響應面法優化白英粗多糖提取工藝及其體外抗氧化活性的分析

黃明浩，黃泰奇,2，鄧麗娟,

（1.武漢東湖學院生命科學與化學學院，湖北武漢 430212；2.武漢科技大學醫學院，湖北武漢 430065）

白英（SolanumlyratumThunb.）為茄科草質藤本，又名山甜菜、白毛藤、排風草。白英以全草及根入藥，具有祛風利濕、清熱解毒、抗腫瘤等功效[1]，是臨床上常用抗癌中草藥[2-4]，可用于制作保健食品[5]。白英多糖是白英的主要活性成分，具有抑菌[6]、抗癌[7-8]、增強免疫力[9]等藥理活性。目前，白英多糖的提取工藝多采用傳統方法，王林江等[10]通過石油醚回流脫脂、乙醇回流除去單糖和低聚糖，采用沸水浸提法提取白英多糖。楊惠麟等[11]通過乙醇超聲波提取去除單糖等小分子物質，采用加熱回流法提取白英多糖。Wu 等[12]采用沸水抽提同時進行機械攪拌的方法提取白英多糖。上述方法皆采用沸水提取白英多糖，不僅提取時間長，而且高溫易造成多糖降解及失活[13]，從而使提取率降低。超聲波輔助提取是通過超聲波的機械效應及空化效應，使植物細胞壁破碎，有利于有效成分的溶出，目前已被廣泛運用于天然活性物質的提取。Chen 等[14]采用不同方法提取山楂多糖發現沸水抽提山楂多糖平均得率為5.88%±0.19%，超聲波提取山楂多糖平均得率為7.47%±0.05%。結果表明，就山楂多糖的提取而言，超聲波法與沸水抽提法相比，具有提取速度快，提取率高，提取溫度低等明顯優勢。目前暫無超聲波法輔助提取白英多糖的報道。另外，有研究發現白英的醇提物具有一定的抗氧化作用[15]，但白英的水提物的抗氧化活性未見報道。毛建山等[16]對白英多糖進行紅外光譜檢測，發現其具有可供氫官能團，這表明白英多糖具有潛在的抗氧化作用。因此，本研究采用超聲波法提取白英多糖，通過響應面設計對白英多糖的提取工藝進行優化，并測定其抗氧化活性，旨為白英多糖的開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白英干品 購于安徽省亳州市亳源通中藥材種植有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2,2-二氮-雙（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（ABTS）合肥巴斯夫生物科技有限公司；抗壞血酸（VC）天津登峰化學試劑廠；無水葡萄糖、苯酚、濃硫酸、乙醇等試劑均為分析純。

KQ-100DE 超聲波清洗機 昆山市超聲波儀器有限公司；ZT-2L 旋轉蒸發儀 鄭州紫拓儀器設備有限公司；7200 可見光分光光度計 尤尼柯（上海）儀器有限公司；SHZ-D 循環水真空泵 鄭州杜甫儀器廠；NanoDrop 2000 超微量分光光度計 賽默飛世爾科技公司；Nicolet iS5 傅里葉紅外光譜儀 賽默飛世爾科技公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 白英多糖的提取方法

1.2.1.1 白英粉末的前處理 將白英干品用小型粉碎機粉碎，過60 目篩后按1:10 比例加入95%乙醇超聲提取1 h，去除其中的還原糖和雜質，過濾后烘干保存備用。

1.2.1.2 白英多糖的提取 稱取白英全草粉末25.0 g，在預設超聲條件下進行提取過濾后得提取液，減壓濃縮至10 mL，將濃縮液通過活性炭脫色，收集脫色液。加入等體積6%三氯乙酸與脫色液混合，冷藏過夜后過濾，用10% NaOH 調pH 至中性，減壓濃縮，向濃縮液中加入3 倍體積的95%乙醇4 ℃靜置2 h，5000 r/min 離心5 min，取其沉淀，依次用丙酮、乙醚反復洗滌，60 ℃烘干至恒重得白英多糖[11]。

