極值后，又逐漸減小。由于GABA 是紅小豆在發芽時期合成的抗逆環境活性物質，尤其是在胚部分含量較多，隨著胚芽發育其不斷合成，當胚芽發育成熟其GABA 含量便不會明顯增加。還有一種觀點也認為NaCl 濃度增加會促進紅小豆合成GABA，尹永祺等[43]研究發現NaCl 脅迫下多胺降解途徑對大豆發芽富集GABA 貢獻率大于30%。但鹽離子濃度過高，超過植物承受的極限，就會導致GABA 的含量降低，最終表現為GABA 含量增加到極點后又逐漸減少。由圖8 可知，NaCl 濃度和CaCl2濃度都增加對發芽紅小豆GABA 含量明顯提高，呈相互促進作用。任珺等[44]研究發現CaCl2有助于苦豆子的萌發和生長，有減輕鹽脅迫的作用。當外源Na+將細胞質膜上的Ca2+取代，引起Na+濃度增加，Na+/Ca2+比值的平衡遭到破壞，此時外源Ca2+會通過細胞質膜和內膜的鈣通道進入細胞質中，促進Ca M 區域與鈣離子結合提高GAD 的活性，從而加快谷氨酸合成GABA[45]。外源Ca2+的施加也能促進細胞對K+和NO3-的吸收，補充細胞內Ca2+的不足，保護膜的穩定性，降低鹽脅迫下離子毒害作用[46]。

2.7.3 最優條件的確定及驗證 利用Design-Expert 13 軟件對回歸模型進行典型分析得到：發芽時間A=0.810551、CaCl2濃度B=0.179352、L-Glu 濃度C=0.21802、NaCl 濃度D=0.638318，將四個因素編碼值轉換成實際值為：發芽時間57.72 h、CaCl2濃度4.36 mmol/L、L-Glu 濃度3.22 mg/mL、NaCl 濃度65.95 mmol/L，上述為L-Glu 聯合鹽脅迫發芽富集CAPP 紅小豆GABA 的最優工藝參數，在此條件下發芽CAPP 紅小豆的GABA 含量是166.111 mg/100 g，為了驗證回歸分析的可靠性，將前期回歸模型優化工藝參數調整為：發芽時間58 h、CaCl2濃度4.4 mmol/L、L-Glu 濃 度3.2 mg/mL、NaCl 濃 度66 mmol/L。按照上述最優發芽條件參數進行三次驗證實驗，結果得出發芽CAPP 紅小豆GABA 含量的實際值是（160.23±2.91 mg/100 g），理論值與實際值的相對誤差僅為3.54%，說明上述模型擬合較好，具有實際應用價值。

3 結論

本實驗使用大氣壓冷等離子體裝置處理紅小豆種子聯合鹽脅迫的方法探究對其發芽富集GABA 的影響，發現大氣壓冷等離子體90 kV，120 Hz，20 min處理的紅小豆種子最有利于發芽富集GABA。NaCl、CaCl2和L-Glu 都具有誘導豆類發芽富集GABA 的作用，且NaCl>CaCl2>L-Glu。再利用響應面優化最佳條件為發芽時間58 h、CaCl2濃度4.4 mmol/L、LGlu 濃度3.2 mg/mL、NaCl 濃度66 mmol/L，此條件下發芽CAPP 紅小豆GABA 含量為160.23±2.91 mg/100 g，是原料紅小豆GABA（22.5±0.2 mg/100 g）的7.12 倍。說明CAPP 紅小豆在發芽過程中，輔以L-谷氨酸和鹽處理，可有效提高GABA 富集量，進一步證明了萌芽有利于提升紅小豆中營養活性成分，為合理利用雜糧豆類資源以及開發高GABA 功能食品提供新的思路和理論支持。但對于L-谷氨酸聯合鹽脅迫CAPP 紅小豆發芽富集GABA 過程中體內的離子濃度及酶活力的變化未進一步探究，為深入了解紅小豆發芽富集GABA 機制，后續可對GABA 合成相關酶的酶活及代謝途徑進行研究。