風輪菜中1個新的單萜△

趙迪，伍一煒，徐玉巖，范佳萍，張韻寒，楊蕊嶷，汪洪，吳麗麗，徐暾海*，朱寅荻

1.北京中醫藥大學 中藥學院，北京 100029；

2.溫州醫科大學 藥學院，浙江 溫州 325035；

3.北京中醫藥大學 中醫學院，北京 100029

風輪菜Clinopodium chinense（Benth.）O.Kuntze 別名九塔草、山薄荷、苦刀草，為唇形科（Labiatae）風輪菜屬（ClinopodiumLinn.）植物，主產于山東、浙江、江蘇、安徽、江西和福建等地[1]。《中華人民共和國藥典》2020 年版收載風輪菜干燥地上部分為中藥斷血流，具有收斂止血的功效，用于崩漏、尿血、鼻衄、牙齦出血和創傷出血[2]。研究發現，風輪菜屬藥用植物中含有三萜及其皂苷、黃酮、揮發油、苯丙素等類成分，其中皂苷、黃酮是該屬植物的主要活性成分。這些成分表現出多種生物學活性，包括抗炎止血[3]、抗高血糖、抗腫瘤、免疫抑制、心臟保護和抗輻射[4]。本課題組前期研究發現，斷血流具有活血和止血的活性，具有良好的開發價值。本研究對風輪菜的化學成分進行進一步研究，從中分離出9 個化合物，分別為 (4S,9S)-9-羥基茉莉酮（1）、紅花菜豆酸（2）、環-(S-脯氨酸-R-亮氨酸)（3）、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸甲酯（4）、2-甲氧基-4-(2-丙烯基)-苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（5）、吐葉醇（6）、柚皮素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸（7）、對-薄荷-3,8-二烯-1,2-二醇（8）、黃麻香堇醇C（9），結構見圖1。其中化合物1為新化合物，化合物2～3、5～6、8 為首次從風輪菜中分離得到。評估了從風輪菜提取物中分離得到的化合物1、6、9 的細胞保護活性，發現化合物9 對棕櫚酸（PA）誘導的肝癌HepG2 細胞損傷具有顯著的細胞保護活性（P＜0.001），且與劑量呈正相關，化合物6 在高劑量時有一定的細胞保護活性（P＜0.05）。

圖1 風輪菜中分離得到的化合物1～9

1 材料

1.1 樣品

風輪菜購買于安徽省亳州市中藥材市場，經溫州醫科大學藥學院汪洪副教授鑒定為唇形科風輪菜屬植物風輪菜Clinopodium chinense（Benth.）O.Kuntze。樣品標本（20170820）現存于溫州醫科大學藥學院。

1.2 細胞

HepG2 細胞為北京中醫藥大學基礎醫學院保存細胞株。

1.3 儀器與耗材

QoneAS400 型核磁共振波譜儀（武漢中科牛津波譜技術有限公司）；LTQ-Orbitrap XL 型質譜儀（美國Thermo-Fisher 公司）；PolA Ar 3005 型全自動旋光儀（英國Optical Activity 公司）；TU19 型雙光束紫外-可見光分光度計（北京普析通用儀器有限公司）；FTIR-850 型傅里葉變換紅外光譜儀（天津港東科技發展股份有限公司）；1260-6120 型液相色譜-單四極桿質譜聯用儀、1100 型高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；HERA cell 150i 型恒溫CO2培養箱（美國Thermo Scientific 公司）；HDL 型超凈工作臺（北京東聯哈爾儀器制造有限公司）；IX71 型倒置顯微鏡（日本Olympus 公司）；Glomaxmulti 型酶標儀（美國Promega 公司）；3k15 型臺式高速低溫冷凍離心機（美國Sigma-Aldrich 公司）；R200D 型分析天平（德國賽多利斯集團）；C100 型自動細胞計數儀（瑞沃德生命科技有限公司）。

