不同制備工藝的海帶提取物對(duì)黃瓜幼苗促生長(zhǎng)作用研究

王鵬遠(yuǎn) 趙帥 李飛雨 杜春影 遲永洲 沈照鵬 王鵬

(1 中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東青島 266003; 2 青島市生物藥肥工程研究中心,山東青島 266717)

隨著我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展,過度施用化肥帶來的土壤板結(jié)退化、肥料利用率低和作物質(zhì)量下降等問題逐漸凸顯,嚴(yán)重制約著我國綠色農(nóng)業(yè)和高質(zhì)量農(nóng)業(yè)的發(fā)展。探尋減肥提質(zhì)的方法已成為當(dāng)前趨勢(shì),環(huán)境友好型生物刺激劑已成為新的熱點(diǎn)[1],其中海藻源生物刺激劑約占全球生物刺激劑市場(chǎng)份額的三分之一[2],受到廣泛關(guān)注。褐藻是商業(yè)生產(chǎn)海藻提取物最常用的原料,包括海帶、泡葉藻、馬尾藻、巨藻等,其中海帶在我國藻類養(yǎng)殖業(yè)中占有重要地位,2020年我國海帶總產(chǎn)量為165萬t,占我國藻類總產(chǎn)量的63%[3],因此,是生物刺激劑的理想來源。對(duì)海帶的高值化應(yīng)用的研究表明,海帶提取物的活性物質(zhì)種類豐富,包括多糖、蛋白質(zhì)、酚類化合物、植物激素等,這些物質(zhì)通過單獨(dú)或協(xié)同作用影響植物的生理生化反應(yīng),如促進(jìn)植物生長(zhǎng)和養(yǎng)分吸收,增強(qiáng)植物的抗脅迫能力,刺激葉綠素和植物激素的生物合成[4],還可以重塑根系微生物群落結(jié)構(gòu)、提高土壤的保水能力[5]。多糖是海帶中最重要的成分之一,約占海帶提取物干質(zhì)量的10%～30%[6]。多糖能夠促進(jìn)植物生長(zhǎng),有研究表明,在黃瓜幼苗葉片噴施褐藻寡糖可有效促進(jìn)幼苗的光合作用,提高其抗氧化酶的活力,進(jìn)而提高黃瓜產(chǎn)量[7]。

目前,在工業(yè)上廣泛應(yīng)用的海帶提取物的制備工藝有化學(xué)酸解法和生物酶解法。不同制備方法會(huì)影響提取物的成分和其生物刺激效果[8]。化學(xué)酸解法工藝簡(jiǎn)單,反應(yīng)較徹底;生物酶解法工藝要求高,但產(chǎn)物活性高,二者各有優(yōu)勢(shì)[9]。本研究采用化學(xué)酸解法(簡(jiǎn)稱酸法)和生物酶解法(簡(jiǎn)稱酶法)分別制備海帶提取物,分析其成分與結(jié)構(gòu)表征,并比較和評(píng)價(jià)不同制備工藝的海帶提取物對(duì)黃瓜幼苗生長(zhǎng)參數(shù)和生化指標(biāo)的影響,以期為海藻源生物刺激劑的開發(fā)和生產(chǎn)提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

干海帶購自山東尋山集團(tuán)有限公司;黃瓜種子購自江蘇南京金豐種苗有限公司;無水乙醇、磷酸氫二鈉、氫氧化鉀、苯酚、葡萄糖、氯化鉀、濃硫酸等化學(xué)試劑購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,均為分析純;褐藻膠裂解酶(1×104U/g)由中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院應(yīng)用微生物實(shí)驗(yàn)室提供;酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒購自江蘇晶美生物科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 海帶提取物的制備

酸解海帶提取物(ALE):將干海帶磨碎,稱取150 g海帶粉添加到1 L硫酸溶液(體積分?jǐn)?shù)為2%)中,室溫下在5 L發(fā)酵罐中攪拌20 min,然后迅速升溫至121 ℃,在121 ℃、0.12 MPa條件下持續(xù)反應(yīng)30 min,4 000 r/min離心10 min,用KOH將所得上清液的pH調(diào)至7.0,即獲得酸解海帶提取液[10]。

