不同炮制程度的酒燉和清蒸地黃性狀、成分對(duì)比研究△

姜宇，欒雅格，黃蓉，何秀娟，王璇，譚鵬,2*

1.北京中醫(yī)藥大學(xué) 中藥學(xué)院，北京 102488；

2.北京市科委 中藥生產(chǎn)過程控制與質(zhì)量評(píng)價(jià)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102400

地黃為玄參科植物地黃Rehmannia glutinosaLibosch.的新鮮或干燥塊根，是“生熟異治”的代表中藥，炮制后其藥性由寒轉(zhuǎn)溫，味由苦轉(zhuǎn)甜，功效由清轉(zhuǎn)補(bǔ)[1]。熟地黃質(zhì)厚味濃、滋膩礙脾，但酒制后主補(bǔ)陰血，并可借酒力行散，起到行藥勢(shì)、通血脈的作用[2]。經(jīng)不同炮制工藝制備的地黃炮制品具有不同的藥性及臨床作用[3-4]。

中藥炮制前后藥效變化的內(nèi)在基礎(chǔ)是化學(xué)成分的改變，外在體現(xiàn)是中藥性狀的改變。色、氣、味等性狀指標(biāo)在一定程度上能夠客觀反映中藥飲片整體質(zhì)量，但口嘗、眼看和鼻聞等傳統(tǒng)感官評(píng)價(jià)方法主觀性較強(qiáng)且未有標(biāo)準(zhǔn)參照品，無法真正指導(dǎo)熟地黃炮制生產(chǎn)和質(zhì)量檢驗(yàn)。近年來，新興的色差儀、電子舌和電子鼻等仿生技術(shù)在中藥炮制火候判別[5]、貯藏年份鑒別[6]、基原品種比較[7]等方面得到廣泛應(yīng)用。鐘戀[8]利用視覺技術(shù)、電子鼻、電子舌分析地黃炮制過程中的色、氣、味的變化規(guī)律，并通過主成分分析（PCA）、統(tǒng)計(jì)質(zhì)量控制分析（SQC）和聚類分析等方法評(píng)價(jià)地黃蒸曬5 次為火候標(biāo)準(zhǔn)的“拐點(diǎn)”。解楊等[9]發(fā)現(xiàn)，炆地黃的明度值（L*）、紅綠值（a*）、黃藍(lán)值（b*）與梓醇、5-羥甲基糠醛和還原糖具有極顯著相關(guān)性。以上研究說明熟地黃的外觀性狀與內(nèi)在成分具有一定關(guān)聯(lián)，通過仿生技術(shù)對(duì)熟地黃的整體質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)具有可行性。目前，多聚焦于單一炮制工藝熟地黃的質(zhì)量研究，缺乏對(duì)不同炮制工藝的熟地黃炮制品的整體對(duì)比研究。因此，本研究擬利用現(xiàn)代分析技術(shù)測(cè)定酒燉和清蒸2 種炮制工藝下不同炮制程度酒燉品和清蒸品中浸出物、多糖、地黃苷D 的含量，利用電子舌、測(cè)色計(jì)量化樣品的滋味和顏色并建立PCA 模型，對(duì)2 種炮制工藝下不同炮制程度的酒燉品和清蒸品進(jìn)行整體性評(píng)價(jià)，以期為熟地黃炮制工藝的完善提供參考。

1 材料

1.1 儀器

DZ25Y 型智能電燉盅（浙江蘇泊爾股份有限公司）；SKG-1601 型電磁爐（佛山艾詩凱奇電氣有限公司）；DHG-9123A 型電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；KQ-800KDE 型數(shù)控超聲波清洗器（濟(jì)南歐萊博科學(xué)儀器有限公司）；TG16KR 型高速離心機(jī)（上海繼譜電子科技有限公司）；1260型高效液相色譜儀（Agilent Technologies Inc 公司）；RE-52A 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；Epoch 型多功能微孔板酶標(biāo)儀（Bio Tek Instruments Inc 公司）；ASTREE 型電子舌（Alpha MOS 公司）；CM-5型分光測(cè)色計(jì)（柯尼卡美能達(dá)有限公司）。

