黑果腺肋花楸花青素理化性質及抗氧化活性研究

楊俊峰,沈越,張耀丹,張卉

(沈陽化工大學 制藥與生物工程學院,沈陽 110142)

黑果腺肋花楸(Aroniamelanocarpa)屬于薔薇科腺肋花楸屬植物[1]。其果實中富含黃酮類成分,主要以花青素、原花青素及其衍生物為主[2—3]。陳彤垚等[4]研究發現,黑果腺肋花楸果實總花青素含量約為(0.35～15.96) mg/g FW,(12.65～23.31) mg/g DW,高于藍莓等水果?；ㄇ嗨爻勺鳛槭秤蒙貞糜谑称奉I域外,近年來因發現其保護心血管系統、抗衰老和抗癌等生物活性而具有在醫藥、化妝品等領域廣泛應用的潛力[5—7]。

目前,黑果腺肋花楸花青素在食品行業主要用于制作果酒、果汁等產品,Gironés-Vilaplana等[8]研究發現將檸檬汁和黑果腺肋花楸果汁混合,在很大程度上保留了花青素含量并使其抗氧化性增強,改善了其風味。Witkowska等[9]對黑果腺肋花楸果酒的成分進行分析,其中總抗氧化能力為34.0 mmol/L,總花青素含量最高為1.39 g/L,總酚含量最高為4.10 g/L,表明黑果腺肋花楸果酒具有較高的營養價值。但是因花青素的穩定性較差,其應用還需進行穩定性及抗氧化活性等方面的深入研究。

近年來,Drózdz等[10]研究了酸性條件(pH 2.0～6.0)下紅薯花青素的穩定性,結果表明在強酸性(pH 2.0～4.0)條件下比pH 5.0～6.0條件下更穩定;孫倩怡等[11]的研究顯示,藍莓花青素在避光、低溫條件下較穩定,當溫度高于60 ℃時,共價鍵發生破壞,從而導致花青素含量降低。劉軍波等[12]研究了黑果腺肋花楸花青素的穩定性,其結果表明在溫度低于50 ℃、避光條件下,當pH值小于4時該花青素的穩定性較好,其中Fe3+、Al3+對該花青素穩定性的影響較大。迄今,關于黑果腺肋花楸花青素穩定性等理化性質及生物活性的研究仍然不夠系統。因此,全面探究光照、pH、溫度、金屬離子、常用食品添加劑等對黑果腺肋花楸花青素穩定性的影響,以及進行該色素抗氧化活性的深入研究,將為黑果腺肋花楸深加工產品的開發和資源化利用提供理論基礎和應用路徑。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及儀器

1.1.1 實驗材料

蔗糖、抗壞血酸、氯化鈣、氯化鈉、氯化鎂、硫酸亞鐵、過硫酸鉀、水楊酸、鐵氰化鉀、無水乙醇(均為分析純):天津市恒興化學試劑制造有限公司;硫酸銅、氯化鐵(均為分析純):河南萬邦化工科技有限公司;檸檬酸(分析純):天津永大化學試劑制造有限公司;山梨酸鉀(分析純):寧波王龍科技股份有限公司;苯甲酸鈉(分析純):天津東大化工集團有限公司;葡萄糖(分析純):天津大茂化學試劑廠;2,2′-聯氮雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、2,2-聯苯基-1-苦基肼基(DPPH)、雙氧水(均為分析純):上海麥克林生化科技股份有限公司。

1.1.2 實驗儀器

BS-124S分析天平 賽多利斯儀器有限公司;PHS-300 pH計 上海天達儀器有限公司;SCIENTZ-Ⅱ型超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司;HZP-150全溫振蕩培養箱 上海陽光實驗儀器有限公司;HHS-S電子恒溫水浴鍋 上?？德穬x器設備有限公司;H1650離心機 湘儀離心機儀器有限公司;RE52CS旋轉蒸發儀 上海亞榮儀器有限公司;FD-1C-50真空冷凍干燥機 上海喬越電子有限公司;Spark 20M Tecan酶標儀 勒菲生物科技(上海)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 黑果腺肋花楸花青素制備

黑果腺肋花楸果實經洗凈、勻漿;果漿與體積分數為40%的酸化甲醇按照料液比1∶5比例混勻,50 ℃恒溫振蕩1.2 h后抽濾,得到色素溶液,再將該溶液在真空度-0.09 MPa、50 ℃條件下旋蒸得到花青素粗提液。

1.2.2 黑果腺肋花楸花青素純化

將花青素粗提液加入經預處理的HPD-100大孔樹脂柱中,當花青素充分吸附在樹脂上后,加入蒸餾水沖洗樹脂柱,除去花青素粗提液中的蛋白質、多糖等雜質。除雜后,將體積分數60%的乙醇溶液加入到樹脂柱中進行洗脫,收集洗脫流分,50 ℃下旋蒸得到花青素純化液,冷凍干燥后得到花青素純化產物。

