大鼠椎間融合模型的建立以及力學測試

陳洪籌,林宏生,羅美香,陳詩強

(1.深圳市寶安區石巖人民醫院骨科,廣東 深圳 518108;2.暨南大學第一附屬醫院骨科,廣東 廣州 510632)

脊柱領域中最為常見手術為脊椎融合手術,多見于頸椎不穩定、腰椎退行性滑脫及椎間盤損傷,通過脊椎融合手術展開并有效穩定椎體,進一步降低神經受壓所致疼痛［1］。當前相關研究指出,如何選擇融合模型并為試驗結果提供可靠數據為當前學者需要解決問題之一。目前多通過動物試驗模擬脊椎椎體間植骨融合手術方法［2］。從動物上開展椎體間植骨融合,其手術操作復雜性高,椎間不穩定及融合材料較少等因素制約下,模型不被學者廣泛應用［3］。本次研究開展中,利用大鼠開展椎間植骨融合,配合影像學、生物力學及組織學下,驗證模型可行性,為后期研究開展提供可靠實驗數據。

1 材料與方法

1.1材料:2019年1月～2021年5月期間選取純種健康雄性SD大鼠60只(由動物中心提供,8～10 w,200～250 g/只),隨機分為三組,各20只,A組:植入自體骨量0.3 cm3,B組:植入自體骨量0.2 cm3,C組:不植骨(空白對照組)。所有試驗大鼠集中管理,自由飲水,保證生活環境光線充足,定期通風。

1.2方法

1.2.1動物模型制作:麻醉藥物為3%戊巴比妥,麻醉以腹腔注射,取背部手術區域并備皮、消毒,切口為皮膚脂棘突兩側3 mm,筋膜切開將髂骨暴露,鈍性分離取1.5 cm×1 cm髂骨塊,延伸切口尾骨根部,分離并取出平髂后上棘連線外椎體(第一尾椎)后,取出上下相鄰椎間盤,配合牙科磨鉆打磨暴露松質骨,對上下椎體位置置入植入物,間距固定7 mm。制備植骨床,髂骨、椎體制作成0.3 cm3(A組)、0.2 cm3(B組)、0.0 cm3(C組、空白對照),顆粒狀骨置入其中,4-0可吸收線封閉關閉切口。術后處理:每12 h予以丁諾菲止痛,維持2 d,術后3 d常規青霉素鈉肌內注射,并自由飲食,常規術后10 d拆線。對試驗期間,并發癥發生及死亡、傷口愈合情況進行觀察。

1.2.2評價方法:①骨相關細胞因子試驗:分別在術后動物模型后0、3、5、7、14、30 d抽取靜脈血總計3 ml,分別監測鼠骨鈣素(BGP)、骨堿性磷酸酶(BALP)、轉化生長因子β(TGF-β)、骨形態蛋白(BMP-2)、血管內皮生長因子(VEGF)的光密度值(OD值)。試驗采取酶聯免疫分析試劑盒開展,將獲取血液樣本放置在自然溫室下,自然放置凝固后,并以3 500 r/min離心10 min,取得血清放置在-20℃冰箱中冷凍保存,等待檢測。當血樣標本取全后,依據試劑盒說明書進行各項指標檢測;②放射學檢查:術后1、2、3個月在麻醉后,DR X線放射學對各個時間點展開檢查。依據有無骨形成、假關節/融合評分,由3個未參與試驗醫生觀察,依據放射學評分表進行評分:0分:無骨形成;1分:有少量新生骨形成或明確假關節;2分:中等量新生骨形成,明確假關節;3分:形成良好新生骨,可能假關節;4分:良好新生骨形成,可能假關節;5分:確定融合;③組織學觀察:4%多聚甲醛固定,5%硝酸脫鈣梯度脫水,透明,石蠟包埋,矢狀位切片,厚度為5 μm,HE、Masson染色后鏡下觀察;④生物力學驗證:半定量法:觸診法作為常見方式,利用手觸摸脊柱融合節段活動情況,并辨別融合效果,判斷是否存在假關節。有限元分析方法:通過三維CT并對提供數據造模,開展有限元分析,對相鄰椎間盤以及上下接觸面應力情況分析。

2 結果

2.1大鼠試驗結局:試驗手術實施期間,術中失血只數為4只(A組3只,B組1只),術后感染死亡2只(A組1只,B組1只),5只中術后3 d有血腫,反復抽吸痊愈。3 d內補齊所有死亡動物。融合率:4 w后隨機處死一半大鼠,手觸檢查:A組融合率為1只(10.00%),B組、C組未出現融合,6 w后處死另外一半大鼠,A組融合4只(40.00%),B組融合為4只(40.00%),C組為0只(0.00%)。

