負載褪黑素和枸杞粉的凝膠糖果的研制及特性研究

孫 雯，閻佳楠，來 斌，王 策，吳海濤

（大連工業大學食品學院，國家海洋食品工程技術研究中心，遼寧大連 116034）

褪黑素（Melatonin）是一種內源性吲哚胺類分子，由松果體夜間產生，并根據晝夜節律專門釋放到血液中[1]，在內分泌和神經系統調節中發揮多種生理功能，包括促進睡眠[2-3]、抗衰老[4]、免疫調節[5]、抗腫瘤等作用[6]。在食品中褪黑素1～3 mg/d 對改善睡眠是安全有效的，已在2020 年納入最新修訂的《保健食品原料目錄》中進行備案制管理[7-8]，然而，由于褪黑素水溶性差，生物利用度低，其在功能食品的廣泛應用中受到限制[9]。利用玉米醇溶蛋白和果膠多糖通過反溶劑沉淀法負載褪黑素制備成納米顆粒，可極大程度提高褪黑素等功能因子在應用過程中的穩定性和生物利用度[10]。

凝膠糖果作為一種休閑食品，品種多樣，風味各異，具有組織細膩，口感爽滑，貨架期長等特點，一直深受國內外消費者的喜愛，然而有關褪黑素類凝膠糖果的應用開發研究還未見報道。明膠是一種常用的食品增稠劑，在糖果生產中，使用明膠較淀粉、瓊脂更富有彈性、韌性和透明性，但單一明膠在35 ℃左右易融，需同其他凝膠劑復配使用[11]。卡拉膠是一種硫酸多糖化合物，易吸水溶脹，具有凝膠性能好，成型溫度低等優點，可在一定程度改善明膠的熱穩定性。與蔗糖相比，糖醇具有低熱量、低血糖、低齲齒的特點，因此本實驗選擇價格更低，口感更好的山梨糖醇和麥芽糖醇作為甜味劑[12]。枸杞是茄科枸杞屬植物，其藥食同源的歷史悠久，是名貴的中藥材和高級滋補藥品。枸杞的功效成分包括玉米黃素、類胡蘿卜素、多種維生素、煙酸等[13]，并具有改善睡眠、抗氧化、抗腫瘤、清肝明目、神經保護和免疫調節作用[14-16]。

隨著人們健康認知水平的提升及功能食品對現代生活節奏要求的滿足，高品位、低糖度、自然元素調配和營養強化食品越來越受到大眾的青睞。本研究將負載褪黑素的玉米醇溶蛋白/果膠納米顆粒、枸杞粉進行復配，研制一種具有潛在有益睡眠健康的凝膠類食品。通過色差分析、質構分析、低場核磁分析及感官評價，考察了明膠、枸杞粉添加量及烘干時間對凝膠糖果特性的綜合影響，為褪黑素凝膠類產品的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

褪黑素 梯希愛（上海）化成工業發展有限公司；玉米醇溶蛋白 美國Sigma 公司；果膠 阿拉丁試劑（上海）有限公司；明膠、卡拉膠、山梨糖醇、麥芽糖醇、無水檸檬酸 食品級，睢縣甘淳商貿有限公司；枸杞粉 武漢錦盼食品有限公司。

2KBTES-55 真空冷凍干燥機 美國Virus 公司；JSM-7800F 熱場發射掃描電鏡 日本電子株式會社；HH-4 數顯恒溫水浴鍋 江蘇金壇榮華儀器制造有限公司；CP100NX 高速冷凍離心機 株式會社日立制作所；DHG-9070A 電熱鼓風干燥箱 上海一恒科學儀器有限公司；SC-80C 自動色差儀 北京康光有限公司；TA.XT.plus 質構儀 英國SMS 公司；MesoMR23-060V-1 低場核磁 蘇州（上海）紐邁電子；DHS-20A 快速水分測定儀 上海舍巖儀器有限公司；UV-1240 紫外可見分光光度計 株式會社日立制作所。