1.2.2 多糖得率的測定 參考張鵬等[17]報道的方法：配置0.1 mg/mL 標準葡萄糖溶液，精密吸取標準葡萄糖溶液0、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6 mL 分別置于試管中，加蒸餾水至2.0 mL，加入5%苯酚溶液1.0 mL，搖勻，迅速滴加濃硫酸5.0 mL，置沸水浴中加熱15 min，取出冷卻至室溫，于490 nm 處測定吸光值。以濃度（x）為橫坐標，吸光度（y）為縱坐標繪制標準曲線，得出線性回歸方程：y=11.848x+0.0244，R2=0.9993。取0.5 g 白英粉末，在預設超聲條件下進行提取，抽濾，濾液轉移至100 mL 容量瓶內定容，得供試品溶液。準確吸取供試品溶液0.2 mL，依照上述方法測定白英多糖濃度，并依據公式計算白英多糖得率：

式中：C 表示白英多糖濃度，g/mL；V 表示供試品溶液體積，mL；D 表示稀釋倍數；W 表示白英粉末質量，g。

1.2.3 單因素實驗 固定超聲功率120 W，超聲波頻率40 kHz，料液比1:30 g/mL，提取時間30 min，提取溫度20 ℃，分別探究料液比（1:20、1:40、1:60、1:80、1:100 g/mL），提取時間（20、30、40、50、60、80、100 min），提取溫度（40、50、60、70、80 ℃）對白英多糖得率的影響。

1.2.4 響應面試驗設計 根據單因素試驗結果，以料液比（A）、提取時間（B）和提取溫度（C）為變量，以白英多糖得率為響應值，設計三因素三水平試驗，因素與水平設計見表1。

表1 響應面試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels used in response surface design

1.2.5 白英多糖的紫外光譜分析 精確配制濃度為1 mg/mL 白英多糖水溶液，以純水作空白，進行全波長掃描（200～800 nm）。

1.2.6 白英多糖的紅外光譜分析 稱取2 mg 白英多糖，加入適量的光譜純KBr 粉末研磨混勻壓片，紅外光譜儀掃描范圍為400～4000 cm-1，初步分析白英多糖的官能團及結構。

1.2.7 白英多糖的抗氧化活性分析

1.2.7.1 白英多糖對DPPH 自由基清除能力的測定 配制不同濃度的白英多糖溶液，各取2 mL 與DPPH 溶液（2 mL，0.2 mmol/L）混合，在室溫下避光反應30 min。以無水乙醇為空白，Vc 為陽性對照，在517 nm 下測定吸光值[18]，重復3 次，按下式計算DPPH 自由基清除率：

式中：As為白英多糖溶液與DPPH 溶液混合后的吸光值；Ab為白英多糖溶液與無水乙醇混合后的吸光值；A0為純水與DPPH 溶液混合后的吸光值。

1.2.7.2 白英多糖對ABTS 自由基清除能力的測定 配制7.4 mmol/L ABTS 二銨鹽儲備液和2.6 mmol/L K2S2O8儲備液，將上述兩種儲備液各取1 mL 混合，避光環境下室溫放置12 h，用磷酸鹽緩沖液（pH7.4）將上述混合液稀釋至吸光度為0.70±0.02，此溶液即為ABTS+自由基工作液。配制不同濃度的白英多糖溶液，各取0.4 mL 與4 mL ABTS 自由基工作液在室溫下避光反應6 min，在734 nm 處測定吸光值，重復3 次。以Vc 為對照組，利用如下公式計算ABTS+自由基清除率[19-20]：

式中：A0為純水與ABTS 工作液混合后的吸光值；A1為白英多糖溶液與ABTS 工作液混合后的吸光值。

1.3 數據處理

采用Origin Pro 2022 軟件作圖，通過Design Expert 13 軟件對響應面數據進行模型構建和方差分析，使用SPSS Statistics 23 軟件進行數據差異性分析。