Pack ODS-A型半制備色譜柱（250 mm×10 mm，5 μm）、C18反相填料均購于日本YMC 公司；柱色譜和薄層色譜硅膠（青島海洋化工廠）；D101 型大孔吸附樹脂（南開大學）；Sephadex LH-20（瑞典Amersham Biosciences公司）。

1.4 試劑

DMEM 低糖培養基（美國Gibco 公司）；鏈霉素、青霉素（北京博奧拓科技有限公司）；胎牛血清（美國O-RIGIN公司）；牛血清白蛋白（BSA）、棕櫚酸（PA）、細胞活力檢測試劑盒（CCK-8）均購于北京索萊寶科技有限公司；0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸溶液（1×，美國Hyclone公司）。

2 方法

2.1 提取與分離

取風輪菜干燥地上部分60 kg，粉碎，經70%乙醇提取，回收溶劑后加水分散，依次用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，回收溶劑得到各部分萃取物；將正丁醇萃取物經D101 大孔吸附樹脂柱分離，以30%、50%、70%、95%乙醇梯度洗脫，依次得到組分Fr.A～Fr.D。Fr.A 經硅膠柱色譜（100～200 目）分離，二氯甲烷-甲醇（100∶0～100∶50）梯度洗脫、薄層色譜檢識，得22個組分（Fr.A.1～Fr.A.22）；Fr.A.1 經C18反相柱色譜分離，甲醇-水（30∶70～90∶10）梯度洗脫，經薄層色譜檢識得到5 個組分（Fr.A.1.1～Fr.A.1.5）。Fr.A.1.4 經硅膠柱色譜（100～200 目）分離，二氯甲烷-甲醇（100∶5）洗脫，Sephadex LH-20 柱色譜及半制備高效液相色譜（檢測波長210 nm）分離純化得到化合物8（6 mg，甲醇-水40∶60，tR=26 min）。Fr.A.2經C18中壓柱色譜分離，甲醇-水（30∶70～90∶10）梯度洗脫，經薄層色譜檢識，得到3 個組分（Fr.A.2.1～Fr.A.2.3），Fr.A.2.2再經硅膠柱色譜（100～200目）分離，以石油醚-乙酸乙酯（100∶5～100∶50）梯度洗脫，經薄層色譜檢識，得到12個組分（Fr.A.2.2.1～Fr.A.2.2.12）。將Fr.A.2.2.6～Fr.A.2.2.7 經Sephadex LH-20 柱色譜及半制備高效液相色譜（檢測波長210 nm）分離純化得到化合物1[14 mg，甲醇-水（35∶65），tR=28 min]、2 [5 mg，甲醇-水（35∶65），tR=38 min]、3 [6 mg，甲醇-水（38∶62），tR=21 min]、6 [16 mg，甲醇-水（31∶69），tR=46 min]，9 [10 mg，甲醇-水（31∶69），tR=43 min]。Fr.A.2.3 再經硅膠柱色譜分離，以二氯甲烷-甲醇（100∶0～100∶50）梯度洗脫，經薄層色譜檢識，得到13個組分（Fr.A.2.3.1～Fr.A.2.3.13）。Fr.A.2.3.10 經C18中壓柱色譜分離，以甲醇-水（30∶70～90∶10）梯度洗脫，得到3個組分（Fr.A.2.3.10.1～Fr.A.2.3.10.3。Fr.A.2.3.10.2 經硅膠柱色譜（100～200 目）分離，二氯甲烷-甲醇（100∶5～100∶25）梯度洗脫，經薄層色譜檢識，合并得到4個組分（Fr.A.2.3.10.2.1～Fr.A.2.3.10.2.4）。Fr.A.2.3.10.2.4 經Sephadex LH-20 柱色譜分離得到化合物4（8 mg，淡黃色不溶物析出，析出溶劑為甲醇）。Fr.A.2.3.10.3 經Sephadex LH-20 柱色譜及半制備高效液相色譜分離純化（檢測波長210 nm）得到化合物7 [8 mg，甲醇-水（54∶46），tR=30 min]。