酶解海帶提取物(ELE):將干海帶磨碎,稱取150 g海帶粉溶于2.25 L超純水中,緩慢加入緩沖溶液(檸檬酸-磷酸氫二鈉)將pH調(diào)至6.0,加入0.03 g褐藻膠裂解酶(1×104U/g),在30 ℃條件下在5 L發(fā)酵罐中保溫酶解3 h,4 000 r/min離心10 min后取上清液,即獲得酶解海帶提取液[11]。

根據(jù)不同倍數(shù)梯度稀釋的預(yù)試驗(yàn)結(jié)果的規(guī)律性和典型性,最終確定將兩種海帶提取物稀釋至可溶性固形物含量分別為0.08、0.12、0.24 g/L(即低、中、高濃度),用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.2 酸解和酶解海帶提取物的組分分析

將樣品在馬弗爐中550 °C下煅燒6 h,根據(jù)AOAC法測(cè)定灰分含量[12]。以葡萄糖和牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品,分別用苯酚-硫酸法和福林酚法測(cè)定總糖和總蛋白質(zhì)含量[13]。采用福林酚法測(cè)定總多酚含量[14]。采用間羥基聯(lián)苯法測(cè)定海藻酸含量[15]。根據(jù)Chi等[12]的方法,使用TSK-GEL G4000 PWxl色譜柱(7.8 mm×30 cm,Tosoh,Shiba,Tokyo,JP)測(cè)定樣品中多糖的分子量及其分布。

1.2.3 植物培養(yǎng)

將7組(每組21粒)黃瓜種子在25 ℃無菌水中萌發(fā)2 d后,將其移入裝有土壤的21孔穴盤中,并在光周期16∶8(即光照時(shí)長(zhǎng)16 h,黑暗時(shí)長(zhǎng)8 h)、溫度為25 ℃、相對(duì)濕度為60%、照度為400 μmol/(m2·s)的環(huán)境中培養(yǎng)。8 d后,對(duì)照組(CK)用1 L蒸餾水進(jìn)行灌根處理。試驗(yàn)組中,3組分別用0.08 g/L(L-ALE)、0.12 g/L(M-ALE)、0.24 g/L(H-ALE)的酸解海帶提取液各1 L進(jìn)行灌根處理;另外3組分別用0.08 g/L(L-ELE)、0.12 g/L(M-ELE)、0.24 g/L(H-ELE)的酶解海帶提取液各1 L進(jìn)行灌根處理。培養(yǎng)16 d后(黃瓜幼苗展開第3功能葉),收集樣品,用于評(píng)價(jià)指標(biāo)的測(cè)定。

1.2.4 黃瓜幼苗生長(zhǎng)參數(shù)的測(cè)定

測(cè)量每組黃瓜幼苗的表觀生長(zhǎng)參數(shù),包括株高、根長(zhǎng)、地上部分鮮質(zhì)量和根部鮮質(zhì)量。

1.2.5 葉綠素含量的測(cè)定

根據(jù)Liu等[8]的方法提取并測(cè)定葉綠素,取0.3 g葉片在5 mL 95%乙醇中勻漿,然后在室溫下以4 000 r/min離心10 min,上清液用95%乙醇定容至25 mL,并測(cè)量649 nm和665 nm處的吸光度。葉綠素a和葉綠素b含量的計(jì)算公式如下:

葉綠素a含量=12.71A665-2.59A649

(1)

葉綠素b含量=22.88A649-4.67A665

(2)

式(1)～(2)中:A649表示樣品在649 nm處的吸光值,A665表示樣品在665 nm處的吸光值。

1.2.6 可溶性糖含量的測(cè)定

根據(jù)Zou等[16]的方法提取葉片中的可溶性糖。取0.3 g葉片在5 mL蒸餾水中勻漿,然后在100 ℃下加熱30 min,過濾后的濾液用蒸餾水定容至25 mL,通過苯酚-硫酸法測(cè)定可溶性糖含量[13]。