1.2 試藥

黃酒（紹興吳越釀酒有限公司，干型，總糖≤15.0 g·L-1）；對(duì)照品地黃苷D（批號(hào)：B20293）、標(biāo)準(zhǔn)品D-葡萄糖（批號(hào)：B21882）均購于上海源葉生物科技有限公司；三氯甲烷（批號(hào)：20200721）、正丁醇（批號(hào)：20220915）、苯酚（批號(hào)：20190516）、濃硫酸（批號(hào)：20220208）均為分析純，均購于北京試劑有限公司；0.01 mol·L-1鹽酸（ASTREE 型電子舌專屬試劑，Alpha MOS 公司，批號(hào)：25.1900703）；甲醇、磷酸均為色譜純；無水乙醇為分析純。

生地黃購買于北京市雙橋燕京中藥飲片廠（批號(hào)：1803057，產(chǎn)地：河南，執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)：《中華人民共和國藥典》（以下簡稱《中國藥典》）2015 年版，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院劉勇教授鑒定為玄參科植物地黃Rehmannia glutinosaLibosch.的干燥塊根。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品的制備

根據(jù)《中國藥典》2020 年版熟地黃的炮制要求，參考文獻(xiàn)[10]確定炮制工藝：1）酒燉地黃（JD）：取生地黃適量，按2∶1加入黃酒，浸潤12 h，放入燉制容器內(nèi)，密閉燉至一定時(shí)間（4、8、16、24、32、40、56 h）后取出，晾曬22 h，切厚片，60 ℃干燥12 h，即得；2）清蒸地黃（QZ）：取生地黃適量，按2∶1 加水浸潤12 h，放入蒸制容器內(nèi)，蒸至一定時(shí)間（4、8、16、24、32、40、56 h）后取出，晾曬22 h，切厚片，60 ℃干燥12 h，即得。取樣品適量，打粉后過三號(hào)篩。樣品及其粗粉性狀見圖1、圖2，炮制收率見表1。

表1 不同炮制時(shí)間酒燉和清蒸熟地黃炮制收率%

圖1 不同炮制程度清蒸熟地黃成品及粉末

圖2 不同炮制程度酒燉熟地黃成品及粉末

2.2 浸出物測(cè)定

根據(jù)《中國藥典》2020 年版熟地黃項(xiàng)下規(guī)定，采用冷浸法測(cè)定樣品中水溶性浸出物的含量，測(cè)定結(jié)果見表2。

表2 不同炮制時(shí)間酒燉和清蒸熟地黃浸出物質(zhì)量分?jǐn)?shù)%

2.3 地黃苷D測(cè)定

參照《中國藥典》2020年版熟地黃項(xiàng)下地黃苷D測(cè)定方法，測(cè)定不同炮制程度的酒燉品和清蒸品中地黃苷D的含量，結(jié)果見表3。

表3 不同炮制程度酒燉和清蒸熟地黃中地黃苷D質(zhì)量分?jǐn)?shù)%

2.4 多糖含量測(cè)定

參照文獻(xiàn)[11]，分別取樣品適量，切成小塊，精密稱定，加10 倍量水回流提取2 次，每次1.5 h，合并水煎液，減壓濃縮后加無水乙醇至含醇量為80%，靜置24 h，濾過。濾渣溶解于適量蒸餾水中，采用Sevage 試劑（三氯甲烷-正丁醇=4∶1）按粗多糖溶液-Sevage 試劑=4∶1 的比例混合，置于搖床充分振搖20 min，在4 ℃下6000 r·min-1（離心半徑為14.3 cm）離心5 min，取水層繼續(xù)加入Sevage試劑，重復(fù)4 次以除去多糖蛋白。合并水層于250 mL 量瓶，加水稀釋至刻度，得到多糖母液，備用。