2.2 細胞保護活性

分別檢測化合物1、6、9 的細胞保護活性。用0.5 mmol·L-1PA處理HepG2細胞24 h，制備細胞損傷模型[5]，將造模后的HepG2細胞接種在96孔板中，密度為5×103個/孔。將細胞置于37 °C、含5% CO2的細胞培養箱中培養24 h。每孔加入不同質量濃度（5、10、20 μg·mL-1）的化合物1、6、9 10 μL刺激細胞，同時設置空白組（不加細胞）、對照組和模型組（不加藥物）。將96 孔板在37 °C、含5% CO2及100%濕度的細胞培養箱中孵育24 h。每孔加入培養基100 μL（含CCK-8 溶液10 μL）。37 °C、含5%CO2的培養箱中孵育2 h。用酶標儀在450 nm 處測定吸光度（A）。根據公式（1）計算細胞存活率。

3 結果

3.1 結構鑒定

HMBC中δH4.65 (1H,dd,J=6.2,1.8 Hz,H-4) 與δC208.0 (C-1),140.6 (C-2),173.1 (C-3),45.1 (C-5)有遠程相關，δH2.17 (1H,dd,J=17.8,1.8 Hz,H-5a),2.73 (1H,dd,J=17.8,6.2,H-5b) 與δC208.0 (C-1),140.6 (C-2),173.1 (C-3),72.1 (C-4) 有遠程相關；在1H-1H COSY 譜，H-4 與H-5 有相關峰（圖2）。根據以上數據推測該化合物含有1 個α、β不飽和酮的五元環片段。在HMBC 譜中，δH5.27 (1H,m,H-7),5.40 (1H,br t,J=10.8 Hz,H-8) 與δC64.3 (C-9) 有遠程相關，δH4.74 (1H,m,H-9) 與δC126.8 (C-7),136.3 (C-8),23.8 (C-10) 有遠程相關，在1H-1H COSY 譜可見H-6、H-7、H-8、H-9、H-10 有相關峰。根據以上數據推測該化合物有1個含有5個碳的烯烴側鏈。由H-6 與C-1，H-7 與C-2 有HMBC 遠程相關，可推測出烯烴側鏈與C-2相連。

圖2 化合物1的主要1H-1H COSY和HMBC相關

由H-4 與C-11 (δC14.0) 有HMBC 遠程相關，Me-11 與C-2、C-3、C-4 有HMBC 遠程相關，可推測出C-3 位連有1 個甲基。通過1H-1H COSY 譜可推測出C-9 連有1 個羥基，通過1H-1H COSY 和HMBC譜可推測出C-4 連有1 個羥基。根據H-8 的耦合常數（J=10.8 Hz）推斷雙鍵Δ7,8的構型為Z。以上數據推測化合物1 為茉莉酮[6]的9 號位連了1 個羥基，因此化合物1有C-4和C-9 2個手性碳。

CD 譜中，化合物1 顯示在230 nm 處有1 個負Cotton 效應，根據相關文獻對比[7]，推測化合物1 的C-4 的絕對構型為S。通過實驗電子圓二色譜（ECD）與計算ECD 對比（圖3）確定化合物1 的絕對構型，采用IEFPCM 模型，以甲醇為溶劑，在B3LYP/6-31G (d) 水平上計算 (4S,9S)-1、(4R,9S)-1、(4S,9R)-1 和 (4R,9R)-1 的理論ECD 譜[8]，結果表明計算出的 (4S,9S)-1 ECD 譜與實驗ECD 譜吻合，確定化合物C-4 的絕對構型為S，推測C-9 的絕對構型為S（圖3）。至此，化合物1 命名為 (4S,9S)-9-羥基茉莉酮 [(4S,9S) -9-hydroxyjasmololone]，通過1H-1HCOSY、HSQC、HMBC 譜對該化合物的所有氫碳信號進行了全歸屬，見表1。

表1 化合物1的1H-和13C-NMR數據（400/100 MHz,CD3OD)

