基于網絡藥理學和GEO數據集的翻白草治療2型糖尿病分子機制探討

何旭，馬鑫彥，趙薇，張印江，魯碧楠*，龐宗然*

1.中央民族大學 藥學院，北京 100081；

2.民族醫藥教育部重點實驗室，北京 100081；

3.大理白族自治州人民醫院 藥劑科，云南 大理 671000

全球疾病負擔數據顯示，全球約有4.62 億人患2 型糖尿病（T2DM），相當于世界人口的6.28%，預計2030 年，全球T2DM 患病率將達到7.08%，T2DM 已成為全球健康領域的一種公共衛生負擔[1-2]。近30 年來，我國糖尿病患病率明顯上升，2015—2017 年我國18 歲以上人群糖尿病患病率上升至11.2%，T2DM 患者占糖尿病人群的90%以上[3-4]。糖尿病發病率高、合并癥多、用藥周期長及傳統降糖藥物的不良反應等問題給糖尿病的防治帶來巨大的挑戰。

翻白草Potentilla discolorBge.因葉片面青背白而得名，為薔薇科（Rosaceae）委陵菜屬植物翻白草的帶根全草，其味甘、微苦，性平，歸肝、胃、大腸經。翻白草是涼山彝族人民長期使用的一種藥物，彝族語稱為“期濤景”，彝族醫將其用于治療瘧疾、痢疾、風濕痛和月經不調等[5]。現代藥理研究表明，翻白草具有降血糖、調血脂、抗氧化、抗菌、抗病毒、抗炎鎮痛、抗腫瘤等多種活性[6-10]。Meta分析結果表明，翻白草提取物能夠顯著降低T2DM 小鼠的血糖水平及血清中膽固醇（TC）和三酰甘油（TG）的含量[11]。翻白草總黃酮可以顯著改善T2DM db/db 小鼠糖脂代謝紊亂和胰島素抵抗，減輕肝臟和胰腺組織的病理損傷，通過降低血清中空腹血糖（FBG）、糖化血清蛋白（GSP）、TC、TG、空腹血胰島素（FINS）、丙二醛（MDA）水平，提高高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、超氧化物歧化酶（SOD）水平，提高肝臟組織磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信號通路中胰島素受體底物-1（IRS-1）、葡萄糖轉運體4（GLUT4）蛋白表達水平和p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt，發揮防治T2DM作用[12]。此外，翻白草水提物能夠降低高脂飲食和鏈脲佐菌素誘導的T2DM 小鼠肝臟中磷酸烯醇丙酮酸羧激酶（PEPCK）和葡萄糖-6-磷酸酶（G6Pase）mRNA 水平，增加糖原合酶激酶3β（GSK3β）的磷酸化，通過調節糖異生和糖原合成來改善肝葡萄糖穩態[13]。民間偏方中翻白草代茶飲能夠降低血糖，目前已有翻白草治療T2DM的臨床報道，30～100 g·d-1開水沖泡代茶飲，能夠取得較好的治療效果，顯著降低T2DM 患者的空腹血糖和餐后2 h血糖水平[14-15]。但目前尚缺乏對翻白草治療T2DM 作用機制的全面和系統的研究。鑒于此，本研究基于網絡藥理學結合GEO 數據集探討翻白草治療T2DM 的分子機制，為翻白草的臨床應用提供更多的理論依據。

1 資料與方法

1.1 T2DM GSE系列獲取

在GEO 數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中，以“type-2 diabetes mellitus”“DM2”“T2DM” 詞條進行檢索，來源選擇“Homo sapiens”，系列類型選擇“Expression profiling by array”，獲取符合條件的GSE系列。

1.2 T2DM差異基因分析

使 用R 4.2.1（https://www.r-project.org/）中GEOquery程序包對基因芯片數據進行下載，提取表達矩陣，對原始數據進行log2轉化，采用normalizeBetweenArrays 函數對數據進行歸一化處理后提取臨床信息。

使用FactoMineR 和factoextra包對正常對照組和T2DM 組數據進行主成分分析（PCA），使用limma程序包對兩組進行差異基因分析，界定條件為|log2FC|＞1（FC為差異倍數）且P＜0.05，繪制火山圖。

1.3 翻白草作用靶點預測

在中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（TCMSP，https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）中檢索翻白草化學成分[16]，在SwissADME 數據庫中根據化學結構，結合口服生物利用度和類藥性五原則對各成分進行篩 選[17]，在SwissTargetPrediction 數據庫（http://swisstargetprediction.ch/）中選擇種屬為“Homo sapiens”，預測各成分的可能作用靶點[18]。在微生信在線平臺獲取T2DM 差異基因和藥物作用靶點的交集，即為翻白草治療T2DM的潛在作用靶點。

