限制性內切酶Bsa I 的分離純化與結晶及其硒代衍生物的制備

朱 海，鄭夢澤，賈瑋瑋，周 倩，談 帥，劉子昂，張傳志，王偉玲，李婷婷,

（1.江蘇海洋大學，江蘇省海洋藥物活性分子篩選重點實驗室，江蘇連云港 222005；2.江蘇省海洋生物產業技術協同創新中心，江蘇連云港 222005；3.正大天晴藥業集團股份有限公司，江蘇連云港 222005）

限制性內切酶是分子生物學中最常用的工具酶之一[1]，其中，Ⅱ型限制性內切酶在識別序列的內部或附近確定位點對DNA 進行特異性切割，由于其穩定的裂解模式及簡便的催化方式而被廣泛應用于基因重組等分子生物學領域，具有重要的商業價值[2]。根據Ⅱ型限制性內切酶在識別序列上的不同，可以將其分為不同的亞類：例如，以EcoR I、Hind III 為代表的ⅡP 型內切酶，可以識別回文序列，并在識別序列內部進行對稱切割；以Bsa I、Fok I 為代表的ⅡS 型，可以識別不對稱序列，并在識別序列一端的固定位置進行切割[3-4]。

Bsa I 是一種來源于嗜熱芽孢桿菌的ⅡS 型限制酶，可以特異性識別不對稱DNA 序列5’-GGTCTC-3’，并在識別序列3’端第1 個堿基N1 后，以及識別的互補序列3’-CCAGAG-5’的5’端第5 個堿基N5后切割，從而留下4 個堿基的5’突出端[5-6]。常用于Golden Gate 組裝（Golden Gate Assembly）以及mRNA疫苗用質粒的線性化或其它體外轉錄質粒的線性化[7-10]。Bsa I 作為基因敲除的工具，在揭示植物基因功能和作物改良方面具有舉足輕重的作用[11-13]。天然來源的限制酶使用往往具有局限性，比如活性低，星號活性明顯，使用條件苛刻等[14-15]。這些局限性極大地影響了內切酶在商業化中的應用，所以研究者對于天然限制酶的研究和改造一直都沒有停止。為了克服天然酶存在的問題，針對Bsa I 進行結構研究具有重要意義。

X 射線晶體衍射是解析生物大分子三維結構的主要手段之一。其主要過程包括數據收集、相位解析、初始電子密度優化以及原子模型的構建[16-18]。對于生物大分子，一般情況下難以直接從衍射數據求得相位。結構解析中解決相位問題的一般方法有分子置換法，同晶置換法和反常散射法[19-20]。分子置換法需要同源性較高的同源結構來解析相位，而Ⅱ型限制酶同源性較低，無法利用分子置換法解析Bsa I 的相位問題。同晶置換法需要首先獲得大量蛋白晶體進行重金屬浸泡，因此本實驗嘗試在重組蛋白表達時制備硒代蛋白衍生物，利用反常散射法推算晶體相位[21-22]。

本研究以pBAD 質粒為載體，利用大腸桿菌ER2566（E.coli.）為宿主菌，制備ⅡS 型限制性內切酶Bsa I 及其硒代蛋白衍生物，利用坐滴法進行初步的晶體生長研究，為后續闡明Bsa I 的三維結構及作用機理提供實驗基礎，進而為其定向改造和功能優化提供信息。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

感受態菌株B834（DE3）、ER2566 武漢淼靈生物科技有限公司；λDNA 莫納（武漢）生物科技有限公司；酵母提取物、蛋白胨 Thermo Fisher Scientific 公司；Ni 親和層析填料、UniGel-80Q 陰離子層析填料 江蘇納微生物科技有限公司；其余化學試劑均為分析純 國藥集團化學試劑有限公司；基礎培養基配方 LB 培養基（g/L）：酵母提取物 5.0，胰蛋白胨10.0，氯化鈉 10.0；M9 培養基（g/L）：十二水合磷酸氫二鈉 17.09，磷酸二氫鉀 3.0，葡萄糖 4.0，硫酸鎂0.24，氯化鈉 0.5，氯化鈣 0.011，氯化銨 1.0。