1.2.7 可溶性蛋白含量的測(cè)定

按照He等[17]的方法提取葉片中的可溶性蛋白質(zhì)。取0.3 g葉片在5 mL水中勻漿,然后在室溫下以4 000 r/min離心10 min,所得上清液用磷酸鹽緩沖液定容至10 mL。以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn),用考馬斯藍(lán)在595 nm處測(cè)定上清液中的可溶性蛋白質(zhì)含量[13]。

1.2.8 植物激素含量的測(cè)定

取0.1 g幼苗第3功能葉,在0.9 mL提取液(pH為7.4)中勻漿。在4 ℃下以12 000×g離心15 min后,通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒測(cè)定上清液中的吲哚乙酸(IAA)和赤霉素(GA)的水平,相應(yīng)的檢測(cè)范圍為2～48 pmol/L和20～480 ng/L[18]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Minitab 19軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理,采用單因素方差分析方法(one-way ANOVA)對(duì)處理組與對(duì)照組的數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析,設(shè)顯著性水平為0.05。采用GraphPad 8.0.1軟件進(jìn)行繪圖制作。

2 結(jié)果

2.1 海帶提取物組分分析

酸解海帶提取物(ALE)和酶解海帶提取物(ELE)的化學(xué)組分見表1。兩種工藝獲得的海帶提取液中,以海藻酸為代表的多糖含量較高,不同工藝在有效物質(zhì)的提取率方面有顯著性差異,ALE的海藻酸、總蛋白質(zhì)、多酚和甘露醇的含量均顯著高于ELE(P<0.05)。在多糖分子量方面,通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出,ALE中多糖的重均分子量為4 209 Da,ELE中多糖重均分子量為2 420 Da(見圖1)。

表1 酸解海帶提取物(ALE)和酶解海帶提取物(ELE)的組分分析

圖1 多糖分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線以及ALE和ELE中多糖分子量分布

2.2 不同工藝海帶提取物對(duì)黃瓜幼苗生長(zhǎng)指標(biāo)的影響

由表2可見,與對(duì)照組相比,中、高劑量的ALE和ELE對(duì)黃瓜幼苗的株高均有顯著增效(P<0.05),分別提高了35.0%、32.5%、15.0%和32.5%,其中,高劑量ALE(H-ALE組)作用效果最好;中劑量ALE和ELE對(duì)根系生長(zhǎng)均有顯著促進(jìn)作用(P<0.05);在鮮質(zhì)量方面,中劑量ALE和低劑量ELE處理的黃瓜幼苗地上部分鮮質(zhì)量顯著增加,分別增加了66.6%和36.8%,低、中劑量ALE對(duì)根部鮮質(zhì)量有顯著促進(jìn)作用(P<0.05)。

表2 ALE和ELE對(duì)黃瓜幼苗表觀生長(zhǎng)指標(biāo)的影響

2.3 不同工藝海帶提取物對(duì)黃瓜幼苗葉綠素含量的影響

由圖2可見,與對(duì)照組相比,不同ALE和ELE處理組黃瓜幼苗的葉片葉綠素a和葉綠素b含量均顯著增加(P<0.05)。其中ALE 3個(gè)處理組黃瓜幼苗的葉綠素a含量分別提高了20.3%、9.5%、22.5%,葉綠素b含量分別提高了49.1%、31.5%、44.3%。

注:相同系列數(shù)據(jù)上標(biāo)字母不同表示組間差異顯著(P<0.05),上標(biāo)字母相同表示組間差異不顯著(P>0.05)。

2.4 不同工藝海帶提取物對(duì)黃瓜幼苗可溶性糖含量的影響

由圖3可見,與對(duì)照組(CK)相比,中、高劑量ALE和ELE組可溶性糖的含量均有顯著提高(P<0.05),其中,中劑量ALE處理組的可溶性糖含量最高,與對(duì)照組相比提高了83.7%。