2 結果與分析

2.1 單因素實驗結果分析

2.1.1 料液比對白英多糖得率的影響 不同料液比對白英多糖得率的影響見圖1。隨著料液比的增大，白英多糖得率呈上升趨勢，在1:60 g/mL 時達到最大（6.50%±0.09%），之后白英多糖得率顯著下降，可能是因為過多的水會使體系的單位空化能量降低，從而不利于白英多糖的溶出，導致多糖得率降低[21-22]。因此，響應面優化試驗的料液比選擇1:40、1:60、1:80 g/mL。

圖1 料液比對白英多糖得率的影響Fig.1 Effect of liquid to material ratio on the yield of polysaccharides from Solanum lyratum

2.1.2 提取時間對白英多糖得率的影響 不同提取時間對白英多糖得率的影響見圖2。在40 min 時白英多糖得率達到最大（7.05%±0.10%），隨著提取時間的延長，白英多糖得率緩慢下降，可能是因為多糖在超聲時間過長后會被誘導降解，導致多糖得率下降[23]。因此，響應面試驗的提取時間選擇20、40、60 min。

圖2 提取時間對白英多糖得率的影響Fig.2 Effect of extraction time on the yield of polysaccharides from Solanum lyratum

2.1.3 提取溫度對白英多糖得率的影響 不同提取溫度對白英多糖得率的影響見圖3。隨著提取溫度升高，白英多糖的得率先上升后下降，提取溫度為70 ℃時，白英多糖得率最高（7.31%±0.16%），這說明提取溫度的升高會增加溶液體系內的分子熱運動，有利于白英多糖的溶出；但提取溫度過高，可能會使多糖糖苷鍵斷裂，造成多糖水解從而導致得率降低[24]。因此，響應面試驗的提取溫度選擇60、70、80 ℃。

圖3 提取溫度對白英多糖得率的影響Fig.3 Effect of extraction temperature on the yield of polysaccharides from Solanum lyratum

2.2 響應面試驗結果分析

2.2.1 響應面試驗設計與結果 響應面試驗設計及結果見表2。采用Design-Expert 軟件對實驗數據進行二次多項擬合回歸，所得模型：Y=7.13-0.1413A+0.24B-0.8688C-0.29AB-0.2425AC-0.31BC-0.2028A2-0.2602B2-1.18C2。從表3 可以看出，該回歸模型的P<0.0001，具有極顯著差異，說明該模型具有較好的穩定性[25]，失擬項P=0.8476>0.05，不顯著，說明未知因素對實驗結果干擾較小。模型決定系數（R2）=0.9801，調整決定系數（R2Adj）=0.9545，表明此模型擬合程度良好[26]。通過F值檢驗可以看出，溫度對白英多糖得率影響最大，其次為時間，最后是料液比。

表3 回歸模型的顯著性檢驗及方差分析Table 3 Significance test and variance analysis of regression models

2.2.2 各因素響應面分析 采用Design-Expert 程序對響應面試驗的結果作曲面圖，同時分析各因素之間的交互作用。響應面圖中曲面越彎曲表明研究因素對結果影響越大[27]，等高線的形狀呈橢圓形表明研究因素之間的交互作用影響顯著，呈圓形則說明交互作用影響不顯著[28]。由圖4 可知，溫度與料液比和溫度與時間的響應面曲面的彎曲程度較大且均向溫度彎曲，其等高線圖為橢圓形，說明這兩種交互作用對白英多糖得率的影響顯著，溫度對于白英多糖提取的影響最為顯著，與方差分析F值檢驗所得結果一致。

圖4 各因素交互作用對白英多糖得率影響的響應面圖Fig.4 Response surface graphs of the interaction of various factors on the yield of polysaccharides from Solanum lyratum

