兩歧雙歧桿菌FL-228.1 增強小鼠先天免疫功能研究

周 瑜，田曉英，崔慶宇，張 喆，公丕民，林 凱，易華西，劉同杰，張蘭威

（中國海洋大學食品科學與工程學院，山東青島 266000）

免疫系統包括先天免疫和適應性免疫，在預防、控制感染和維持機體穩態方面發揮重要作用[1]。先天免疫系統的缺陷可導致無法識別病原體和迅速激活免疫反應，從而容易發生嚴重或復發性感染[2]。作為人體先天免疫防御戰線的重要成員，巨噬細胞幾乎存在于所有組織中，其主要功能是吞噬細胞碎片和外來病原體，并且活化的巨噬細胞可以分泌細胞因子和趨化因子，從而招募和激活其他免疫細胞[3-4]。自然殺傷（Natural killer，NK）細胞是細胞毒性淋巴細胞的一員，但與T 細胞不同，NK 細胞可以直接識別和解決病毒感染，并在沒有預先刺激的情況下自發地裂解腫瘤細胞[5]。此外，潘氏細胞可以產生、儲存和分泌多種抗菌肽（Antimicrobial peptide，AMP），包括α-防御素（在小鼠中稱為Cryptdins）、Cathelicidins（在小鼠中稱為Cathelin-related antimicrobial peptide，CRAMP）和再生胰島衍生蛋白3γ（Regenerating islet-derived protein 3 gamma，RegIII-γ）等[6]?？傮w而言，這些免疫細胞和免疫分子作為先天免疫的重要組成部分，參與了宿主抵抗外部病原體入侵的第一道防線。

益生菌是活的微生物，當給予適當劑量時，會對宿主的健康有益[7]。它們可以提高免疫力，是良好的免疫激活劑[8]。研究表明，益生菌能通過提高NK 細胞活性、調節淋巴細胞亞群和細胞因子的表達等途徑改善老年人的免疫力[9]。然而，目前益生菌對普通人群免疫功能的作用還存在爭議，且效果上具有菌株和個體差異性。Shida 等[10]研究發現每日攝入干酪乳酪桿菌LcS 能降低健康中年上班族的上呼吸道感染率和持續時間。但在健康女性醫護人員中，補充保加利亞乳桿菌OLL1073R-1 發酵的酸奶沒有顯示出對流感的顯著預防作用或NK 細胞活性的增強[11]。同時，益生菌調節免疫功能作用機制尚不清晰，且目前多集中于體外研究。如Rocha-Ramírez 等[12]研究發現乳酸桿菌在體外以TLR2 依賴的方式刺激人源巨噬細胞中促炎細胞因子的表達并促進其對病原體的吞噬作用和殺菌活性。

因此，本文結合體外篩選和體內驗證，探究了潛在功能菌株在正常個體中的免疫調節作用，并對效果較好的兩歧雙歧桿菌FL-228.1 的作用機制進行初步探討。首先借助RAW264.7 細胞和人外周血單核細胞（PBMCs），從8 株菌中篩選出最具先天免疫調節潛力的菌株并進一步在正常小鼠體內從免疫細胞活性、細胞因子和免疫分子抗菌肽的表達等方面綜合評價其對先天免疫系統的影響并對可能的作用機制進行探討，以期為益生菌作為免疫增強食品的開發和利用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

