藍萼甲素對缺氧/復氧誘導的H9c2細胞損傷模型HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路的影響

杜 玥,李 莎,梅齊建,肖 鳴

心肌缺血/再灌注(myocardial ischemic/reperfusion,MI/R)損傷的誘因主要是心肌梗死、心肌缺血等,其發生機制十分復雜,是臨床治療的難題[1]。細胞凋亡、炎癥反應和氧化應激是MI/R損傷的重要原因。研究表明,高遷移率族蛋白B1(high mobility group box 1,HMGB1)/Toll樣受體4(Toll like receptor 4,TLR4)/核因子κB(nuclear factor κB,NF-κB)信號通路與MI/R損傷的發生聯系密切[2]。HMGB1在幾乎所有細胞類型中都有表達,抑制HMGB1表達可使其受體TLR4表達下降,導致下游NF-κB轉錄活性降低,從而起到減輕細胞損傷和炎癥反應的效果[3]。藍萼甲素(glaucocalyxin A,GLA)提取自藍萼香茶菜,是一種具有廣泛生物活性的二萜類化合物。GLA已被證實在氧化應激、免疫、抗炎等方面起作用[4]。同時,在乳腺癌中,GLA不僅能通過激活p53蛋白表達抑制細胞增殖和細胞周期進程[5],還能通過抑制磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信號通路促進細胞凋亡[6];另外,GLA可通過下調糖原合成酶激酶-3β(GSK3β)/β-catenin信號通路相關蛋白表達從而明顯抑制肺成纖維細胞轉化[7]。研究發現,GLA通過抑制HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路不僅能減輕卵清蛋白誘導的哮喘小鼠呼吸道炎癥[8],也能調節人滋養細胞的炎癥反應[9],還能減輕肥大細胞脫顆粒導致的過敏反應[10]。然而,GLA是否通過調節HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路影響心肌細胞損傷還未可知。因此,本研究將通過構建H9c2細胞缺氧/復氧(H/R)損傷模型,觀察GLA對H/R誘導的H9c2細胞損傷的影響,并探討GLA是否通過HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路干預H/R誘導的H9c2細胞損傷。

1 材料與方法

1.1 細胞與主要試劑、儀器

H9c2細胞購自中國科學院上海細胞庫;GLA購自上海源葉生物科技有限公司;HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路抑制劑甘草酸(glycyrrhizin)購自上海藍木化工有限公司;胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、DMEM培養基購自南京森貝伽生物科技有限公司;細胞計數試劑盒(CCK-8)、細胞凋亡檢測試劑盒購自美國Amresco公司;兔抗HMGB1、TLR4、NF-κB p65抗體(anti-HMGB1、anti-TLR4、anti-NF-κB p65、anti-p-NF-κB p65)及辣根過氧化物酶標記的二抗購自美國Thermo Fisher公司;乳酸脫氫酶(LDH)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)及酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測試劑盒均購自上海酶聯生物科技有限公司。酶標儀、流式細胞儀購自美國Bio-Rad公司;三氣培養箱、恒溫CO2培養箱購自德國Eppendorf公司;倒置熒光顯微鏡購自基恩士(中國)有限公司。

1.2 細胞培養與模型構建

對冷凍保存的H9c2細胞進行復蘇,將其置于含10% FBS的DMEM培養基中,在恒溫(37 ℃)CO2培養箱中培養。將對數生長期的H9c2細胞先在三氣培養箱缺氧環境中(1%O2、94%N2、5%CO2)培養24 h,然后移至恒溫CO2培養箱繼續復氧2 h,模型構建完成。

1.3 細胞分組

將對數生長期的H9c2細胞分成對照組(正常培養)、模型組(構建H/R細胞模型)、GLA-L組(細胞中加入5 μmol/L的GLA后構建H/R細胞模型)、GLA-M組(細胞中加入10 μmol/L的GLA后構建H/R細胞模型)、GLA-H組(細胞中加入20 μmol/L的GLA構建H/R細胞模型)、GLA-H+甘草素組(細胞中加入20 μmol/L的GLA和100 μg/mL的甘草素[11]后構建H/R細胞模型)。

1.4 CCK-8實驗檢測細胞存活率

將各組H9c2細胞接種在96孔細胞板上,分別滴入10 μL的CCK-8溶液,2 h后使用酶標儀測定各組細胞在450 nm處的光密度值,評估細胞的存活率。

1.5 流式細胞術檢測細胞凋亡情況

分別在對數生長期的各組H9c2細胞中依次加入10 μL的V-異硫氰酸熒光素(AnnexinV-FITC)和碘化丙啶(propidium iodide,PI),避光反應30 min,上流式細胞儀檢測各組H9c2細胞凋亡情況。

