指紋圖譜結(jié)合一測(cè)多評(píng)在中成藥丹參片質(zhì)量控制中的應(yīng)用

周亞楠，胡曉茹，戴忠，馬雙成

中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 100050

丹參片是以丹參為原料提取制得的片劑，收載于《中華人民共和國(guó)藥典》（以下簡(jiǎn)稱《中國(guó)藥典》）2020 年版（一部），主要用于治療冠心病、心絞痛等疾病[1]。丹參是唇形科鼠尾草屬植物丹參Salvia miltiorrhizaBge.的干燥根及根莖，具有活血祛瘀、通經(jīng)止痛、清心除煩等功效。研究表明，丹參主要含水溶性和脂溶性兩類成分，這兩類成分具有抗氧化、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗血小板聚集、抗凝血等藥理作用，均為丹參的主要活性成分[2-5]。其中，水溶性成分主要為酚酸類成分，如丹酚酸B、丹參素等；脂溶性成分大多為共軛醌、酮類成分，如丹參酮ⅡA、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ等。

中藥成分復(fù)雜，單一成分難以評(píng)價(jià)中藥整體質(zhì)量，中藥指紋圖譜及多指標(biāo)成分定量的方法是現(xiàn)在常用的中藥質(zhì)量控制模式[6-7]。中藥指紋圖譜體現(xiàn)中藥的整體性，提供中藥中多成分整體信息，多用于中藥的整體質(zhì)量評(píng)價(jià)。多指標(biāo)成分含量測(cè)定是中藥質(zhì)量評(píng)價(jià)的另一種方式，常規(guī)的含量測(cè)定方法常出現(xiàn)對(duì)照品難以獲得的不足，一測(cè)多評(píng)法（QAMS）是以樣品中某一組分（對(duì)照品易獲得且穩(wěn)定）為參照物，通過(guò)相對(duì)校正因子計(jì)算其他組分的含量，其可以彌補(bǔ)多組分同時(shí)測(cè)定時(shí)對(duì)照品難以獲得、制備成本高、不穩(wěn)定等不足。因此，指紋圖譜與QAMS相結(jié)合可以全方位評(píng)價(jià)中藥質(zhì)量，已經(jīng)成為中藥質(zhì)量控制的趨勢(shì)[8-15]。

《中國(guó)藥典》2020 年版（一部）以水溶性成分丹酚酸B 控制丹參片的質(zhì)量，并未收載脂溶性成分的測(cè)定方法[16]，質(zhì)量控制指標(biāo)不完整，難以全面準(zhǔn)確反映丹參片的質(zhì)量。本研究采用QAMS，以丹參酮ⅡA為參照物同時(shí)測(cè)定丹參片中丹參酮ⅡA、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ的含量，并結(jié)合指紋圖譜全面、科學(xué)地評(píng)價(jià)丹參片的質(zhì)量，為丹參片的質(zhì)量控制提供良好的技術(shù)手段，同時(shí)為丹參片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器

E2695 型高效液相色譜儀（Waters 公司）；1260型高效液相色譜儀（Agilent公司）；KQ-300DA 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；XPE105型十萬(wàn)分之一電子分析天平（Mettler-Toledo公司）。

1.2 試藥

對(duì)照品丹參酮ⅡA（批號(hào)：110766-201721，純度：99.5%）、隱丹參酮（批號(hào)：110852-201807，純度：99.0%）、丹參酮Ⅰ（批號(hào)：110867-201607，純度：98.0%）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈為色譜純；水為超純水；磷酸為分析純。

丹參片編號(hào)為S1～S3（A 廠家，批號(hào)分別為170934、170935、170936）；丹參片編號(hào)為S4～S6（B 廠家，批號(hào)分別為180101、180401、180402）；丹參片編號(hào)為S7～S12（C 廠家，批號(hào)分別為180405、180406、180407、180408、180501、180502）。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

混合對(duì)照品溶液的制備：分別取丹參酮ⅡA、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ對(duì)照品約10、15、10 mg，精密稱定，分別置于50、50、100 mL 棕色量瓶中，加入甲醇適量，超聲使溶解（300 W，50 kHz），并定容至刻度，搖勻，即得對(duì)照品儲(chǔ)備液。取丹參酮ⅡA、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ對(duì)照品儲(chǔ)備液各5 mL，置于同一50 mL 棕色量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，即得。

供試品溶液的制備：取丹參片20 片，除去糖衣，研細(xì)，取約0.8 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理20 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2 色譜條件

CAPCELL PAK C18 MG Ⅱ色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以乙腈（A）-0.02%磷酸水溶液（B）為流動(dòng)相梯度洗脫（0～6.0 min，61%A；6.0～20.0 min，61%～90%A；20.0～20.5 min，90%～61%A；20.5～25.0 min，61%A）；檢測(cè)波長(zhǎng)：270 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