注:數(shù)據(jù)上標(biāo)字母不同表示有顯著差異(P<0.05),上標(biāo)字母相同表示沒有顯著差異(P>0.05)。

2.5 不同工藝海帶提取物對(duì)黃瓜幼苗可溶性蛋白質(zhì)含量的影響

由圖4可見,與對(duì)照組相比,ALE和ELE均顯著提高了黃瓜幼苗中的可溶性蛋白質(zhì)含量(P<0.05),其中,低劑量ALE的效果最好,可溶性蛋白質(zhì)含量提高了74.2%。中、高劑量的ELE比同劑量的ALE作用效果更為明顯(P<0.05)。

2.6 不同工藝海帶提取物對(duì)黃瓜幼苗植物激素含量的影響

由圖5可見,與對(duì)照組相比,各ELE處理組顯著提升了黃瓜幼苗GA和IAA的含量(P<0.05),且作用效果均隨著劑量的增大而減弱。低劑量ELE處理組對(duì)黃瓜幼苗IAA和GA含量的提升效果最佳,分別提升了69.6%和75.8%。

注:數(shù)據(jù)上標(biāo)字母不同表示有顯著差異(P<0.05),上標(biāo)字母相同表示沒有顯著差異(P>0.05)。

3 討論

ALE中降解多糖的分子量分布較寬,這可能是由于在酸解時(shí)糖苷鍵會(huì)隨機(jī)斷裂,共軛酸質(zhì)子作用于環(huán)糖苷鍵,使碳氧離子鍵斷裂并形成非還原基端,因此獲得不均勻的多糖碎片[9]。ELE中降解多糖的分子量呈現(xiàn)正態(tài)分布,所用的褐藻膠裂解酶能通過β消除作用于海帶中褐藻膠的β-1,4-糖苷鍵,并在產(chǎn)物非還原端C4和C5之間形成不飽和雙鍵[19],采用這種專一性酶解方式能夠獲得較為均一的多糖降解片段。

整體來看,ALE對(duì)黃瓜幼苗的促生長(zhǎng)作用更為明顯,這可能與褐藻多酚的作用有關(guān)。相關(guān)研究證明,將海藻多酚物質(zhì)應(yīng)用于玉米葉片的表面和根系,可顯著改善玉米的生長(zhǎng)指標(biāo)參數(shù),同時(shí)促進(jìn)植株根、莖、葉的生長(zhǎng),增大葉片面積并提高葉片數(shù)及生物量[20]。本試驗(yàn)中,ALE中的多酚含量顯著高于ELE,說明ALE的作用效果更優(yōu)。

葉綠素在光能吸收、轉(zhuǎn)移和光化學(xué)電荷分離等方面發(fā)揮作用,葉綠素a和葉綠素b的含量、比例、分布可調(diào)控葉片的光合作用[21]。其中,ALE的作用效果優(yōu)于ELE,這可能與ALE中海藻酸和多酚含量更高有關(guān)。海藻酸和褐藻多酚已被證實(shí)對(duì)光合色素合成有積極影響。經(jīng)海藻酸和多酚處理的煙草和甘藍(lán)葉具有較高的葉綠素以及其他色素含量,為捕光色素蛋白復(fù)合物(LHCS)和光系統(tǒng)Ⅱ反應(yīng)中心(PSⅡRC)的合成提供了原料[22]。