圖3 化合物1的實測與不同構型計算ECD圖

化合物2：黃色油狀物，易溶于甲醇；結合1H-和13C-NMR譜，推測化合物2分子式為C15H20O5；ESIMSm/z: 303 [M+Na]+；1H-NMR (400 MHz,CD3OD)δ:5.81 (1H,s,H-2),8.08 (1H,d,J=16.0 Hz,H-4),6.50(1H,d,J=16.0 Hz,H-5),2.07 (3H,s,H-6),2.80 (1H,d,J=17.8 Hz,H-3'a),2.48 (1H,dd,J=2.0,18.0 Hz,H-3'b),2.71 (1H,dd,J=2.4,18.0 Hz,H-5'a),2.42 (1H,dd,J=2.4,18.0 Hz,H-5'b),1.21 (3H,s,H-7'),3.65 (1H,d,J=7.8 Hz,H-8'a),3.92 (1H,dd,J=3.2,7.8 Hz,H-8'b),1.09 (3H,s,H-9')；13C-NMR(100 MHz,CD3OD)δ: 169.7 (C-1),119.9 (C-2),151.3 (C-3),133.0 (C-4),133.7 (C-5),21.3 (C-6),83.0 (C-1'),87.9 (C-2'),54.1 (C-3'),211 (C-4'),53.3 (C-5'),48.7 (C-6'),19.5 (C-7'),78.6 (C-8'),15.9 (C-9')。以上數據與文獻報道一致[9]，故鑒定化合物2為紅花菜豆酸。

化合物3：無色片狀晶體（甲醇）；ESI-MSm/z:211 [M+H]+；結合1H-和13C-NMR譜，推測其分子式為C11H18O2N2；1H-NMR (CD3OD,400 MHz)δ: 5.77(1H,brs,N-H),3.47～3.54 (2H,m,H-3),1.92～2.30(4H,m,H-4,5),4.15 (1H,t,J=8.4 Hz,H-6),4.09(1H,dd,J=9.6,3.4 Hz,H-9),2.04 (1H,m,H-10),1.50 (1H,dd,J=14.6,9.6 Hz,H-10),1.76～1.67 (1H,m,H-11),0.93～0.99 (6H,m,Me-12,13)；13C-NMR(100 MHz,CD3OD)δ: 173.0 (C-1),46.6 (C-3),23.8(C-4),29.2 (C-5),60.4 (C-6),169.1 (C-7),54.8 (C-9),39.6 (C-10),25.9 (C-11),23.5 (C-12),22.4 (C-13)。以上數據與文獻報道的一致[10]，故化合物3 鑒定為環-(S-脯氨酸-R-亮氨酸)。

化合物4：淡黃色粉末；ESI-MSm/z: 459 [M-H]-；結合1H-和13C-NMR 譜推測其分子式為C22H20O11；1H-NMR (400 MHz,C5D5N)δ: 7.83 (2H,d,J=9.0 Hz,H-2',6'),7.10 (2H,d,J=9.0 Hz,H-3',5'),6.78(1H,s,H-3),6.76 (1H,d,J=2.2 Hz,H-8),6.54 (1H,d,J=2.2 Hz,H-6),5.43 (1H,d,J=5.6 Hz,H-1″),3.64 (3H,s,-OCH3)；13C-NMR (100 MHz,C5D5N)δ:164.9 (C-2),103.9 (C-3),182.9 (C-4),157.7 (C-5),101.6 (C-6),163.5 (C-7),95.2 (C-8),162.6 (C-9),106.7 (C-10),122 (C-1'),128.8 (C-2',6'),162.7 (C-4'),116.7 (C-3',5')，100.4 (C-1″),74.3 (C-2″),77.4 (C-3″),72.7 (C-4″),77.1(C-5″),170.2 (C-6″),51.9 (-OCH3)。以上數據與文獻報道基本一致[11]，故鑒定化合物4為芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸甲酯。