1.6 細胞中ROS、LDH、抗氧化酶及炎性因子水平測定

收集經過處理的各組H9c2細胞,使用磷酸鹽緩沖液進行清洗,然后在37 ℃下,使用10 μmol/L的2′-7′-二氯熒光黃雙乙酸鹽(DCFH-DA)避光處理30 min。接著,使用流式細胞儀分析各組H9c2細胞的相對熒光強度,反映ROS水平。按照LDH、SOD、MDA檢測試劑盒的方法對各組細胞上清液進行LDH活性及SOD、MDA含量測定。利用ELISA方法檢測炎性因子腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素-6(IL-6)水平。

1.7 實時熒光定量聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)檢測HMGB1、TLR4、NF-κB p65 mRNA表達

利用TRIzol試劑提取各組H9c2細胞總RNA,并逆轉錄成cDNA,按照qRT-PCR儀器的說明書進行程序設定和聚合酶鏈式反應(PCR)擴增。采用2-ΔΔCt方法計算HMGB1、TLR4、NF-κB p65 mRNA表達水平,甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內參基因。HMGB1、TLR4、NF-κB p65引物序列見表1。

表1 HMGB1、TLR4、NF-κB p65、GAPDH引物序列

1.8 蛋白質免疫印跡法(Western Blot)檢測HMGB1、TLR4、NF-κB p65蛋白表達

提取各組H2c9細胞總蛋白并使用二喹啉甲酸(BCA)試劑盒測定蛋白濃度,然后進行凝膠電泳,轉膜,脫脂奶粉封閉處理后,加入anti-HMGB1、anti-TLR4、anti-NF-κB p65和anti-p-NF-κB p65一抗,次日加入辣根過氧化物酶標記的二抗,繼續孵育1 h,使用增強型化學發光試劑(ECL)試劑進行顯影,并分析其蛋白表達水平。

1.9 統計學處理

2 結 果

2.1 各組H9c2細胞存活率比較

與對照組比較,模型組H9c2細胞存活率明顯降低(P<0.05);GLA-L組、GLA-M組和GLA-H組H9c2細胞存活率均明顯高于模型組,呈劑量依賴性(P<0.05);而與GLA-H組比較,GLA-H+甘草素組H9c2細胞存活率明顯升高(P<0.05)。詳見表2。

表2 各組H9c2細胞存活率比較 單位:%

2.2 各組H9c2細胞凋亡率比較

模型組H9c2細胞凋亡率明顯高于對照組(P<0.05);與模型組相比,GLA-L組、GLA-M組和GLA-H組H9c2細胞凋亡率依次降低(P<0.05);而與GLA-H組比較,GLA-H+甘草素組H9c2細胞凋亡率明顯降低(P<0.05)。詳見圖1、表3。

圖1 流式細胞儀檢測各組H9c2細胞凋亡情況

表3 各組H9c2細胞凋亡率比較 單位:%

2.3 各組H9c2細胞毒性和抗氧化酶比較

與對照組相比,模型組H9c2細胞中LDH活性和MDA含量明顯上升,ROS相對熒光強度明顯增強,SOD含量明顯降低,差異均有統計學意義(P<0.05);與模型組比較,GLA-L組、GLA-M組和GLA-H組H9c2細胞中LDH活性和MDA含量明顯下降,ROS相對熒光強度明顯減弱,SOD含量明顯升高,均呈現劑量依賴性,差異均有統計學意義(P<0.05);而與GLA-H組比較,GLA-H+甘草素組H9c2細胞中LDH活性和MDA含量明顯降低,ROS相對熒光強度明顯減弱,SOD含量明顯上升,差異均有統計學意義(P<0.05)。詳見表4。

表4 各組H9c2細胞毒性和抗氧化酶比較

2.4 各組H9c2細胞炎性因子表達比較

與對照組比較,模型組H9c2細胞中TNF-α、IL-6含量明顯增加(P<0.05);與模型組比較,GLA-L組、GLA-M組和GLA-H組H9c2細胞中TNF-α、IL-6含量明顯降低,且均表現為GLA-L組>GLA-M組>GLA-H組,差異均有統計學意義(P<0.05);而GLA-H+甘草素組H9c2細胞中TNF-α、IL-6含量明顯低于GLA-H組(P<0.05)。詳見表5。

表5 各組H9c2細胞炎性因子表達比較 單位:ng/L

2.5 各組H9c2細胞HMGB1、TLR4、NF-κB p65 mRNA水平比較

模型組H9c2細胞中HMGB1、TLR4、NF-κB p65 mRNA水平明顯高于對照組(P<0.05);與模型組相比,GLA-L組、GLA-M組和GLA-H組H9c2細胞中HMGB1、TLR4、NF-κB p65 mRNA水平依次降低(P<0.05);而GLA-H+甘草素組H9c2細胞中HMGB1、TLR4、NF-κB p65 mRNA水平明顯低于GLA-H組(P<0.05)。詳見表6。