2.2.3 最優提取工藝驗證 Design-Expert 軟件給出的最優白英多糖提取條件為提取溫度65.18 ℃、提取時間57.95 min、料液比1:57.15 g/mL，預測的得率為7.448%。根據實際操作可行性，調整提取溫度65 ℃、提取時間58 min、料液比為1:57 g/mL，在此條件下白英多糖實測得率為7.54%±0.12%，與預測值差異較小。該結果與王林江等[10]、楊惠麟[11]、Wu等[12]用沸水抽提的結果（1.84%、0.96%、2.37%）相比有較大提升。與Wu 等[12]的提取時間（5 h）相比有較大的優化。說明與沸水抽提法相比較，超聲波輔助提取可有效提高白英多糖的得率，同時縮短提取時間。

2.3 白英粗多糖的紫外和傅里葉變換光譜分析

白英多糖紫外光譜圖見圖5。白英多糖樣品在237 nm 處有最大吸收峰，說明樣品中可能含有不飽和羰基、羧基等[29]。在260 和280 nm 處沒有明顯的吸收峰，說明白英多糖提取物中的核酸和蛋白質已去除。

圖5 白英多糖紫外光譜圖Fig.5 Ultraviolet spectrogram of Solanum lyratum polysaccharide

白英多糖的紅外光譜結果見圖6。3430.94 cm-1附近的寬而強的吸收峰是由O-H 鍵的伸縮振動引起，此為多糖的特征吸收峰[30]。2926.14 cm-1處的吸收峰是由糖環上C-H 鍵的對稱伸縮振動引起[31]，1623.91 和1434.29 cm-1處的吸收峰為羧基和羰基引起，表明白英多糖中存在糖醛酸結構[32]，1151.29 cm-1處的峰為糖苷鍵C-O-C 的伸縮振動引起[33]。400～900 cm-1處有強吸收峰，表明存在吡喃糖環結構[34]。綜上，紅外光譜表明樣品具有糖類化合物的特征峰，可以判斷為糖類化合物。這與毛建山等[16]研究結果相似。

圖6 白英多糖紅外光譜圖Fig.6 Infrared spectrogram of Solanum lyratum polysaccharides

2.4 白英粗多糖的體外抗氧化活性分析

圖7 為白英多糖體外抗氧化活性結果。白英多糖在濃度0.2～5.0 mg/mL 和0.1～6.0 mg/mL 時分別具有較強的DPPH 和ABTS+自由基清除活性，均呈現出明顯的劑量效應關系。白英多糖濃度越高，其抗氧化能力越強；在濃度為5.0 mg/mL 時其對DPPH自由基的清除率最大，達到98.35%±0.54%；在濃度為6.0 mg/mL 時其對ABTS+自由基的清除率最大，為96.57%±0.79%。白英多糖對DPPH 和ABTS+自由基的半抑制濃度（IC50）分別為1.104、1.408 mg/mL，表明白英多糖具有良好的體外抗氧化活性。

圖7 白英多糖體外抗氧化活性Fig.7 Antioxidant activities of Solanum lyratum polysaccharides in vitro

3 結論

本研究采用超聲波法輔助提取白英粗多糖，用苯酚-硫酸法測定白英粗多糖含量。在單因素實驗的基礎上，利用Box-Behnken 響應面法優化試驗設計，得到最佳的白英粗多糖提取工藝為：料液比1:57 g/mL、提取時間58 min、提取溫度65 ℃。最后所得白英粗多糖得率為7.54%±0.12%，與預測值差距較小，說明該提取工藝穩定可靠。通過紫外和傅里葉變換紅外光譜掃描發現，白英粗多糖具有典型的多糖光譜吸收峰，其中含有糖醛酸，說明白英多糖可能為酸性多糖。白英粗多糖對DPPH 自由基和ABTS+自由基的半抑制濃度（IC50）分別為1.104、1.408 mg/mL，說明白英粗多糖具有良好的抗氧化活性。本研究為白英粗多糖的提取提供了一種高效的提取方法，為白英多糖的進一步開發提供了理論依據。但白英多糖的主要片段、單糖組成、分子量分布、構象仍有待進一步深入研究。