RAW264.7 細胞、K562 細胞、YAC-1 細胞 中國科學院細胞庫；BALB/c 雌性6 周齡小鼠 北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號為SCXK（京）2021-0006；實驗所用菌株：兩歧雙歧桿菌（Bifidobacteriumbifidum）FL-228.1 和動物雙歧桿菌（Bifidobacterium animalissubsp.animalis）F1-7 來源于健康嬰兒糞便；副干酪乳酪桿菌（Lacticaseibacillus paracasei）K14、X11，鼠李糖乳酪桿菌（Lacticaseibacillus rhamnosus）MN45、FN518 和植物乳植桿菌（Lactiplantibacillus plantarum）FWDG 來源于傳統發酵乳制品；陰道乳桿菌（Lactobacillus vaginalis）MN11 來源于產道拭子 保藏于中國海洋大學功能性乳品與益生菌工程實驗室；干酪乳酪桿菌LC（Lacticaseibacillus casei）從市面上有增強免疫力功能的產品中分離；MRS 液體培養基 青島海博生物技術有限公司；RPMI 1640 培養基、DMEM 高糖培養基、SDS 溶液、刀豆蛋白A（ConA）、臺盼藍染色液、PBS 緩沖液 北京索萊寶科技有限公司；中性紅染色液、青霉素-鏈霉素混合溶液、TritonX-100上海碧云天生物技術有限公司；特級胎牛血清BI 生物科技公司；Ficoll-Hypaque 分離液 天津灝洋生物科技有限公司；Trizol 裂解液 南京諾唯贊生物科技有限公司；SYBR Green Realtime PCR Master Mix、逆轉錄試劑盒 東洋紡生物科技有限公司；TNF-α、IL-10、IL-12、IFN-γ和IgG 試劑盒 蘇州卡爾文生物科技有限公司。

LRH-250 生化培養箱 上海一恒儀器有限公司；MW80 二氧化碳培養箱 上海皓莊儀器有限公司；VARIOSKAN FLASH 全波長多功能酶標儀、NanoDrop2000 超微量分光光度計 賽默飛世爾科技公司；BIO-RAD CFX96 實時熒光定量PCR 儀美國BIO-RAD 公司；TP600PCR 擴增儀 寶日醫生物技術有限公司；TG20KR-D 高速冷凍離心機 長沙東旺實驗儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株培養 實驗所用菌株儲存在-80 ℃冰箱，室溫解凍后按1%（v/v）接種量分別接種于MRS液體培養基，37 ℃厭氧培養24 h。取活化第三代的菌株在4 ℃，8000 r/min 下離心10 min，收集菌體，用PBS 緩沖液洗滌三次，最后用PBS（動物實驗）或細胞培養基（細胞實驗）重懸至實驗所需濃度，其中以LC 作為參考菌株。

1.2.2 PBMCs 分離培養 從10 名18～30 歲的健康志愿者中抽取空腹血樣，得到了所有受試者的知情同意。使用Ficoll 密度梯度離心法分離PBMCs[13]，將得到的細胞進行臺盼藍染色，當PBMCs 活力大于95%時，用于后續實驗。

1.2.3 RAW264.7 細胞吞噬活性測定 如前所述，采用中性紅法檢測巨噬細胞吞噬活性，并稍做修改[14]。用DMEM 高糖培養基調整細胞濃度為1×106個/mL，以菌:細胞=10:1 的濃度培養細胞24 h 后，向每孔加入200 μL 1%中性紅染色液。繼續培養0.5 h 后用PBS 洗滌三次，每孔加入200 μL 裂解液（冰醋酸:無水乙醇體積比為1:1），4 ℃靜置過夜，用酶標儀測540 nm 下吸光度值。

1.2.4 NK 細胞活性測定 如前所述，采用乳酸脫氫酶釋放法檢測NK 細胞活性，并稍做修改[15]。用2×107CFU/mL 的菌懸液干預PBMCs 24 h。用RPMI 1640 培養基調整K562 細胞濃度為2×105個/mL，按效靶比為50:1，將PBMCs（效應細胞）和K562 細胞（靶細胞）各100 μL 加入U 型96 孔培養板，同時設自然釋放孔加靶細胞和含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養基各100 μL，最大釋放孔加靶細胞和2.5%TritonX-100 各100 μL。37 ℃，5% CO2下培養4 h，1500 r/min 離心5 min，每孔吸取100 μL 上清液，同時加入100 μL LDH 基質液，反應5 min，隨后每孔加入30 μL 1 mol/L 的HCL 溶液終止反應，在490 nm處測OD 值，NK 細胞活性計算公式如下：