凝膠成像系統 上海勤翔科學儀器有限公司；超高壓連續流細胞破碎儀 廣州聚能生物科技有限公司；AKTATm Pure 蛋白純化儀 GE 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 重組菌株的獲取 將編碼Ⅱ型限制酶Bsa I序列（Q6SPF4）及甲基化酶 Bsa I-M 基因序列（Q6SPF6）經人工合成構建在pBAD 載體上（安徽通用生物公司）。將重組質粒通過熱激法轉入到ER2566感受態細胞內（冰浴30 min，42 ℃熱激1 min，冰浴5 min，加入500 μL 無抗LB，37 ℃，200 r/min 培養1 h），將培養液在固體平板劃線，37 ℃培養箱培養過夜，獲得重組菌株[23]。

1.2.2 重組Bsa I 蛋白的表達與純化 將重組菌株ER2566-Bsa I 在含有氨芐霉素的LB 平板上劃線稀釋，37 ℃培養箱培養過夜。挑取數個單克隆在含有氨芐霉素的LB 液體培養基中活化，37 ℃ 200 r/min搖床培養至OD600值為0.6～1.0。進行小量誘導實驗（實驗組1），取活化液10 mL，加入20% L-ara，37 ℃誘導5 h 后，收集菌體，加水溶解，100 ℃煮沸15 min，取上清，SDS-PAGE 點膠驗證蛋白表達情況，通過實驗組1 確定蛋白表達后進行大量誘導實驗（實驗組2）。按1:50 比例在500 mL LB 培養基中擴大培養，其OD600值為0.6～0.8 時加入20% L-ara，在37 ℃下進行誘導5 h 后，收集發酵菌體。發酵菌體重懸至裂解液（25 mmol/L Tris-HCl，pH8.0，150 mmol/L NaCl），用細胞破碎儀1000 bar 破碎至菌液澄清透亮，4 ℃下13000 r/min 離心1 h，收集上清；然后將上清液與鎳填料結合過夜；利用15 mmol/L 低濃度咪唑洗雜蛋白，再利用250 mmol/L 高濃度咪唑洗脫目的蛋白；目的蛋白洗脫液用UniGel-80Q 陰離子層析柱進行下一步純化，低鹽溶液（25 mmol/L Tris-HCl，pH8.0）進行柱平衡，鹽濃度梯度洗脫目的蛋白。蛋白濃度的確定：通過測量樣品在280 nm 處的吸光度。

1.2.3 Se-Bsa I 蛋白的表達與純化 活化方法見1.2.2，首先進行小量誘導實驗（實驗組1），取活化液200 μL 加入10 mL 過度培養基中（LB 培養基：M9培養基體積比為1:4），37 ℃ 200 r/min 搖床培養至OD600值為0.6～1.0，2500×g 離心5 min 后，收集菌體，置換到M9 培養基中培養1 h，加入20% L-ara，37 ℃誘導5 h，分2 次加入硒代甲硫氨酸，誘導開始時及誘導2 h 后各添加一次硒代甲硫氨酸，每次加入量為0.25 mg，誘導完成后，收集菌體，加水溶解，100 ℃煮沸15 min，取上清，SDS-PAGE 點膠驗證蛋白表達情況。

通過實驗組1 確定蛋白表達后進行大量誘導實驗（實驗組2）。按照1:50 比例將活化液接種于500 mL 過渡培養基擴大培養（實驗組2），待其OD600值為0.6～0.8 時，將菌體置換到完全M9 培養基中培養1 h。加入20% L-ara，37 ℃誘導5 h，分2 次加入硒代甲硫氨酸，誘導開始時及誘導2 h 后各添加一次硒代甲硫氨酸，每次加入量為0.0125 g，使其終濃度為0.05 g/L。誘導完成后，收集菌體，硒代蛋白純化過程與重組蛋白一致，見方法1.2.2。

1.2.4 重組Bsa I 蛋白和Se-Bsa I 蛋白的質譜檢測 為驗證 Se-Bsa I 蛋白中硫原子被硒原子的取代情況，采用AB Sciex 5800 MALDI-TOF/TOF 質譜儀對 Bsa I 重組蛋白和其硒代蛋白進行分析鑒定，質譜檢測在華中科技大學完成。

1.2.5 重組Bsa I 蛋白和Se-Bsa I 蛋白圓二色譜檢測 為初步檢驗重組Bsa I 蛋白與Se-Bsa I 蛋白二級結構的區別，將重組蛋白和硒代蛋白稀釋至0.5 mg/mL，并使用圓二色譜儀對其進行掃描，樣品池光程為0.5 mm，近紫外區波長范圍為190～240 nm，分析其二級結構有無差異。