表6 各組H9c2細胞HMGB1、TLR4、NF-κB p65 mRNA水平比較

2.6 各組H9c2細胞HMGB1、TLR4、NF-κB p65蛋白表達比較

與對照組比較,模型組H9c2細胞中HMGB1、TLR4蛋白表達水平與磷酸化NF-κB p65(p-NF-κB p65)/NF-κB p65值明顯升高(P<0.05);與模型組相比,GLA-L組、GLA-M組和GLA-H組H9c2細胞中HMGB1、TLR4蛋白表達水平與p-NF-κB p65/NF-κB p65值呈劑量依賴性降低(P<0.05);而GLA-H+甘草素組H9c2細胞中HMGB1、TLR4蛋白表達水平與p-NF-κB p65/NF-κB p65值明顯低于GLA-H組(P<0.05)。詳見圖2、表7。

圖2 各組H9c2細胞中HMGB1、TLR4、NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表達條帶圖

表7 各組H9c2細胞HMGB1、TLR4、NF-κB p65蛋白表達比較

3 討 論

MI/R損傷是伴隨心臟疾病介入治療、搭橋手術出現的一種機體損傷[12]。研究發現,從傳統中藥里提取的活性物質可對MI/R損傷產生保護作用,如黃芪甲苷[13]、原花青素[14]、黃連素[15]等均可抑制H/R誘導的H9c2心肌細胞損傷。GLA是藍萼香菜的主要活性成分,其已被證實能夠激活AKT/Nrf2/血紅素加氧酶-1 (HO-1)通路抑制細胞凋亡、增強細胞活力,從而使H9c2細胞免受H/R誘導的損傷[16]。本研究通過H9c2細胞H/R損傷模型構建研究GLA對H/R誘導的H9c2心肌細胞損傷的作用。LDH、MDA、ROS和SOD是檢測細胞氧化應激損傷的標志物。細胞在受外界刺激發生損傷時,炎性因子(TNF-α、IL-6)水平會明顯增加。本研究結果顯示,模型組H9c2細胞存活率降低,細胞凋亡率升高,抗氧化酶MDA和ROS水平上升,SOD含量降低,炎性因子TNF-α、IL-6含量增加,揭示H/R誘導可使H9c2細胞活性和氧化應激能力降低,并促進細胞凋亡和炎癥反應。而模型組H9c2細胞中LDH活性明顯提高,說明H9c2細胞H/R損傷模型構建成功。在H9c2細胞H/R損傷模型細胞中分別加入低、中、高劑量的GLA后,細胞存活率明顯升高,凋亡率明顯降低,LDH活性、ROS水平和MDA含量明顯下降,SOD含量明顯升高,TNF-α、IL-6含量明顯下降,均呈劑量依賴性。表明GLA能修復H/R誘導的H9c2細胞損傷,增強細胞活性并抑制凋亡。

研究顯示,H/R誘導的H9c2心肌細胞損傷與HMGB1/TLR4/NF-κB通路關系密切[17]。在MI/R等細胞損傷情況下,產生炎癥的重要介質是HMGB1。而HMGB1可與多種受體結合進而參與心肌細胞的增殖、凋亡以及炎癥反應過程[18]。TLR4是HMGB1的關鍵受體之一,兩者相互作用能夠促進炎癥反應的發生。同時,激活TLR4后,下游NF-κB轉錄因子上調表達,促使細胞中產生更多的炎性因子,進而加重細胞損傷程度[19]。Zhang等[20]研究發現,miR-708可靶向下調HMGB1的表達抑制TLR4/NF-κB通路的激活,進而降低凋亡和炎癥反應并保護H/R誘導的心肌細胞損傷。然而,在H/R誘導的H9c2細胞損傷中,GLA與HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路的關系及其作用機制尚未明確。本研究結果顯示,模型組H9c2細胞中HMGB1、TLR4表達與NF-κB p65磷酸化水平均明顯升高;GLA-L組、GLA-M組和GLA-H組H9c2細胞中HMGB1、TLR4表達與NF-κB p65磷酸化水平依次降低,揭示GLA能逆轉H9c2細胞H/R損傷模型中HMGB1、TLR4、p-NF-κB p65的高表達。此外,甘草素是HMGB1的抑制劑,能夠通過抑制HMGB、TLR4、NF-κB表達從而減輕放射性肺損傷。本研究進一步發現,抑制HMGB1表達后,GLA-H+甘草素組H9c2細胞HMGB1、TLR4表達與p-NF-κB p65水平降低;同時,細胞存活率升高、凋亡率降低,LDH活性、ROS水平和MDA含量明顯下降,SOD含量明顯升高,TNF-α、IL-6含量明顯減少,提示GLA和HMGB1/TLR4/NF-κB通路抑制劑甘草素可能存在協同作用,對保護H9c2細胞的作用更佳。說明GLA可能通過抑制HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路增加細胞活性、抑制細胞凋亡,對H/R誘導的H9c2細胞損傷產生保護作用。

綜上所述,GLA可能通過阻滯HMGB1/TLR4/NF-κB信號通路,降低細胞凋亡率,減少炎性因子表達,進而保護H9c2細胞免受H/R誘導的損傷。