1.2.5 動物模型與分組 30 只BALB/c 小鼠在清潔級、12 h 光照/黑暗交替、（22±2）℃溫度、（55%±5%）相對濕度的動物房適應性喂養7 d，隨后被隨機分成3 組（n=10），分別為空白對照組（Control 組）、FL-228.1 干預組和LC 干預組，所有組別小鼠均喂食普通飼料。實驗按照中國科學技術部動物管理條例，并經中國海洋大學食品科學與工程學院實驗動物倫理委員會批準（批準號：SPXY2021112402）。實驗設計為：空白對照組每天灌胃0.2 mL PBS，菌株干預組每天灌胃0.2 mL 菌懸浮液（5×108CFU/mL），實驗持續28 d。

1.2.6 小鼠血清及組織處理 小鼠禁食不禁水12 h，稱重，麻醉，眼球取血，室溫放置30 min 后3000 r/min離心15 min，小心吸取上層淡黃色血清分裝保存。取脾臟和胸腺，用生理鹽水清洗，濾紙吸干表面水分后稱重，分別計算脾臟和胸腺與小鼠體重的比值。

1.2.7 腹腔巨噬細胞吞噬活性測定 將5 mL RPMI 1640 培養基注入腹腔，輕輕按壓2 min，提取腹腔液體到離心管中，1500 r/min 離心5 min。棄去上清液，調整濃度至1×106個/mL，培養24 h 后棄去液體，其余同1.2.3。

1.2.8 NK 細胞活性測定 取出小鼠脾臟，制成濃度為2×106個/mL 的脾細胞懸液作為效應細胞。按效靶比為50：1，將脾細胞（效應細胞）和YAC-1 細胞（靶細胞）各100 μL 加入U 型96 孔培養板，其余同1.2.4。

1.2.9 ConA 誘導的脾淋巴細胞轉化實驗 實驗方法如前所述[16]，將脾細胞懸液（5×106個/mL）接種到有/無75 μL ConA 作為T 細胞刺激劑的24 孔板中，培養68 h 后，每孔吸走0.7 mL 培養基，加入50 μL 5 mg/mL MTT 和0.7 mL 不含胎牛血清的RPMI 1640培養基。培養4 h 后，每孔加入1 mL 3% SDS 溶液溶解紫色晶體，用酶標儀測定570 nm 處OD 值。用有/無Con A 的OD 值之差代表轉化能力。

1.2.10 小鼠血清細胞因子和IgG 測定 用酶聯免疫吸附法按照試劑盒說明書檢測血清中TNF-α、IL-10、IL-12、IFN-γ和IgG 的含量。

1.2.11 RT-PCR 檢測抗菌肽相關基因的mRNA 表達 利用RT-PCR 方法，加入Trizol 裂解液從回腸組織中提取總RNA。通過逆轉錄試劑盒合成cDNA單鏈后進行qPCR 操作。所用引物委托上海生工生物工程有限公司設計并合成，序列如表1 所示，2-ΔΔCt用于計算基因表達的倍數。

表1 逆轉錄聚合酶鏈反應的引物序列Table 1 Primer sequences of reverse transcription polymerase chain reaction

1.3 數據處理

所有實驗均至少重復3 次，結果均用平均值±標準差形式表示，數據使用SPSS 20.0 軟件進行單因素方差分析，組間差異檢驗采用Duncan 檢驗，P<0.05表示差異具有統計學意義。數據圖采用Prism 8.0軟件繪制。

2 結果與分析

2.1 不同菌株干預對先天免疫細胞活性的影響

2.1.1 不同菌株干預對RAW264.7 細胞吞噬活性的影響 RAW264.7 細胞來源于具有巨噬細胞特性的BALB/c 小鼠細胞，其被認為是體外研究巨噬細胞功能的合適模型[17]。因此，在本研究中，通過中性紅法檢測不同菌株干預對RAW 264.7 細胞吞噬作用的影響。結果如圖1A 所示，與空白組相比，用不同菌株處理的RAW264.7 細胞吞噬活性均顯著提高，增長超過51.11%，其中FL-228.1、FWDG、FN518、X11 和MN45 表現效果優于LC 對照組（P<0.05）。與此相一致的是，Rocha-Ramírez 等[12]的研究也顯示所有菌株干預均能增強巨噬細胞的吞噬作用，但瑞士乳桿菌IMAU70129 和干酪乳酪桿菌IMAU60214 效果最優，這表明不同菌株對巨噬細胞的吞噬作用具有差異性。