2.4.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取干燥至恒重的無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品10.04 mg，于100 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，制成質(zhì)量濃度為100.4 μg·mL-1的對(duì)照品溶液。

2.4.2 供試品溶液的制備 取樣品多糖母液0.1 mL于100 mL量瓶，加水稀釋至刻度，制備供試品溶液。

2.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別精密吸取對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.3、0.5、0.7、0.9 mL置于10 mL離心管中，分別加水至2.0 mL，再分別加入6%苯酚溶液1.0 mL，搖勻后迅速加入濃硫酸5.0 mL，迅速搖勻，于沸水中加熱15 min，取出冷卻至室溫。另取蒸餾水2.0 mL，同法操作制備空白對(duì)照品。利用酶標(biāo)儀測(cè)得490 nm處的吸光度（A）。以A為縱坐標(biāo)（Y），以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到回歸方程：Y=0.034 450X+0.007 851（r=0.999 2）。結(jié)果表明葡萄糖在1.255～11.295 μg·mL-1與A有良好的線性關(guān)系。

2.4.4 方法學(xué)考察

2.4.4.1 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液0.5 mL，加水至2 mL，按2.4.3 項(xiàng)下方法連續(xù)測(cè)定6 次，多糖含量的RSD為0.82%，表明儀器精密度良好。

2.4.4.2 重復(fù)性試驗(yàn) 精密移取酒燉40 h多糖母液0.1 mL 于100 mL 量瓶中，共6 份，加水稀釋至刻度，按2.4.3 項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定，多糖含量的RSD為1.03%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密移取酒燉32 h供試品溶液1 mL，按2.4.3 項(xiàng)下方法每隔30 min 測(cè)定A，至150 min，多糖含量的RSD 為1.83%，表明該樣品在150 min內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4.4 加樣回收率試驗(yàn) 精密移取酒燉32 h樣品多糖母液0.1 mL 于100 mL 量瓶，用水稀釋至刻度，平行制備6份，分別移取0.4 mL于10 mL離心管中，加入100.4 μg·mL-1的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2 mL，加水補(bǔ)至2 mL，按2.4.3 項(xiàng)下方法測(cè)定A，并計(jì)算回收率，見表4。

表4 多糖加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果分析

2.4.5 樣品測(cè)定 精密吸取供試品溶液1 mL，分別置于10 mL 離心管中，按2.4.3 項(xiàng)下方法操作，在490 nm 處測(cè)定A，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各樣品中的多糖含量。不同炮制程度的酒燉品和清蒸品中多糖含量見表5。

表5 不同炮制時(shí)間酒燉和清蒸熟地黃中多糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)（n=3）mg·g-1

2.5 顏色測(cè)定的方法與結(jié)果

2.5.1 顏色測(cè)定 待儀器穩(wěn)定，進(jìn)行零校正、白板校正后開始測(cè)定。參數(shù)設(shè)置：光源D65；照明系統(tǒng)為specular componetent excluded（SCE）反射；目標(biāo)罩30 mm。取地黃粉末3.0 g，置于測(cè)色計(jì)專用培養(yǎng)皿中進(jìn)行測(cè)定，利用Spectra Magic NX 軟件分別記錄樣品粉末顏色的L＊、a＊、b＊值，并按公式（1）計(jì)算各樣品的總色度值（E＊）。每份樣品粉末重復(fù)測(cè)定3次，取平均值。