1.2 實驗方法

1.2.1 褪黑素納米顆粒的制備 參考Wang 等[17]的方法并加以改進，取750 mg 玉米醇溶蛋白溶于50 mL體積分數為85%的乙醇溶液中，常溫條件下以400 r/min 攪拌1 h，加入40 mg 褪黑素繼續攪拌1 h，離心（3000 r/min，10 min）除去不溶性雜質，得到褪黑素/玉米醇溶蛋白分散液，在4 ℃條件下儲存備用。取0.1 g 果膠溶于100 mL 去離子水中，在800 r/min的強力攪拌下攪拌過夜，離心（3000 r/min，10 min）取上清液，在4 ℃條件下保存備用。采用反溶劑沉淀法，將4 mL 褪黑素/玉米醇溶蛋白溶液勻速分散至16 mL 的蒸餾水中，分散的同時以800 r/min 的速度磁力攪拌4 min，制得褪黑素/玉米醇溶蛋白納米顆粒分散液，在40 ℃和0.01 MPa 的壓力下使用旋轉蒸發器30 min 以蒸發乙醇。隨后加入適量的蒸餾水以補償蒸發造成的體積損失。將褪黑素/玉米醇溶蛋白納米顆粒分散液倒入20 mL 上述果膠溶液中，以800 r/min 連續攪拌30 min，最終形成負載褪黑素的玉米醇溶蛋白/果膠納米顆粒分散液（以下簡稱褪黑素納米顆粒），經冷凍干燥機凍干72 h 后得到褪黑素納米顆粒凍干粉，在-80 ℃條件下儲存備用。

1.2.2 納米顆粒粒徑和PDI 的測定 在25 ℃條件下通過激光粒度儀測量了新鮮制備的褪黑素納米顆粒分散液的粒徑、多分散指數（PDI）。

1.2.3 微觀結構分析 將褪黑素納米顆粒凍干粉均勻的撒在導電膠上，并進行噴金。采用JSM-7800F熱場發射掃描電子顯微鏡觀察負載褪黑素的玉米醇溶蛋白/果膠納米顆粒的微觀結構及形貌。

1.2.4 納米顆粒褪黑素包埋率的測定 參考Wang等[17]的方法并加以改進，準確稱取褪黑素納米顆粒凍干粉0.1 g 于試管中，加入20 mL 無水乙醇，在室溫下超聲處理20 min 后，將提取液以5000 r/min 離心10 min，取上清液，用無水乙醇適當稀釋后在褪黑素最大吸收波長278 nm 處測其吸光度值，根據標準曲線y=0.0275x-0.0065（R2=0.9997）計算褪黑素含量，按下式計算褪黑素包埋率。

式中：m1為包埋樣品中的褪黑素質量，g；m0為加入的褪黑素質量，g。

1.2.5 凝膠糖果工藝流程 參考許粟等[18]的方法并加以改進。

操作要點：準確稱量1 g 褪黑素納米顆粒凍干粉溶于50 mL 去離子水中，攪拌至全部溶解。根據試驗配方準確稱取枸杞粉、明膠、卡拉膠、山梨糖醇、麥芽糖醇、無水檸檬酸于褪黑素納米顆粒溶液中，于70 ℃恒溫水浴鍋中加熱20 min，每間隔4 min 攪拌一次。將溶解好的混合液用滴管移取5 mL 至食品級硅膠模具中，4 ℃過夜冷卻成型，脫模，在25 ℃條件下干燥后得成品。

經預實驗，卡拉膠、山梨糖醇、麥芽糖醇、無水檸檬酸的添加量因所選濃度較低，對凝膠糖果的色差、質構、水分分布沒有顯著影響，因此本實驗將探究枸杞粉、明膠添加量及烘干時間對凝膠糖果綜合特性和感官評價的影響。固定明膠添加量為18%，卡拉膠添加量為5%，糖醇添加量為35%（山梨糖醇:麥芽糖醇=1:1），無水檸檬酸添加量為0.8%，烘干時間為18 h（25 ℃），探究不同枸杞粉添加量（0%、0.4%、0.8%、1.2%、1.6%）對凝膠糖果綜合特性和感官評價的影響；固定枸杞粉添加量為0.4%，卡拉膠添加量為5%，糖醇添加量為35%（山梨糖醇:麥芽糖醇=1:1），無水檸檬酸添加量為0.8%，烘干時間為18 h（25 ℃），探究不同明膠添加量（12%、14%、16%、18%、20%）對凝膠糖果綜合特性和感官評價的影響；固定枸杞粉添加量為0.4%，明膠添加量為18%，卡拉膠添加量為5%，糖醇添加量為35%（山梨糖醇:麥芽糖醇=1:1），無水檸檬酸添加量為0.8%，探究不同烘干時間（0、6、12、18、24 h）對凝膠糖果綜合特性和感官評價的影響。