圖1 益生菌對RAW264.7 細胞吞噬活性和NK細胞活性的影響Fig.1 Effects of probiotics on phagocytic activity of RAW264.7 cells and NK cell activity

2.1.2 不同菌株干預對NK 細胞活性的影響 益生菌的免疫作用不僅限于腸道，已有研究發現益生菌干預能提高人外周血中NK 細胞活性[18]。本研究在PBMCs 中檢測不同菌株干預后人原代NK 細胞活性的變化，結果如圖1B 所示，與空白組相比，僅兩歧雙歧桿菌FL-228.1 和鼠李糖乳酪桿菌FN518 能顯著提高NK 細胞活性（P<0.05），增長超過51.2%，增強效果與LC 對照組相當，其具體作用機制尚需進一步研究，可能是通過促進細胞因子分泌進而刺激NK 細胞活化[19-20]。

2.2 兩歧雙歧桿菌FL-228.1 干預小鼠調節先天免疫的效果

2.2.1 兩歧雙歧桿菌FL-228.1 對小鼠體重和免疫器官指數的影響 基于細胞實驗的結果，進一步進行動物實驗評價FL-228.1 在體內調節先天免疫的效果。由表2 可知，實驗期間小鼠體重增長正常，各組間小鼠最終體重無顯著性差異（P>0.05），表明口服菌株FL-228.1 對動物生長安全性良好[21]。與空白組相比，各組小鼠的脾臟指數無明顯變化（P>0.05），FL-228.1干預可以顯著增加小鼠的胸腺指數（P<0.05）。而脾臟指數和胸腺指數是反映免疫器官發育的重要指標，其狀態直接影響機體免疫功能和抗病能力[22]，故口服FL-228.1 菌懸液可以促進胸腺發育。

表2 各組小鼠體重及臟器/體重比值的比較Table 2 Comparison of body weight and organ/body weight ratio of mice in each group

2.2.2 兩歧雙歧桿菌FL-228.1 對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬活性的影響 巨噬細胞的吞噬功能在某種程度上是免疫反應中不可或缺的步驟[23]。由圖2A 可知，與空白組和LC 對照組相比，補充FL-228.1 能顯著提高小鼠腹腔巨噬細胞吞噬活性（P<0.05），增長超過一倍。Lee 等[24]研究表明這種增強作用是通過激活巨噬細胞表面TLR2 進而導致細胞內絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）和核因子-κB（NF-κB）的活化所介導，據此推測FL-228.1 可能也是通過這種信號級聯反應發揮免疫促進作用。

圖2 益生菌對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬活性、NK 細胞活性和脾淋巴細胞轉化的影響Fig.2 Effects of probiotics on phagocytic activity of peritoneal macrophages,NK cell activity and splenic lymphocyte transformation

2.2.3 兩歧雙歧桿菌FL-228.1 對小鼠NK 細胞活性的影響 NK 細胞來源于骨髓，主要存在于血液和淋巴組織，特別是脾臟中[25]。實驗結果如圖2B 所示，攝入FL-228.1 能顯著提高小鼠脾臟處NK 細胞對癌細胞的殺傷活性（P<0.05）。具體而言，當NK 細胞識別癌細胞后，會調動細胞毒性顆粒向免疫突觸移動并將其釋放到細胞間隙，破壞靶細胞完整性，進而誘導細胞凋亡[26]。Cheon 等[27]研究發現脫顆粒抑制劑刀豆素A 預處理能有效阻斷嗜酸乳桿菌La205 誘導的NK 細胞活性，故菌株FL-228.1 對NK 細胞活性的增強最終可能是通過促進NK 細胞的顆粒胞吐作用實現的。

2.2.4 兩歧雙歧桿菌FL-228.1 對小鼠脾淋巴細胞轉化率的影響 T 淋巴細胞受到Con A 刺激后會轉化為母細胞持續增殖[28]。當T 細胞表現出低活性或免疫缺陷時，其轉化率下降，免疫功能降低[29]。由圖2C可知，補充FL-228.1 可以顯著提高小鼠脾淋巴細胞轉化率（P<0.05），增強細胞介導的免疫。Ren 等[29]的實驗結果也顯示小鼠連續攝入1×108CFU 的植物乳植桿菌Lp 能顯著促進脾淋巴細胞轉化，并且其所用劑量與本研究一致，表明補充特定菌株能對機體適應性免疫產生積極作用。