可溶性糖在植物體內(nèi)可以作為能量物質(zhì)提供植物生長(zhǎng)所需的能量,可以作為信號(hào)分子調(diào)節(jié)內(nèi)源酶的表達(dá)。糖信號(hào)與激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)有一定的相互作用,是植物生長(zhǎng)評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)[23]。研究發(fā)現(xiàn),海藻酸通過上調(diào)部分光合作用的基因,增強(qiáng)作物光合作用或刺激酶合成等途徑,促進(jìn)了可溶性糖的積累[23-24]。據(jù)報(bào)道,植物光系統(tǒng)PSⅡ反應(yīng)中心只有葉綠素a的存在,因而光合作用與葉綠素a含量關(guān)系非常密切,但過量的葉綠素積累會(huì)引起光氧化損傷[25-27]。本試驗(yàn)中,黃瓜幼苗中的葉綠素含量與可溶性糖含量有一定的相關(guān)性,ALE和ELE通過提升葉綠素含量促進(jìn)了可溶性糖的積累,這種效應(yīng)已在櫻桃、葡萄、番茄、玉米等多種作物中得到證實(shí)[20]。

可溶性蛋白質(zhì)是植物中氮的主要形式,它在植物的生長(zhǎng)發(fā)育中起著重要作用,是反映植物整體代謝狀態(tài)的多種酶的重要組成部分[28]。已有研究表明,海藻提取物能夠提高甜玉米對(duì)氮素的利用率,促進(jìn)可溶性蛋白質(zhì)積累,提高玉米產(chǎn)量[29]。據(jù)報(bào)道,海藻寡糖可提高植物體內(nèi)硝酸還原酶、谷氨酸脫氫酶的活性,使更多的NH4+轉(zhuǎn)化成有機(jī)氮進(jìn)入氮代謝循環(huán),有利于蛋白質(zhì)的積累[10]。

GA和IAA是調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育的重要激素,對(duì)細(xì)胞的分裂、伸長(zhǎng)和分化都有一定的作用,同時(shí),IAA有誘導(dǎo)調(diào)控維管束分化、調(diào)控根的分化形成、促進(jìn)果實(shí)發(fā)育等功能[30]。褐藻提取物已經(jīng)被證明用于植物中可以調(diào)節(jié)參與細(xì)胞分裂素、脫落酸和赤霉素生物合成的基因的表達(dá),通過調(diào)節(jié)植物激素活性影響植物生長(zhǎng)[31]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),富含分子量為1.8 kDa和2.7 kDa多糖的褐藻提取物能夠提高黃瓜幼苗葉片中GA和IAA等植物激素的水平[10]。本試驗(yàn)中,ELE中多糖分子量為2 420 Da,對(duì)植物激素合成有更好的促進(jìn)作用。有研究表明,當(dāng)GA質(zhì)量濃度在0～200 mg/L時(shí),隨著濃度的增加,GA對(duì)黃瓜幼苗生長(zhǎng)的促進(jìn)作用增強(qiáng),但當(dāng)GA質(zhì)量濃度在200～350 mg/L時(shí),隨著濃度的增加,GA對(duì)黃瓜幼苗生長(zhǎng)的抑制作用增強(qiáng);IAA的作用同樣具有兩重性[32]。本試驗(yàn)中,ELE更有利于植物激素合成,但ALE對(duì)黃瓜幼苗的促生長(zhǎng)作用更優(yōu),原因可能是高濃度的植物激素對(duì)黃瓜幼苗的生長(zhǎng)會(huì)起到抑制作用。

4 結(jié)論

不同工藝制備的海帶提取液對(duì)黃瓜幼苗均有促生長(zhǎng)作用,在不同指標(biāo)方面的表現(xiàn)各異。在表觀生長(zhǎng)指標(biāo)方面,ALE表現(xiàn)出更好的促進(jìn)作用,且中劑量ALE作用效果最佳。這可能與相關(guān)激素的兩重性有關(guān)。在生化指標(biāo)方面,ALE對(duì)葉綠素含量的促進(jìn)作用優(yōu)于同劑量的ELE,兩種提取液均能提高可溶性蛋白質(zhì)和可溶性糖的含量。ELE組能顯著提高黃瓜幼苗的GA和IAA含量,且低劑量的ELE生物刺激效果最佳,較對(duì)照組分別提升了69.6%和75.8%。在實(shí)際的海帶源生物刺激劑的開發(fā)和生產(chǎn)過程中,建議根據(jù)產(chǎn)品的不同用途選擇合適的生產(chǎn)方式。