1.2.6 色差的測定 使用標準白板將色度計標準化，利用反射模式比較每個樣品和標準白板之間的色差，總色差值（ΔE）計算如下：

其中，L、a、b為標準白板的顏色參數值，L*、a*、b*為不同凝膠糖果顏色參數值。

1.2.7 質構特性的測定 將室溫（25 ℃）平衡30 min后的凝膠糖果切成圓柱體（直徑1.5 cm，高1 cm），用TA.XT.plus 質構儀的探頭（P50）測定其質構特性。測前、測中、測后速率分別為5.0、1.0、1.0 mm/s，連續兩次下壓，壓縮形變比例為50%，觸發力5 g。

1.2.8 水分分布的測定 參考Yan 等[19]的方法并加以改進，用低場核磁共振分析儀探究凝膠糖果的水分分布特性。磁場強度為0.5 T，頻率為23.2 MHz。應用MultiExp Inv 分析軟件得到Carr-Purcell-Meiom-Gill（CPMG）衰變曲線的橫向自旋-自旋（T2）數據的指數分布擬合。

從自旋回波成像序列掃描凝膠樣品的T1和T2質子密度圖像。樣品在100×100 mm 的視野下觀察，分3 層進行分析，層厚、層間距和偏移量分別為2.0、1.0、15.2 mm，T1和T2的質子密度圖像的重復時間和回波時間分別為TR=500 ms，TE=2.0 ms 和TR=1600 ms，TE=5.0 ms。

1.2.9 水分含量的測定 取2.5 g 凝膠糖果置于快速水分測定儀托盤內進行絕對水分含量的測定。

1.2.10 褪黑素保留率的測定 參考Kumar 等[20]的方法并加以改進，將每個凝膠樣品（1 g）與5 mL 去離子水混合，并在研缽和研杵中研磨直至完全溶解。隨后，將懸浮液以8000 r/min 離心10 min，分離出澄清的上清液用無水乙醇適當稀釋，使用紫外可見分光光度計在278 nm 測得褪黑素的保留率。

1.2.11 感官評價 由10 位經過培訓的人員（男女比例為1:1）組成評定小組對凝膠糖果外形、軟硬度、彈性、黏牙性、咀嚼性、甜度進行評分，評定人員品嘗不同組凝膠糖果之前要用礦泉水漱口，以免影響結果。單項評分范圍為0～9 分，計算所有小組成員各項數據的平均值，評分標準如表1 所示。

表1 凝膠軟糖的感官評分細則Table 1 Sensory grading rules of gummies

1.3 數據處理

所有試驗平行測定三次，結果以平均值±標準差表示。實驗數據采用IBM SPSS 統計軟件進行方差和顯著性分析，顯著性水平P<0.05，使用Origin 2019軟件進行圖表繪制。

2 結果與分析

2.1 褪黑素納米顆粒的特性及微觀結構

采用反溶劑沉淀法制備了負載褪黑素的玉米醇溶蛋白/果膠復合納米顆粒，通過掃描電鏡對其微觀結構進行觀察，結果如圖1 所示。顆粒具有較好的球形結構，粒徑多數為150～200 nm，PDI<0.3，顆粒分布均勻，且褪黑素的包埋率為92.1%±0.93%。褪黑素納米顆粒的形成主要是由于三種物質間形成了氫鍵和疏水力驅動，陰離子果膠的添加使顆粒之間的靜電排斥力增強，提高了體系穩定性，有利于褪黑素在食品加工領域中的應用，Kumar 等[20]也利用納米載體包埋甜菜紅堿并用于凝膠糖果的制備，從而提高了甜菜紅堿在應用過程中的穩定性和保留率。

圖1 褪黑素納米顆粒微觀結構（A）及粒徑分布（B）Fig.1 Microstructure (A) and particle size distribution (B) of nanoparticles loaded with melatonin