2.5.2 測(cè)定結(jié)果 如圖3 所示，在炮制過程中清蒸品的顏色變化趨勢(shì)與酒燉品有明顯差異，酒燉熟地黃樣品顏色L*、a*和b*下降趨勢(shì)平緩，E*相差較小，隨炮制時(shí)間的延長，清蒸品的L*、a*、b*和E*值呈明顯下降而后平緩趨勢(shì)。利用SMICA 14.1 軟件以L*、a*、b*值為變量對(duì)酒燉品和清蒸品進(jìn)行PCA，載荷結(jié)果見表6。前2 個(gè)主成分的累積方差貢獻(xiàn)率為99.295%，可以解釋樣品顏色的大部分原始信息。因主成分?jǐn)?shù)量較少，所以選取前2 個(gè)主成分建模，圖4 顯示樣品之間的離散程度。所有炮制品未有重疊，說明在2 種炮制工藝炮制過程中熟地黃的顏色均發(fā)生一定變化。除酒燉4 h，其他酒燉品聚集在一起，說明在酒燉4～8 h熟地黃顏色發(fā)生明顯變化，之后炮制的酒燉品顏色相近；相較于酒燉品，清蒸品之間的離散程度較大，其中清蒸4～32 h 主要沿PC1軸明顯分開，清蒸32～56 h 主要沿PC2 軸明顯變化，由于主成分2 的方差貢獻(xiàn)率僅有2.385%，說明L*、a*、b*對(duì)炮制32 h后的清蒸品顏色影響較小，炮制過程的顏色變化主要集中在清蒸4～32 h階段。

表6 不同炮制時(shí)間酒燉和清蒸熟地黃顏色的載荷分析

圖3 酒燉和清蒸炮制過程中地黃顏色變化

圖4 不同炮制時(shí)間酒燉和清蒸熟地黃顏色的主成分得分

2.6 滋味測(cè)定的方法與結(jié)果

2.6.1 滋味測(cè)定 精密稱取地黃粉末0.5 g 于錐形瓶，加入水25 mL 靜置30 min，30 ℃超聲波輔助提取30 min，4 ℃5000 r·min-1（離心半徑為14.3 cm）離心10 min，取上清液，濾渣加水25 mL 按上述步驟重復(fù)1 次，合并上清液，轉(zhuǎn)移至50 mL 量瓶，用水稀釋至刻度，待測(cè)。每個(gè)樣品制備3 個(gè)平行。以0.01 mol·L-1鹽酸對(duì)電子舌進(jìn)行預(yù)平衡，將待測(cè)溶液倒入電子舌專用小燒杯中至刻度線進(jìn)行測(cè)定。每份樣品重復(fù)測(cè)定9 次，記錄后3 次測(cè)定傳感器響應(yīng)值。

2.6.2 測(cè)定結(jié)果 圖5可直觀顯示，酒燉和清蒸2種炮制工藝炮制過程中滋味的變化趨勢(shì)。不同炮制程度的酒燉品的甜味響應(yīng)值均大于清蒸品；苦味響應(yīng)值均小于清蒸品；酸味響應(yīng)值清蒸品呈先上升后下降再上升趨勢(shì)，但波動(dòng)范圍小，酒燉品呈先下降后上升趨勢(shì)，波動(dòng)范圍大。

圖5 酒燉和清蒸炮制過程中地黃滋味變化

將SCS、ANS（甜）、AHS、NMS 和CTS 進(jìn)行PCA，載荷結(jié)果見表7，主成分1 方差貢獻(xiàn)率為58.041%，主成分2 方差貢獻(xiàn)率為35.239%，累積方差貢獻(xiàn)率93.280%，可解釋樣品滋味的大部分原始信息。根據(jù)特征值＞1 原則，選取前2 個(gè)主成分建模，得分結(jié)果見圖6。不同炮制程度的清蒸品和酒燉品能較好分離，說明清蒸和酒燉2 種炮制工藝熟地黃的滋味具有明顯差異。