化合物5：白色粉末，易溶于甲醇；ESI-MSm/z: 327 [M+H]+；結合1H-和13C-NMR 譜推測其分子式為C16H22O7；1H-NMR (400 MHz,CD3OD)δ: 6.82(1H,br s,H-3),6.72 (1H,br d,J=8.6 Hz,H-5),7.08(1H,d,J=8.6 Hz,H-6),3.46 (2H,dd,J=8.2,1.6 Hz,H-7),5.95 (1H,m,H-8),5.01 (1H,d,J=18.6 Hz,H-9a),5.03 (1H,d,J=18.6 Hz,H-9b),4.84 (1H,d,J=7.8 Hz,H-1'),3.33～3.51 (4H,m,H-2',3',4',5'),3.69 (1H,m,H-6'a),3.87 (1H,br d,J=12.2 Hz,H-6'b),3.84 (3H,s,2-OCH3)；13C-NMR (100 MHz,CD3OD)δ: 146.3 (C-1),150.4 (C-2),114.0 (C-3),136.6 (C-4),122.2 (C-5),118.0 (C-6),40.8 (C-7),138.8 (C-8),116.0 (C-9),103.2 (C-1'),75.1 (C-2'),78.0 (C-3'),71.2 (C-4'),78.0 (C-5'),62.6 (C-6'),56.8 (2-OCH3)。以上數據與文獻報道一致[12]，故鑒定化合物5 為2-甲氧基-4-(2-丙烯基)-苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷。

化合物6：無色油狀物，易溶于甲醇；ESI-MSm/z: 247 [M+Na]+；；結合1H-和13C-NMR 譜推測其分子式為C13H20O3。1HNMR (400 MHz,CD3OD)δ: 2.49 (1H,d,J=17.0 Hz,H-2b),2.14 (1H,d,J=17.0 Hz,H-2a),5.86 (1H,s,H-4),5.76 (1H,d,J=15.6 Hz,H-7),5.80 (1H,d,J=15.6 Hz,H-8),4.33 (1H,m,H-9),1.23 (3H,d,J=6.4 Hz,H-10),1.03 (3H,s,H-11),1.01 (3H,s,H-12),1.90 (3H,d,J=1.4 Hz,H-13)；13C-NMR (100 MHz,CD3OD)δ: 42.6 (C-1),50.9 (C-2),201.4 (C-3),127.3(C-4),167.6 (C-5),80.1 (C-6),130.1 (C-7),137.1 (C-8),68.8 (C-9),24.0 (C-10),23.6 (C-11),24.7 (C-12),19.7 (C-13)。以上數據與文獻報道基本一致[13]，故鑒定化合物6為吐葉醇，與化合物9互為異構體，兩者具有相同的氫譜和碳譜數據，但比旋光度不同，查閱文獻推測為9 號位構型異構。兩者在流動相為31%甲醇的半制備高效液相色譜圖上顯示2 個峰。其中化合物9的出峰時間為43 min，化合物6的出峰時間為46 min。

化合物7：白色無定型粉末；ESI-MSm/z: 449[M+H]+；結合1H-和13C-NMR 譜推測其分子式為C21H20O11。1H-NMR (400 MHz,CD3OD)δ: 5.39 (1H,br d,J=12.0 Hz,H-2),3.20 (1H,dd,J=17.0,3.2 Hz,H-3a),2.74 (1H,dt,J=17.0,3.2 Hz,H-3b),6.17 (2H,m,H-6,8),7.32 (2H,d,J=8.5 Hz,H-2',6'),6.82(2H,d,J=8.4 Hz,H-3',5'),5.07 (1H,t,J=8.4 Hz,H-1″),3.60 (1H,t,J=9.2 Hz,H-2″),3.48 (2H,m,H-3″,4″),4.08 (1H,d,J=9.2 Hz,H-5″)；13C-NMR (100 MHz,CD3OD)δ: 166.8 (C-5),98.0 (C-6),165.2 (C-7),97.0(C-8),164.7 (C-9),105.1 (C-10),131.0 (C-1'),130.8(C-2'),116.3 (C-3'),159.3 (C-4'),116.5 (C-5'),129.3 (C-6'),171.0 (C-6″),198.8 (C-4),44.4 (C-3),80.8 (C-2),101.2 (C-1″),77.1 (C-2″),76.8 (C-3″),74.5 (C-4″),73.0 (C-5″)。以上數據與文獻報道對照基本一致[14]，故確定化合物7為柚皮素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸。