2.2 枸杞粉添加量對褪黑素-枸杞粉凝膠糖果特性的影響

食品顏色是食品品質的重要評價指標之一，對于食品的商品價值有重要影響[21]。枸杞子藥食同源，味甘甜，色澤紅而不艷，是天然的食源性著色劑。CIELab 顏色系統是目前色澤研究中應用較多的色彩系統[22]，由L*、a*、b*參數值共同確定一種顏色，其中L*值代表顏色的亮暗程度；a*值表示從綠色到紅色的范圍；b*值表示從藍色到黃色的范圍。不同枸杞粉添加量的凝膠糖果照片如圖2A 所示，由于明膠的存在，未添加枸杞粉時凝膠糖果呈淺黃色，隨著枸杞粉添加量的增大，凝膠糖果呈橘黃色。從表2 可以看出，隨著枸杞粉添加量的增加，凝膠糖果的亮度顯著減小（L*值從71.1 降至58.8，P<0.05），紅度和黃度顯著增加（a*值從-114.2 增至-110.5，b*值從20.9 增至50.6，P<0.05），這與圖2A 的結果一致。由感官評價結果可知（圖2B），枸杞粉添加量在0.4%時褪黑素凝膠糖果感官評分最高，酸甜風味最佳，在添加量高于0.4%后酸澀感越來越大，且色澤過深，綜合考慮選擇0.4%的枸杞粉添加量進行后續研究。

圖2 枸杞粉添加量對凝膠糖果外觀形態（A）和感官評價（B）的影響Fig.2 Effects of Lycium barbarum L. powder addition on the appearance (A) and sensory evaluation (B) of gummies

表2 枸杞粉添加量對凝膠糖果色差的影響Table 2 Effects of Lycium barbarum L. powder addition on color difference of gummies

2.3 明膠添加量對褪黑素-枸杞粉凝膠糖果特性的影響

近年來，質構分析作為一種快速、可量化的分析技術在食品工業中得到了廣泛的應用，TPA 質構通過模擬人口腔對食品的咀嚼過程對食品質構進行感官評價，對樣品進行二次壓縮測試，獲得質構特性參數[23]。不同明膠添加量對褪黑素納米顆粒凝膠糖果質構特性的影響如圖3 所示。結果表明，隨著明膠添加量的增加，凝膠糖果的硬度（圖3A）、膠著度（圖3C）、咀嚼度（圖3E）均具有顯著提高（P<0.05），對其彈性（圖3B）、黏聚性（圖3D）和回復性（圖3F）的影響均不顯著（P>0.05）。卡拉膠對明膠質構特性的影響主要是因為卡拉膠與明膠分子間的交聯作用，卡拉膠的加入使其帶負電荷的硫酸鹽基團與明膠中帶正電荷的基團通過局部靜電相互作用形成一定的網絡結構[24]。隨明膠添加量的增加，二者間的交互作用加強，分子間的聯結程度增加，使凝膠網絡結構更加致密，表現為硬度和膠著度的顯著增強，而彈性凝膠體系自行恢復的能力有關[25]，變化不顯著。

圖3 明膠添加量對凝膠糖果質構特性的影響Fig.3 Effects of gelatin addition on texture properties of gummies

目前，低場核磁共振技術在研究食品干燥、貯藏、復水等過程中水分的狀態與分布得到了廣泛應用。即通過測定馳豫時間的變化解釋樣品中水分的分布狀態和變化規律，具有快速、無損、有效等優點[26]。不同明膠添加量的凝膠糖果橫向弛豫時間T2反演圖如圖4A 所示。凝膠糖果T2反演圖有3 個峰，分別標記為T21、T22、T23。其中，如表3 所示，T21（0.40～0.46 ms）為強結合水，T22（5.72～10.19 ms）為弱結合水，T23（74.60～114.44 ms）為不易流動水，沒有檢測到自由水（T24）[27]。隨著明膠添加量的增加，結合水（T21和T22）無明顯遷移變化，但T23有明顯差異（P<0.05），這部分水為不易流動水，對食品的品質和貨架期有重要影響[28]。這說明混合體系中的結合水與明膠或卡拉膠基團結合緊密，受到的束縛力較大，弛豫速率大，弛豫時間較短[29]，在兩種膠體的相互作用下，隨著明膠添加量的增加，整個混合體系的分子間作用力增強，氫質子自由度降低，水分含量（圖4B）從28.44%降至19.16%。同時，明膠添加量的變化對褪黑素的保留率（圖4B）無顯著影響（P>0.05），為92.0%～95.7%。經感官評價（圖4C），當明膠添加量為18%時，制備的凝膠糖果軟硬適中，彈性適宜，并具有良好的咀嚼口感，在添加量高于18%后，凝膠糖果的彈性、黏牙性和咀嚼性評分均降低，綜合考慮選擇18%的明膠添加量進行后續研究。