2.3 指紋圖譜研究

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液（S7）按2.2 項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，以丹參酮ⅡA為參照峰，測(cè)定各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積。結(jié)果顯示，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積的RSD均小于3.0%，儀器精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批丹參片（S7）按2.1項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，以丹參酮ⅡA為參照峰，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積的RSD均小于3.0%，表明方法重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液（S7）分別在0、2、4、6、8、10、12、24、36、48 h連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定，以丹參酮ⅡA為參照峰，各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間及相對(duì)峰面積的RSD 均小于3.0%，表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.4 指紋圖譜的建立、共有峰指認(rèn)及相似度評(píng)價(jià) 按2.2 項(xiàng)下色譜條件對(duì)12 批丹參片供試品溶液進(jìn)行測(cè)定，比較各批供試品的色譜圖，共標(biāo)定5 個(gè)共有峰。以乙腈-0.02%甲酸為流動(dòng)相，采用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）正離子模式掃描對(duì)未知峰進(jìn)行確認(rèn)，峰1的母離子m/z為279.103 8，碎片離子m/z為261、251、233、205、169，最大吸收波長(zhǎng)為242、290 nm，峰2的母離子m/z為338.974 5，碎片離子m/z為279、261、233，最大吸收波長(zhǎng)為224、272 nm，經(jīng)文獻(xiàn)對(duì)比確認(rèn)峰1、峰2分別為二氫丹參酮Ⅰ、丹參酸甲酯[17-20]。峰3 的母離子為297.128 7，最大吸收波長(zhǎng)為219、263 nm，峰4 的母離子m/z為277.150 0，最大紫外吸收為244 nm，峰5 的母離子m/z為295.111 9，最大吸收波長(zhǎng)為224、269 nm，經(jīng)對(duì)照品比對(duì)、質(zhì)譜及紫外確認(rèn)，峰3、峰4、峰5 分別為隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA。

采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”（2012 版）對(duì)12 批丹參片的指紋圖譜進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，以S1 為參照譜圖，選定5 個(gè)特征峰進(jìn)行多點(diǎn)校正，全譜峰匹配。匹配后的12 批樣品圖譜見(jiàn)圖1，平均數(shù)法生成對(duì)照?qǐng)D譜（圖2）。12 批丹參片的相似度分別為0.997、0.996、0.996、0.998、0.997、0.996、1.000、1.000、0.999、1.000、1.000、1.000，結(jié)果顯示12 批樣品的圖譜與對(duì)照指紋圖譜相似度較高，表明12 批丹參片的脂溶性化學(xué)成分一致性較好。

圖1 各批次丹參片的疊加色譜圖

圖2 丹參片對(duì)照指紋圖譜

2.4 QAMS研究

隱丹參酮、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA是丹參片中主要脂溶性成分，也是主要活性成分。本研究采用QAMS，以丹參酮ⅡA為對(duì)照同時(shí)測(cè)定隱丹參酮、丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA的含量，提高丹參片的質(zhì)量控制水平。

2.4.1 專屬性 取供試品溶液、混合對(duì)照品溶液及空白溶劑，按2.2 項(xiàng)下色譜條件分析，結(jié)果見(jiàn)圖3。隱丹參酮、丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA分離良好，空白溶劑在3 個(gè)成分保留時(shí)間處無(wú)色譜峰干擾，供試品中出現(xiàn)與對(duì)照品溶液中一致的色譜峰，表明本法專屬性良好。

圖3 空白溶劑、對(duì)照品及丹參片供試品色譜圖

2.4.2 線性關(guān)系考察 逐級(jí)稀釋對(duì)照品儲(chǔ)備液1～100 倍，得到7 個(gè)不同質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液，按2.2 項(xiàng)下色譜條件分析，以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 丹參片中3個(gè)成分的線性關(guān)系結(jié)果

2.4.3 精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液（S7）連續(xù)進(jìn)樣6 次，結(jié)果丹參酮ⅡA、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ峰面積的RSD 分別為0.17%、0.20%、0.37%，表明儀器精密度良好。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批丹參片（S7）平行制備6份供試品溶液，進(jìn)行HPLC分析，計(jì)算丹參酮ⅡA、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ的含量。結(jié)果丹參酮ⅡA、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ含量的RSD 分別為1.64%、1.25%、2.46%，表明方法重復(fù)性良好。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液（S7）及混合對(duì)照溶液分別在0、2、4、6、8、10、12、24、36、48 h 連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定，供試品溶液中丹參酮ⅡA、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ峰面積的RSD 分別為0.53%、0.87%、0.61%，對(duì)照品溶液中丹參酮ⅡA、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ峰面積的RSD 分別為0.39%、0.44%、0.53%，表明對(duì)照品及供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.6 回收率試驗(yàn) 取丹參片（S7）粉末9 份，各約0.4 g，精密稱定，平均分為3 組，每組分別精密加入丹參酮ⅡA對(duì)照品儲(chǔ)備液1、2、3 mL，隱丹參酮對(duì)照品儲(chǔ)備液1、2、3 mL，丹參酮Ⅰ對(duì)照品儲(chǔ)備液1、3、5 mL，按2.1項(xiàng)下方法制備，進(jìn)樣分析后，計(jì)算平均加樣回收率，丹參酮ⅡA、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ的平均回收率分別為101.27%、99.56%、101.49%，RSD 分別為0.80%、0.76%、1.22%，表明方法準(zhǔn)確性良好。