1.4 生物信息學分析

取T2DM 差異基因和翻白草作用靶點的交集，用clusterProfiler、ggplot2、ggthemes、enrichplot 包，以P＜0.05 作基因本體（GO）富集分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路分析。采用Cytoscape 3.9.1（https://cytoscape.org/）構建化學成分-靶點-通路網絡。

1.5 潛在作用靶點驗證

根據KEGG 通路分析結果，確定潛在作用靶點及靶點所對應的翻白草化學成分。PDB 數據庫（https://www.rcsb.org/）下載潛在作用靶點的3D 結構，PyMol 2.5 軟件（https://pymol.org/2/）對其進行去水和去殘基處理，PubChem 數據庫（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載化學成分的2D 結構并在Chem3D 軟件中轉化為3D 結構后，以潛在作用靶點作為受體，化學成分作為配體，經AutoDockTools 1.5.6 軟件（https://ccsb.scripps.edu/mgltools/）進行分子對接。

2 結果

2.1 T2DM差異基因分析

選擇GSE7014 表達芯片數據，該芯片集包含6個正常樣本和20個T2DM樣本，由PCA結果（圖1A）可知，正常組和T2DM 組顯示出較好的組內重復性和組間區分度。T2DM 差異基因分析結果見火山圖（圖1B），共有差異基因658 個，其中445 個為表達上調基因，213個為表達下調基因。

圖1 T2DM GSE7014表達芯片數據分析

2.2 翻白草治療T2DM的潛在作用靶點

TCMSP 數據庫檢索到翻白草化學成分20 個，各成分通過SwissADME篩選和SwissTargetPrediction靶點預測，共納入靶點785 個（表1），去除重復靶點411個，得到藥物作用靶點374個。藥物作用靶點與T2DM 差異基因取交集，得到翻白草治療T2DM的潛在作用靶點17 個，其中9 個表達水平上調，8個表達水平下調（表2）。

表1 翻白草中20 個化學成分經SwissADME 篩選和SwissTargetPrediction預測結果

表2 翻白草治療T2DM潛在靶點信息

2.3 富集分析與靶點-化學成分-通路分析

2.3.1 富集分析結果 對17 個潛在作用靶點進行GO 富集分析，以P＜0.05 為界定條件，選取生物過程、細胞組分和分子功能各自的前5 項，用R 軟件相應程序包進行富集分析（表3），細胞組分沒有富集到顯著差異的結果。涉及的生物過程主要有細胞內受體信號通路、DNA 結合轉錄因子活性的調節、DNA 結合轉錄因子活性的正向調節、細胞氨基酸分解代謝過程、端粒封頂的正向調節。分子功能主要有氧化還原酶活性 [作用于以煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）或煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP）為受體的供體的醛或氧基團]、結合轉錄共激活劑、氧化還原酶活性（作用于供體的醛或氧基團）、核受體活性和配體活化轉錄因子活性。

表3 翻白草治療T2DM靶點的GO富集分析

KEGG 通路分析結果表明，P＜0.05 的通路共有12 條，選取前8 條通路（P＜0.01）作分析，其中與T2DM 關系密切的有胰島素抵抗通路、缺氧誘導因子1（HIF-1）信號通路和脂肪細胞因子信號通路，參與的基因有PKC-θ、RELA、RPS6KA3、STAT3、LDHB和PFKFB3（表4）。

表4 翻白草治療T2DM靶點的KEGG通路分析

2.3.2 化學成分-靶點-通路分析 翻白草治療T2DM 的主要成分有原兒茶酸、咖啡酸、山柰酚、3,4,5-三羥基苯甲酸、羅索酸等，通過作用于PKC-θ、RELA、RPS6KA3、STAT3、LDHB、PFKFB3 等靶點來發揮治療作用。構建化學成分-靶點-通路網絡，見圖2。

圖2 翻白草治療T2DM靶點的化學成分-靶點-通路網絡

2.4 分子對接驗證

將靶點作為受體，與之對應的翻白草化學成分作為配體進行分子對接，根據親和力大小，選取與PKC-θ、RELA、RPS6KA3、STAT3、LDHB、PFKFB3結合性能最強的治療T2DM 的化學成分，作分子對接模式圖（圖3）。