表7 不同炮制程度酒燉和清蒸熟地黃滋味的載荷分析

圖6 不同炮制程度酒燉和清蒸熟地黃滋味的PC1得分

2.7 感官指標(biāo)的協(xié)同分析

將顏色（L*、a*、b*、E*）、滋味（SCS、ANS、AHS、CTS、NMS）做PCA，由圖7 可知，酒燉品和清蒸品可明顯區(qū)分，不同炮制程度酒燉品聚集一處，離散程度較小，清蒸品中除清蒸4 h、清蒸8 h，其他樣品聚集一處。圖8 顯示，樣本與變量之間的相關(guān)性。越靠近變量的樣品在該變量中含量或響應(yīng)值越高，而在相對(duì)的變量中較低。相較于清蒸4 h與清蒸8 h，其他清蒸品及所有酒燉品的顏色值均處于較低水平，酒燉品的甜味、鮮味和酸味響應(yīng)值較高，苦味和咸味的響應(yīng)值較低，清蒸品則相反。

圖7 不同炮制程度酒燉和清蒸熟地黃滋味與顏色的協(xié)同分析

圖8 不同炮制程度酒燉和清蒸熟地黃滋味與顏色主成分Biplot圖

2.8 性狀-內(nèi)在成分相關(guān)性分析

采用雙變量相關(guān)性分析方法，運(yùn)用IBM SPSS Statistics 20 軟件中Person 系數(shù)分別對(duì)酒燉和清蒸過程中的樣品的顏 色（L*、a*、b*）、滋 味（SCS、ANS、AHS、CTS、NMS）與內(nèi)在質(zhì)量（多糖、浸出物、地黃苷D 含量）之間的相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果見表8、表9。如圖8 所示，酒燉過程中地黃苷D含量與a*、b*、E*顯著正相關(guān)（P＜0.05），多糖含量與b*呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），浸出物含量與滋味、顏色變量相關(guān)性不明顯。如表9 所示，清蒸過程中多糖含量與CTS、ANS、a*、b*和E*呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），浸出物含量與CTS、ANS、a*和b*呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），地黃苷D 與CTS、ANS、L*、a*、b*和E*呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）。顏色指數(shù)變化可以解釋JD 中有效成分的變化，滋味和顏色指數(shù)變化能夠較好解釋QZ中有效成分的變化。

表8 酒燉過程內(nèi)在質(zhì)量變化與性狀變化的相關(guān)性分析

表9 清蒸過程內(nèi)在質(zhì)量變化與性狀變化的相關(guān)性分析

3 討論

清蒸工藝中隨炮制時(shí)間的延長炮制收率不斷下降，可能由于在蒸制過程中受水蒸氣影響，地黃細(xì)胞吸水膨脹過度而導(dǎo)致細(xì)胞壁破裂[12]，水分及成分嚴(yán)重流失。酒燉工藝的炮制收率呈先增加后減少趨勢(shì)，可能是由于在密閉環(huán)境下炮制，避免了與水蒸氣的直接接觸，減輕細(xì)胞壁受損程度，減少了水分與成分的損失。

地黃苷D含量在酒燉和清蒸過程中隨炮制時(shí)間的延長均呈下降趨勢(shì)，且同一炮制程度酒燉品的地黃苷D含量低于清蒸品，這可能是由于地黃水提液的pH呈弱酸性[13]，地黃苷D結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性差，在高溫和酸性環(huán)境下易發(fā)生水解[14]，酒燉品的酸味響應(yīng)值高于清蒸品，酒燉品的地黃苷D分解速率大于清蒸品。

酒燉和清蒸炮制過程酸味響應(yīng)值整體上均呈現(xiàn)先下降后上升趨勢(shì)，可能因?yàn)榈攸S在炮制過程中發(fā)生美拉德反應(yīng)，地黃中氨基酸和蛋白質(zhì)中氨基（-NH2）與碳水化合物中羰基（-CO-）可形成氨基酸糖反應(yīng)物，而羧基（-COOH）則游離在表面[15]。

研究結(jié)果表明，酒燉工藝和清蒸工藝下地黃性狀和內(nèi)在成分變化趨勢(shì)具有一定差異，電子舌、測(cè)色計(jì)與統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法可以實(shí)現(xiàn)地黃酒燉和清蒸炮制過程中的質(zhì)量檢測(cè)。