1.2.6 重組Bsa I 蛋白和Se-Bsa I 蛋白酶活檢測重組Bsa I 蛋白（1 mg/mL）或Se-Bsa I 蛋白（1 mg/mL）各1 μL，底物為1 μg 的λDNA，配制成20 μL 的反應體系，在37 ℃的條件下反應30 min，反應結束后高溫失活。使用1 %瓊脂糖凝膠電泳，鑒定Bsa I 蛋白或Se-Bsa I 蛋白對λDNA 切割條帶。

1.2.7 重組Bsa I 蛋白結晶條件初篩 將蛋白濃縮到10 mg/mL，通過氣相擴散坐滴法對9 種結晶試劑盒（Crystal Screen Cryo-HR2-112、PEGRx 1 -HR2-082、Index-HR2-144、Crystal Screen Lite-HR2-128、Crystal Screen Cryo -HR2-122、SaltRx 1 -HR2-107、Crystal Screen-HR2-110、Natrix-HR2-116、PEGRx 2-HR2-084）條件進行蛋白晶體生長條件的初步探索。使用NT8 機械手臂將蛋白溶液和生長池液按照1:1 的比例混合，點樣至晶體板的樣品槽內，并使用透明塑封紙封裝。放入全自動晶體生長觀察成像分析儀，設置溫度為20 ℃，間隔12 h 拍照，觀察晶體在不同條件下的生長情況。蛋白在2 種情況下生長出晶體，條件a：0.2 mol/L 醋酸鎂四水合物，0.1 mol/L二甲胂酸鈉三水合物 pH6.5，20%聚乙二醇8000；條件b：0.1 mol/L 三水醋酸鈉 pH4.6，2.0 mol/L 硫酸銨。

2 結果與分析

2.1 重組表達載體的構建

利用原核生物表達體系表達內切酶，首先要考慮的問題是避免重組內切酶對宿主DNA 的切割傷害。為解決這個難題，本研究在載體pBAD 上同時構建了Bsa I 基因和Bsa I 的甲基化酶基因。如圖1所示，在Bsa I 基因和Bsa I-M 基因的上下游分別構建了啟動子和終止子，使兩個蛋白分別表達。另外，在Bsa I 基因的上游加入6×His 標簽序列，使目的蛋白Bsa I 可以帶有融合標簽6×His。將構建成功的重組質粒通過熱激化法轉化到ER2566 感受態細胞中，獲得Bsa I 重組蛋白的表達菌株。

圖1 pBAD-Bsa I 質粒圖譜Fig.1 Schematic of pBAD-Bsa I construct

2.2 Bsa I 重組蛋白的表達和純化

首先將構建成功的Bsa I 重組表達菌株ER2566進行誘導實驗，以確定目的蛋白表達情況。限制性內切酶Bsa I 重組蛋白的分子質量約為65 kDa。將表達菌株在37 ℃下誘導5 h，小量實驗驗證（實驗組1）泳道2 比泳道1 多了一條誘導后條帶。與預期65 kDa 大小相仿，證明重組Bsa I 蛋白在ER2566 菌株中有誘導表達。然后進行大規模發酵實驗（實驗組2），將誘導后的發酵液進行超高壓破碎，如圖2a泳道3，在目的蛋白與鎳基至結合后，利用高濃度咪唑洗脫，如圖2a泳道4 所示，經過Ni 親和層析后重組Bsa I 蛋白的純度明顯提升。但重組Bsa I 蛋白的純度還未達到蛋白晶體生長所需的純度，因此對重組Bsa I 蛋白利用陰離子交換層析進一步純化，如圖2c 所示，蛋白純度可以達到90%以上。最終，每升發酵液得到了6.6 mg 的目的蛋白。

圖2 重組蛋白Bsa I 的表達與純化Fig.2 Expression and purification of Bsa I

2.3 Se-Bsa I 硒代蛋白的表達與純化

實驗室最常用的方法是使用甲氨酸缺陷型菌株制備硒代蛋白，利用M9 培養基發酵獲得硒代蛋白，其中大腸桿菌常用甲硫氨酸缺陷型菌株是B834[24]。因此，本研究將構建成功的重組質粒轉化導入B834（DE3）菌株中，并進行目的蛋白的小量表達試驗。經過SDS-PAGE 檢測發現沒有硒代蛋白的目的條帶。推測其結果可能是甲硫氨酸缺陷型菌株B834（DE3）不適合同時誘導表達Bsa I 基因和Bsa I-M 基因，B834 菌株中的甲基化修飾系統阻礙了表達Bsa I 的甲基化酶，而無法獲得目的蛋白Bsa I。程藝等[25]在表達重組Se-Nco I 時，利用甲硫氨酸缺陷型菌株B834時蛋白未表達，之后利用表達重組Nco I 的BL21（DE3）pLysS 菌株和M9 培養基成功表達出硒代蛋白。