圖4 明膠添加量對凝膠糖果弛豫時間、水分含量、褪黑素保留率、感官評價的影響Fig.4 Effects of gelatin addition on relaxation time,moisture content,retention efficiency of melatonin and sensory evaluation of gummies

表3 明膠添加量及烘干時間對凝膠糖果弛豫時間的影響Table 3 Effects of gelatin addition and drying time on relaxation time of gummies

2.4 烘干時間對褪黑素-枸杞粉凝膠糖果特性的影響

核磁共振成像通過顯示樣品內部質子密度的加權圖像來反映氫質子的分布。通常情況下，水組分的變化是影響質子密度加權圖像亮度的主要因素，樣品中氫質子越多，質子密度圖越亮，偽彩圖越紅[30]。不同烘干時間凝膠糖果的質子密度圖像如圖5B 所示，對比T1和T2加權圖像，發現T1信號密度更亮、更藍，說明所有樣品均為結合水占主導地位。然而，不同烘干時間凝膠糖果的質子密度圖像沒有顯著差異，相應的定量分析也顯示信號強度沒有顯著差異（圖5C，P>0.05）。

圖5 烘干時間對凝膠糖果外觀形態（A）和質子密度（B、C）的影響Fig.5 Effects of drying time on the appearance (A) and proton density (B,C) of gummies

圖6 顯示了不同烘干時間對褪黑素納米顆粒凝膠糖果質構特性的影響。結果表明，隨著烘干時間的增加，凝膠糖果的硬度（圖6A）、膠著度（圖6C）、咀嚼度（圖6E）均顯著增強（P<0.05），對彈性（圖6B）、黏聚性（圖6D）的影響均不顯著（P>0.05），而回復性（圖6F）顯著減弱（P<0.05）。低溫烘干不會導致明膠和卡拉膠的降解，從而保留其凝膠特性，烘干時間越長，水分含量越低，分子間作用力增強，主要表現為硬度增強，回復性減弱，顏色變深，體積變小（圖5A）。

圖6 烘干時間對凝膠糖果質構特性的影響Fig.6 Effects of drying time on texture properties of gummies

不同烘干時間的凝膠糖果橫向弛豫時間T2反演圖如圖7A 所示。凝膠糖果T2反演圖有3 個峰，分別標記為T21、T22、T23。其中，如表3 所示，T21（0.37～0.88 ms）為強結合水，T22（6.55～16.88 ms）為弱結合水，T23（69.96～184.75 ms）為不易流動水，沒有檢測到自由水（T24）。隨著烘干時間的增加，T21和無明顯遷移變化，T22和T23向結合水方向顯著遷移（P<0.05），這說明結合水在混合體系中占主導地位，烘干時間越長，水分含量越低（圖7B，從48.26%降至15.71%），有益于產品貨架期的延長。同時，烘干時間的變化對褪黑素的保留率（圖7B）無顯著影響（P>0.05），為95.8%～97.7%。由感官評價結果表明（圖7C），當烘干時間為12 h 和18 h 時，制備的凝膠糖果硬度適宜，均具有良好的咀嚼口感，但當烘干時間為18 h 時，其水分含量顯著低于12 h（P<0.05），有利于凝膠糖果的長期貯藏，因此選定18 h 為最佳烘干時間。

圖7 烘干時間對凝膠糖果弛豫時間、水分含量、褪黑素保留率、感官評價的影響Fig.7 Effects of drying time on relaxation time,moisture content,retention efficiency of melatonin and sensory evaluation of gummies

3 結論

通過本研究，可得出褪黑素凝膠糖果的最佳工藝配方：枸杞粉添加量0.4%，明膠添加量18%，卡拉膠添加量5%，山梨糖醇添加量17.5%，麥芽糖醇添加量17.5%，烘干時間為18 h，研制的褪黑素凝膠糖果色澤均勻有光澤，口感適宜，且褪黑素保留率高于92%。凝膠添加量會顯著影響凝膠糖果的硬度、膠著度和黏聚性。適宜的烘干時間不僅顯著影響凝膠糖果的回復性，還能有效降低其水分含量。本研究為褪黑素納米顆粒凝膠類食品的研制提供新思路，拓展了褪黑素等功能因子在食品領域的開發利用途徑。