2.4.7 相對(duì)校正因子的計(jì)算 常用的相對(duì)校正因子計(jì)算方法有多點(diǎn)校正法、斜率校正法和定量因子校正法[21]。取2.4.2項(xiàng)下溶液，按2.2項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，采用斜率校正法計(jì)算隱丹參酮、丹參酮Ⅰ相對(duì)丹參酮ⅡA的校正因子分別為1.16、1.37。儀器、色譜柱、流速等的微小改變會(huì)影響相對(duì)校正因子的大小。因此，分別選擇了2 個(gè)品牌儀器（Waters E2695 型、Agilent 1260 型）、3 根色譜柱（CAPCELL PAK C18MG Ⅱ、Kromasil 100-5-C18、COSMOSIL Packed Column 5C18-MS-Ⅱ，規(guī)格均為250 mm×4.6 mm，5 μm），同時(shí)改變流速，考察其對(duì)待測(cè)成分相對(duì)校正因子測(cè)定的影響，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同儀器、不同色譜柱和不同流速條件下丹參片中主要成分的相對(duì)校正因子

2.4.8 待測(cè)成分色譜峰定位 本研究將待測(cè)成分光譜信息與相對(duì)保留值相結(jié)合對(duì)各成分色譜峰進(jìn)行準(zhǔn)確定位。隱丹參酮的最大吸收波長(zhǎng)為219、263 nm，丹參酮Ⅰ的最大吸收波長(zhǎng)為244 nm，改變儀器、色譜柱、流速后，隱丹參酮、丹參酮Ⅰ的相對(duì)保留時(shí)間見(jiàn)表3，各待測(cè)成分相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于3%。

表3 不同儀器、不同色譜柱和不同流速條件下丹參片中主要成分的相對(duì)保留時(shí)間

2.4.9 樣品測(cè)定 按2.1、2.2項(xiàng)下方法分析不同批次的丹參片，采用對(duì)照品外標(biāo)法和QAMS 計(jì)算丹參酮ⅡA、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ的含量及其總含量（表4），對(duì)照品外標(biāo)法和QAMS 對(duì)丹參片定量測(cè)定結(jié)果基本一致。

表4 丹參片中各成分的QAMS與外標(biāo)法測(cè)定結(jié)果mg/片

3 討論

本研究采用中藥指紋圖譜獲得丹參片脂溶性成分的整體信息，采用QAMS以丹參酮ⅡA為參照物測(cè)定丹參片中脂溶性成分丹參酮ⅡA、隱丹參酮、丹參酮Ⅰ的含量，中藥指紋圖譜結(jié)合QAMS 可以很好地實(shí)現(xiàn)整體評(píng)價(jià)制劑的質(zhì)量。

QAMS 常用的指標(biāo)成分色譜峰定位方法有相對(duì)保留值和保留時(shí)間差[21-22]，《中國(guó)藥典》 2020年版丹參藥材項(xiàng)下以丹參酮ⅡA為參照，采用相對(duì)保留值法確定丹參酮Ⅰ、隱丹參酮的色譜峰，從而測(cè)定丹參酮ⅡA、丹參酮Ⅰ、隱丹參酮的含量。但實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)隱丹參酮與丹參酮Ⅰ在不同色譜柱上的目標(biāo)峰的相對(duì)位置有時(shí)會(huì)互換，如ZORBAX SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱上丹參酮Ⅰ先于隱丹參酮出峰，CAPCELL PAK C18MG Ⅱ（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Kromasil 100-5-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）等色譜柱上隱丹參酮先于丹參酮Ⅰ出峰。因此，僅根據(jù)相對(duì)保留值和保留時(shí)間差對(duì)指標(biāo)成分色譜峰定位有時(shí)會(huì)出現(xiàn)問(wèn)題。增加供試品的典型色譜圖，規(guī)定相對(duì)保留時(shí)間，同時(shí)，利用丹參酮Ⅰ、隱丹參酮2 種成分最大紫外吸收波長(zhǎng)不同（丹參酮Ⅰ：244 nm，隱丹參酮：219、263 nm）可確定各成分的色譜峰位置，實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)峰定位，有效果補(bǔ)充了QAMS 中指標(biāo)成分色譜峰定位的不足。

丹參酮ⅡA具有光不穩(wěn)定性及熱不穩(wěn)定性[23-24]，本研究采用超聲提取法作為丹參片中脂溶性成分的提取方法，高效、快速，避免了光照、高溫使丹參酮ⅡA轉(zhuǎn)化分解造成的誤差。同時(shí)，考察了提取溶劑（水、25%、50%、75%甲醇、純甲醇）、提取時(shí)間（10、20、30、40 min）等主要因素的影響，最終確定樣品提取條件為50 mL甲醇超聲處理20 min。

本研究提出并建立了指紋圖譜結(jié)合QAMS 全面評(píng)價(jià)丹參片中脂溶性化學(xué)成分的方法，具有靈敏度強(qiáng)、準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好、穩(wěn)定性好的特點(diǎn)，可為丹參片的質(zhì)量控制提供參考。