因此，本實驗采用原ER2566 表達菌株，利用M9 培養基來替換甲硫氨酸為硒代甲硫氨酸，進行Se-Bsa I 蛋白的誘導表達，誘導后的重組Bsa I 蛋白在硒代培養基中有誘導條帶產生，表明此方法是可行的。但是誘導后的菌體量少，無法獲得足夠的硒代蛋白。推測是由于硒代甲硫氨酸的細胞毒性[26]以及M9 培養基不是大腸桿菌的最適培養基，會嚴重影響菌體的生長，從而降低Se-Bsa I 重組蛋白的表達量。因此，本實驗通過分批次加入硒代甲硫氨酸，減少硒代甲硫氨酸的濃度，從而降低硒代甲硫氨酸的細胞毒性。通過小量實驗（實驗組1）表明分批次加入可以提高誘導后菌體量，從而提高硒代蛋白的產量。大規模發酵（實驗組2）經過Ni 親和層析和陰離子交換層析的純化，如圖3a 泳道4 和圖3c 所示。最終，每升發酵產物得到4 mg 目的蛋白。

圖3 重組蛋白Se-Bsa I 的表達與純化Fig.3 Expression and purification of Se-Bsa I

邵鈺晨等[27]在制備硒代蛋白時也發現了此類問題，指出M9 培養基對于LB 培養基來說，營養成分相對貧瘠，因此邵鈺晨等在培養過程中添加異亮氨酸等多種氨基酸，抑制大腸桿菌本底代謝，從而提高外源硒代甲硫氨酸利用率，提高硒代蛋白表達量。通過這些改進最終獲得了濃度為10 mg/mL、純度在95%以上的Se-Mlu I 蛋白。后續實驗將針對硒代蛋白誘導條件進行優化，以達到滿足晶體生長的蛋白濃度。

SDS-PAGE 檢測結果顯示Se-Bsa I 硒代蛋白的大小和Bsa I 蛋白大小類似，但電泳圖中很難判斷Se-Bsa I 蛋白是否被硒代，因此后續進行質譜檢測Se-Bsa I 蛋白的分子量與Bsa I 蛋白的區別，從而判斷Se-Bsa I 蛋白中甲硫氨酸的硒代概率。

2.4 重組蛋白Bsa I 和Se-Bsa I 的質譜檢測

由于采用原ER2566 表達菌株，利用M9 培養基摻入硒代甲硫氨酸來替換目的蛋白中的甲硫氨酸，存在替換不完全的風險。為了檢測Se-Bsa I 蛋白中硒原子的取代率，將純化得到的Bsa I 和Se-Bsa I 取樣進行質譜檢測如圖4 所示。經過質譜檢測發現，重組Bsa I 蛋白的分子質量為65278.87 Da，這與Bsa I 理論相對分子質量65 kDa 相符。而重組Se-Bsa I 蛋白相對分子質量為65758.26 Da，與Bsa I 重組蛋白之間相差479.39 Da。已知硫元素相對分子質量為32.065 Da，硒元素的相對分子質量為78.96 Da，因此平均每分子Se-Bsa I 中被硒原子取代的硫原子數量為479.39/（78.96-32.065）=10.22。通過分析重組Bsa I 蛋白質的氨基酸序列發現其有11 個甲硫氨酸，存在11 個硫原子。因此，推測出本批次的Se-Bsa I 蛋白質中甲硫氨酸被硒代甲硫氨酸取代的概率約92.91%，樣品適合進行后續X-射線衍射實驗[28]。

圖4 Bsa I 和Se-Bsa I 質譜圖Fig.4 Serum mass spectrometry of Bsa I and Se-Bsa I

2.5 重組蛋白Bsa I 和Se-Bsa I 的圓二色譜圖檢測

為了解析限制性內切酶Bsa I 的三維結構，Se-Bsa I 重組蛋白樣品與Bsa I 重組蛋白樣品的結構必須高度相似。測定蛋白質二級結構最常用的方法是圓二色譜法，其廣泛應用于蛋白質的構象研究中[29]。為了進一步明確硒代蛋白對重組蛋白的結構有無影響，本研究將重組蛋白樣品Bsa I 和 Se-Bsa I 進行圓二色譜檢測，解析其二級結構（圖5）。CD 圖譜均顯示在192 nm 處有一個正峰，208、222 nm 處有兩個負峰，這表明Bsa I 和Se-Bsa I 都是以α-螺旋的形式存在，說明蛋白折疊正確，構象穩定。結果表明，Bsa I 和Se-Bsa I 在二級結構上無差異，硒代不影響其結構。為后續功能以及結構研究奠定了很好的基礎。