化合物8：無色油狀物，易溶于甲醇；ESI-MSm/z: 169 [M+H]+；結合1H-和13C-NMR 譜推測其分子式 為C10H16O2。1H-NMR (400 MHz,CD3OD)δ: 4.04(1H,br s,H-2),5.73 (1H,br s,H-3),2.39 (1H,m,H-5a),2.28 (1H,m,H-5b),1.84 (1H,m,H-6a),1.60(1H,m,H-6b),1.93 (3H,s,H-7),5.08 (1H,s,H-9a),4.96 (1H,s,H-9b),1.18 (3H,s,H-10)；13C-NMR(100 MHz,CD3OD)δ: 144.1 (C-8),139.0 (C-4),127.3 (C-3),112.7 (C-9),21.9 (C-6),21.0 (C-10),34.6 (C-5),25.4 (C-6),75.1 (C-2),72.6 (C-1)。以上數據與文獻報道一致[15]，故鑒定化合物8 為對-薄荷-3,8-二烯-1,2-二醇。

化合物9：無色油狀物，易溶于甲醇；ESI-MSm/z: 247 [M+Na]+；結合1H-和13C-NMR 譜推測其分子式為C13H20O3。1HNMR (400 MHz,CD3OD)δ: 5.87 (1H,s,H-4),5.77(1H,d,J=16.2 Hz,H-7),5.79 (1H,d,J=16.2 Hz,H-8),4.32 (1H,m,H-9),2.48 (1H,d,J=17.0 Hz,H-2β),2.15 (1H,d,J=17.0 Hz,H-2α),1.24 (3H,d,J=7.0 Hz,H-10),1.04 (3H,s,H-11),1.01 (3H,s,H-12),1.91(3H,d,J=1.4 Hz,H-13)；13C-NMR (100 MHz,CD3OD)δ: 42.6 (C-1),50.9 (C-2),201.4 (C-3),127.3 (C-4),167.7 (C-5),80.1 (C-6),130.3 (C-7),137.1 (C-8),68.9 (C-9),24.0 (C-10),23.6 (C-11),24.7 (C-12),19.8 (C-13)。以上數據與文獻報道基本一致[16]，故鑒定化合物9為黃麻香堇醇C。

3.2 細胞保護活性

實驗結果（表2）顯示，化合物9 對PA 誘導的HepG2 細胞損傷具有顯著的細胞保護活性（P＜0.001），且與劑量呈正相關，其中化合物9 的細胞保護活性較好。化合物6 高劑量組具有一定的細胞保護活性（P＜0.05），而分離得到的新化合物沒有表現出明顯的細胞保護活性。

表2 化合物1、6、9對PA誘導的HepG2細胞存活率的影響（±s,n=6）

表2 化合物1、6、9對PA誘導的HepG2細胞存活率的影響（±s,n=6）

注：與對照組比較，##P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，***P＜0.001。

4 小結

斷血流是我國傳統中藥，用藥歷史悠久，具有收斂止血的功效。斷血流片、斷血流膠囊和斷血流顆粒用于崩漏、尿血、鼻衄、牙齦出血和創傷出血。研究發現皂苷是其止血主要活性成分[17]，酚酸類成分具有抗心肌缺血再灌注損傷和輔助治療腫瘤的作用[18]。為進一步開發斷血流提供依據，本研究對風輪菜70%乙醇提取物的正丁醇萃取部位進行化學成分和藥理作用研究，從風輪菜中分離鑒定出9 個化合物，其中1 個新化合物，并通過實驗圓二色譜與計算圓二色譜確定和推測了新化合物4號位和9號位的絕對構型。以PA處理HepG2細胞損傷為模型，對化合物1 及其異構體化合物6 和9 進行了細胞保護活性研究，化合物9的活性較好，推測9號位的構型影響其活性。本研究為風輪菜的后續研究及相關新藥研發提供了依據。