2.2組織學觀察:6 w后觀察三組切片標本結果,A組、B組中,融合組織有豐富骨橋,呈現成熟骨吸收,為類骨樣組織為表現,互相連接形成骨小梁,被發育良好骨髓腔包繞。A組、B組未融合組:伴有新骨形成,少量新生骨、成熟骨組織,骨髓腔內未完全再通,分布大量纖維樣組織,C組排列大量紊亂膠原纖維,未見到新生骨組織。

2.3A組、B組術后不同時間段骨相關細胞因子分析:兩組BGP、BALP、TGF-β、BMP-2、VEGF水平分別在術后0、3、5、7、14、30 d比較,差異無統計學意義(P>0.05)。見表1,表2。

表1 A組術后不同時間段骨相關細胞因子分析

表2 B組術后不同時間段骨相關細胞因子分析

2.4三組不同時間段的X線評分:A組、B組術后2 w、術后3 w、術后4 w X線評分高于C組,差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 三組不同時間段的X線評分分,n=20)

3 討論

脊椎外科領域中,融合手術成為常見一類治療手段,但當前臨床應用過程中,仍然存在較多問題未解決,如自體骨來源受限、取骨區域并發癥、假關節形成等［4］。當前為進一步解決上述問題,多數學者做出相應研究。遵循研究對象,可分為臨床研究與動物實驗研究。但當前各項研究實施及應用中,局限性較大,由于實驗開展中非控制性因素較多,其研究結果會對實驗結果造成干擾,引起偏倚［5］。動物實驗開展中,往往具備下述幾點優勢:遵循相同動物種類、年齡、性別以及體重等所致結果因素可控性較高,此時個體之間所致差異性較小。同時,基于外科技術所致因素控制下,局部環境一致,可準確對療效改變進行評價。利用組織學方法,定性、定量評價試驗中獲取生物學結果［6］。利用破壞生物力學試驗對機械完整性評估。目前研究針對大鼠脊柱融合模型以外側路融合為主,臨床多采取上述椎間融合,但與臨床不符,本次研究依據大鼠脊柱解剖特點,設計全新脊柱融合模型制作方法［7］。

本次研究中,以大鼠第一尾椎作為動物模型建立部位,而上述部位暴露椎體后,極易取出,由于附著周圍肌肉組織中,伴有豐富血液利于術后恢復,融合骨塊生長速度較快。為此,靠近下方椎體未出現融合情況［8］。對其原因分析指出,與椎體位置較深不易取出相關聯,且手術實施中會對神經、血管造成損傷,依據上述因素綜合考慮,可取此處椎體更佳。上述結果顯示,外側入路融合手術整體成功率較高,表明本次試驗成功。通過組織學檢查,A組與B組融合組織中,表現出豐富骨橋、成熟骨吸收,特征表現為類骨樣組織,兩者相互連接后形成骨小梁,并被發育良好骨髓包圍［9］。C組以大量排列紊亂膠原纖維為主,未見到新生骨組織。此時經組織學檢查后清晰觀察新生骨及骨量,但切片以外組織上無法明確觀察,會丟失融合塊信心［10］。針對上述因素,利用手觸檢查后,可有效辨別是否融合,經X線檢查,X線對融合判斷存在一定局限性,且在動物試驗中,X線并非為判斷融合金標準,而是為一項參考標準。因此,試驗實施期間需配合其他檢查項目聯合進行,確定準確性［11］。大鼠椎間融合模型開展,據統計以后外側路融合中,假關節發生率為26.00%,而兔子后外側路融合中假關節發生率為33.00%～37.00%［12］。研究結果表明,對大鼠進行自體骨移植椎間融合情況分析,6 w后融合率40%,假關節比率為60%。進一步指出,非自然融合下具備成骨性,相比較自然融合,利用骨誘導材料或具有成骨性藥物所獲取結果中,經手術方式與融合技術聯合下,可提供融骨成功率,減少并發癥率,與臨床椎間融合相符［13］。證實本次試驗開展具有一定臨床意義,后續可用于臨床,但仍需進一步深入研究探討。

綜上所述,本次試驗模型中,將手術方式與融合技術相結合,進一步提高融合成功率,減少并發癥率,與臨床椎間融合相符。