圖3 翻白草治療T2DM靶點與化學成分分子對接模式

3 討論

網絡藥理學能夠揭示藥物化學成分-靶點-通路的整體調節機制，對藥物與疾病的相關性進行預測，明確藥物治療疾病的分子機制。與已報道的翻白草抗糖尿病的網絡藥理學研究方法相比[19]，本研究方法的不同之處在于借助GEO 數據庫檢索出T2DM 基因芯片的GSE 系列，利用R 軟件統計出健康人群和T2DM 患者的差異基因，并對化學成分和潛在靶點進行分子對接驗證。本研究結果表明，翻白草治療T2DM 的可能有效成分有咖啡酸、羅索酸、山柰酚、原兒茶酸和3,4,5-三羥基苯甲酸等，分別作用于PKC-θ、RELA、RPS6KA3、STAT3、LDHB、PFKFB3等靶點，通過調控胰島素抵抗通路、脂肪細胞因子信號通路和HIF-1信號通路來發揮治療T2DM作用。

胰島素抵抗是T2DM 的關鍵致病因素，表現為胰島素靶向組織對胰島素生理水平的反應性降低，機制與外周組織中異位脂肪堆積、內質網應激、炎癥、活性氧水平、腸道微生物群紊亂、脂肪因子調節失調等相關[20-21]。PKC 家族由3 個不同的群體組成，即常規的（α、βⅠ、βⅡ、γ）、新穎的（δ、ε、η、θ）和非典型的（ζ、λ）。PKC 是絲氨酸/蘇氨酸激酶，通過抑制胰島素受體底物的絲氨酸磷酸化，導致胰島素信號通路中斷，從而導致胰島素抵抗[22]。PKC-θ分布在免疫系統中，可以促進免疫細胞分泌白細胞介素-10（IL-10）。IL-10在糖尿病發展中表現出關鍵作用，敲除PKC-θ可減少小鼠體內IL-10的分泌，減少胰島β細胞質量和胰島素分泌[23]。肝臟PKC-ε和骨骼肌PKC-θ活性增加，可使TG和二酰甘油含量顯著升高，進而引起肝臟和肌肉胰島素抵抗[24]。RPS6KA3 是與胰島素抵抗相關的hsa-miR-33a-5p 的靶基因[25]，核糖體S6 激酶（RSK）是參與信號轉導的蛋白激酶家族。在正常組大鼠和糖尿病組大鼠中，胰島素能夠顯著增加各組大鼠后肢骨骼肌中細胞外調節激酶2（ERK2）、p90核糖體S6激酶（RPS6KA3 或RSK2）、Akt 和p70S6 激酶（p70S6k）的活性，與正常大鼠相比，糖尿病大鼠的RSK2 表達和胰島素刺激的RSK2活性顯著升高[26]。S-烯丙基半胱氨酸可以通過調節MEK1/2-ERK1/2-RSK2 信號通路發揮對鏈脲佐菌素-煙酰胺誘導的大鼠糖尿病腎病的改善作用[27]。

糖脂代謝紊亂是T2DM 發展的重要原因[28]，STAT3 是T2DM 的關鍵轉錄因子，miR-125a-5p 作為糖脂代謝的調節劑，通過靶向STAT3調控SREBP-1c和PI3k/Akt 通路來抑制肝臟脂質生成和糖異生，提高糖原合成[29-30]。LDHB 是調節SCL2a6 下游乳酸代謝的因子，控制著乳酸和丙酮酸之間的轉化，在血糖控制不良的糖尿病患者中，LDHB和PGK1的表達都是上調的[31]，SLC2a6 通過靶向LDHB 調節糖酵解，因此SLC2a6-LDHB軸可作為治療糖尿病相關肌肉萎縮的潛在靶點[32]。PFKFB3介導的糖酵解，對缺血肢體具有顯著的保護作用[33]。HIF1-PFKFB3 途徑與糖尿病胰島病理學密切相關，PFKFB3 驅動糖酵解會損害神經元的抗氧化能力，導致神經元丟失和反應性膠質細胞增生，HIF1-PFKFB3 信號通路是糖尿病視網膜病變中多種細胞類型中普遍存在的病理成分，基于該通路靶向的代謝干預點值得在糖尿病視網膜病變中進一步考慮[34-35]。RELA 也被稱為p65，是構成NF-κB 轉錄因子家族的5 種成分之一，誘導p65 NF-κB 和STAT3 的去磷酸化和脫乙酰化，能夠減少高葡萄糖引起的氧化應激，細胞凋亡，炎癥反應和上皮到間充質轉移的進展[36]，抑制p65 NF-κB在體內和體外的磷酸化，可以有效緩解db/db小鼠的腎損傷[37]。

作為資源豐富、成分多樣、藥理作用明確的民族藥物，彝族藥翻白草具有良好的開發應用前景。本研究通過網絡藥理學結合GEO 數據集探討了翻白草治療T2DM 的潛在靶點和可能作用機制，揭示翻白草是通過多成分-多靶點-多通路協同發揮作用的，從理論層面預測翻白草治療T2DM 的可能分子機制，后續將采用體內實驗進行深入研究。