2.2.5 兩歧雙歧桿菌FL-228.1 對小鼠血清細胞因子和IgG 的影響 先天免疫細胞，如巨噬細胞、樹突狀細胞，可以通過釋放大量的細胞因子和趨化因子與其他細胞產生聯系，從而協調免疫反應[30]。在本研究中檢測血清細胞因子變化，結果如圖3A～圖3D 所示，各組間TNF-α、IL-10、IL-12 和IFN-γ水平無顯著差異（P>0.05）。由于IL-10 與IL-12 的比值是確定免疫反應方向的關鍵，而IL-10 和TNF-α的相對平衡對于控制免疫偏差至關重要[31]。因此推測這一實驗結果可能是攝入菌株后促炎細胞因子和抗炎細胞因子在外界刺激下保持平衡的結果，從而使機體在保持警惕的同時，不會產生過度的免疫反應。先前的一項研究也有相似的發現，分別給每只小鼠灌胃5×108CFU 和1×109CFU 的植物乳植桿菌CGMCC1.557不會引起血清IL-10、IFN-α和IFN-γ含量的顯著變化[32]。IgG 是再次免疫應答的主要抗體，也是唯一一種可以穿過胎盤保護胎兒的抗體，其存在于所有體液中[16]。由圖3E 可知，補充FL-228.1 后血清中IgG的含量顯著增加（P<0.05），進而提高小鼠體液免疫功能。

圖3 益生菌對小鼠細胞因子和IgG 的影響Fig.3 Effects of probiotics on cytokines and IgG in mice

2.2.6 兩歧雙歧桿菌FL-228.1 對小鼠抗菌肽相關基因mRNA 表達的影響 潘氏細胞是位于腸隱窩底部的小腸上皮細胞，其分泌的抗菌肽類似于分泌型免疫球蛋白A[33]。這些抗菌肽是真核生物中廣泛存在的重要先天免疫分子，其可以有效攻擊和殺滅潛在的有害微生物[34]。在本研究中，取小鼠末端回腸進行抗菌肽相關基因的檢測。結果如圖4 所示，與空白組相比較，補充FL-228.1 能夠顯著上調Cryptdin-4 和CRAMP 的基因表達（P<0.05），其增強效果與LC 對照組相當，但對RegIII-γ的mRNA 表達無顯著影響（P>0.05）。與此相反的是，Hrdy等[35]發現羅伊氏粘液乳桿菌而非動物雙歧桿菌可以顯著提高小鼠RegIII-γ的基因表達，但Cryptdin-4 的mRNA 水平無明顯變化。另有研究發現，芽孢桿菌LF4 通過TLR 和NLR 信號誘導腸上皮細胞中抗菌肽的基因上調[36]，這些研究表明菌株促進抗菌肽表達的效果具有差異性，而模式識別受體可能在此過程中發揮重要作用。

圖4 益生菌對小鼠回腸抗菌肽相關基因mRNA 表達的影響Fig.4 Effects of probiotics on mRNA expression of antimicrobial peptide-related genes in mouse ileum

3 結論

本研究通過體外細胞篩選和動物實驗得到一株在提高先天免疫細胞活性方面表現效果最好的兩歧雙歧桿菌FL-228.1，并從提高免疫細胞活性、調節細胞因子表達和促進免疫分子抗菌肽相關基因的上調等方面對其免疫調節能力進行了表征。本研究表明，兩歧雙歧桿菌FL-228.1 能調節先天免疫系統，同時對適應性免疫具有積極影響，并使機體處于免疫平衡狀態而不產生過度反應，這為益生菌作為免疫增強食品的開發提供理論基礎，未來具有廣泛的應用前景。同時，本研究中兩歧雙歧桿菌FL-228.1 增強機體先天免疫力的具體作用機制還有待深入的研究。