圖5 Bsa I 和Se-Bsa I 圓二色譜圖Fig.5 Circular dichromatogram of Bsa I and Se-Bsa I

2.6 蛋白及其硒代蛋白的酶活檢測

本研究分別對Bsa I 重組蛋白與Se-Bsa I 重組蛋白進行酶活力檢測，進一步檢測硒代是否影響野生型蛋白的生物學功能。取1 μg Bsa I 和1 μg Se-Bsa I 蛋白，對1 μgλDNA 進行30 min 快速酶切實驗，結果見圖6。經瓊脂糖凝膠電泳檢測發現，Bsa I 和Se-Bsa I 都有明顯的特征酶切條帶，與Thermo Fisher公司網址中公布的Bsa I 特征酶切條帶相似。酶切結果表明了Se-Bsa I 蛋白與野生型蛋白具有相似的生物學活性，即硒代蛋白活性并未受到硒代影響。

圖6 Bsa I 和Se-Bsa I 的酶活驗證Fig.6 Enzymes activity of Bsa I and Se-Bsa I

2.7 Bsa I 蛋白結晶生長條件篩選

本實驗將重組后的Bsa I 蛋白利用坐滴法進行蛋白質晶體的初篩。初篩使用購自Hampton Research公司的商品化蛋白質晶體篩選試劑盒，蛋白質液滴與點晶體等體積混合后，于20 ℃的全自動晶體生長觀察成像分析儀中進行晶體培養，每隔12 h 自動拍照采集數據[30-31]。在使用商品化蛋白結晶試劑盒進行蛋白結晶，最初得到的蛋白結晶條件往往不是最優條件，大概率會出現晶體過小，分辨率較差，衍射能力較低等情況[32-33]。篩選結果顯示有2 個條件生長晶體，晶體如圖7 所示。

圖7 Bsa I 的結晶條件篩選Fig.7 Screening of crystallization conditions of Bsa I

蛋白晶體可以在a 條件下（0.2 mol/L 醋酸鎂四水合物，0.1 mol/L 二甲胂酸鈉三水合物 pH6.5，20%聚乙二醇8000）生長出較小的顆粒狀結晶，并且可以在b 條件（0.1 mol/L 三水醋酸鈉pH4.6，2 mol/L硫酸銨）下生長出不規則的球形晶體，但初步結晶條件所篩選到的蛋白結晶較為脆弱且邊緣不規則，無法撈出進行衍射實驗。針對這種情況，程焯等[34]在制備LxmX 蛋白時，通過利用最初篩選得到的晶體生長條件，設計正交試驗，成功得到了邊緣整齊，可用于衍射數據收集的LxmX 蛋白及硒代LxmX 蛋白晶體。因此后續實驗將對初步得到的蛋白結晶條件進行優化，以獲得高分辨率的晶體。此外，通過觀察所有晶體的生長情況，發現大部分蛋白都發生了沉淀，推測Bsa I 的穩定性可能是影響其蛋白晶體生長的一個關鍵因素[35-37]。

3 結論

限制性內切酶是分子生物學最常用的工具之一，而內切酶的結構決定其功能。但大部分內切酶結構沒有被解析，這限制了內切酶的發展。通過制備硒代衍生物進行衍射解析結構，其操作更為簡單，適用性更高。但在制備硒代蛋白過程中，B834 甲硫氨酸缺陷型菌株往往易受到外源基因的影響，無法獲得重組蛋白，具有局限性，同時硒代甲硫氨酸的毒性問題以及發酵條件鮮有報道，這也限制了制備硒代蛋白的成功率。本實驗利用限制性內切酶Bsa I 和甲基化酶Bsa I-M 的大腸桿菌共表達系統，獲得大量表達的Bsa I 蛋白，通過M9 培養基添加硒代甲硫氨酸的方式，獲得了大小、性質和重組蛋白一致的硒代蛋白，并在兩種結晶條件下培養出蛋白晶體，為后續Bsa I 蛋白的晶體衍射，解析其三維結構奠定了基礎。