1.2.3 黑果腺肋花楸花青素理化性質

1.2.3.1 黑果腺肋花楸花青素溶解性

取蒸餾水、無水乙醇、乙酸乙酯、四氫呋喃、丙酮、氯仿、石油醚各5 mL,分別加入經純化的花青素0.05 g,避光靜置30 min,觀察溶解情況。

1.2.3.2 光照對黑果腺肋花楸花青素穩定性的影響

配制1 mg/mL花青素純化產物水溶液,根據參考文獻[13]所述方法進行測定,以避光作為對照,計算花青素保留率。

1.2.3.3 溫度對黑果腺肋花楸花青素穩定性的影響

同1.2.3.2方法配制花青素水溶液,分別放置在10,20,40,60,80,100 ℃中,在0,1,2,3,4,5 h測定吸光度,每組重復3次,以室溫作為對照,計算花青素保留率[14]。

1.2.3.4 pH值對黑果腺肋花楸花青素穩定性的影響

同1.2.3.2方法配制花青素水溶液,分別取10 mL加入到14支試管中,將pH調至1～14。避光靜置30 min,測定吸光度,每組重復3次,計算保留率[15],并觀察顏色變化。

1.2.3.5 金屬離子對黑果腺肋花楸花青素穩定性的影響

同1.2.3.2方法配制花青素水溶液,分別取10 mL上述水溶液,加入0.1 mol/L Mg2+、Cu2+、Ca2+、K+、Fe3+、Na+各0.3 mL,其中以去離子水作為對照,避光靜置,在0,1,2,3,4,5 h測定吸光度,每組重復3次,計算花青素保留率[16]。

1.2.3.6 氧化劑、還原劑對黑果腺肋花楸花青素穩定性的影響

同1.2.3.2方法配制花青素水溶液,配制2%、4%、6%、8%、10% H2O2和2,4,6,8,10 g/L Na2SO3,各取1 mL分別加入到10 mL上述水溶液中,根據參考文獻[17]所述方法進行測定。每組重復3次,以去離子水作為空白對照,計算花青素保留率。

1.2.3.7 食品添加劑對花青素穩定性的影響

同1.2.3.2方法配制花青素水溶液,取10 mL上述水溶液分別加入蔗糖、葡萄糖、抗壞血酸、檸檬酸、山梨酸鉀、苯甲酸鈉,所加入的添加劑按照GB 2760—2014[18]《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》配制成最大使用濃度,根據參考文獻[19]所述方法進行測定,以去離子水作為空白對照,計算花青素保留率。

1.2.4 黑果腺肋花楸花青素抗氧化能力測定

1.2.4.1 DPPH自由基清除率測定

配制濃度為0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0 mg/mL的花青素水溶液,根據參考文獻[20]所述方法進行測定,以抗壞血酸為陽性對照,每個濃度重復3次。

1.2.4.2 ABTS自由基清除率測定

同1.2.4.1方法配制花青素水溶液,根據參考文獻[21]所述方法進行測定,以抗壞血酸作為陽性對照,每個濃度重復3次。

1.2.4.3 羥基自由基清除率測定

同1.2.4.1方法配制花青素水溶液,根據參考文獻[20]所述方法進行測定,以抗壞血酸作為陽性對照,每個濃度重復3次。

1.2.4.4 總還原力測定

同1.2.4.1方法配制花青素水溶液,根據參考文獻[21]所述方法進行測定,以抗壞血酸作為陽性對照,每個濃度重復3次。

1.3 數據統計與分析

結果以平均值±標準差(x±s)表示,利用IBM SPSS Statistics 26進行數據處理。

2 結果與分析

2.1 黑果腺肋花楸花青素溶解性

由表1可知,黑果腺肋花楸花青素易溶于水、無水乙醇、四氫呋喃,微溶于乙酸乙酯、丙酮、氯仿,不溶于石油醚,即其為水溶性色素。

表1 黑果腺肋花楸花青素在不同溶劑中的溶解性及顏色變化Table 1 Solubility and color change of Aronia melanocarpa anthocyanins in different solvents

2.2 黑果腺肋花楸花青素穩定性分析

2.2.1 光照對黑果腺肋花楸花青素穩定性的影響

由圖1可知,隨著光照時間增加,黑果腺肋花楸花青素的保留率均有所下降。在5 h時,花青素保留率從高到底依次是避光(92.2%)、室內自然光(83.3%)、室外自然光(78.7%)。長時間光照會誘導花青素碳骨架結構改變,導致花色苷被降解,花青素含量降低[22],因此,在貯存或使用過程中應避免花青素長時間暴露在光照環境中。

圖1 光照對黑果腺肋花楸花青素穩定性的影響Fig.1 Effect of light on the stability of Aronia melanocarpa anthocyanins

2.2.2 溫度對黑果腺肋花楸花青素穩定性的影響

由圖2可知,溫度越高,花青素保留率越低,在10 ℃條件下,花青素較穩定,5 h后保留率在85%以上;在20～40 ℃條件下,5 h后花青素保留率均在85%。當溫度升高到60～80 ℃,5 h后花青素保留率下降到80%以下,穩定性較差。當溫度升高到100 ℃時,花青素保留率大幅度下降,5 h后保留率僅剩35%。相關研究表明[23],當溫度超過50 ℃時,花青素降解速率加快,促使紅色的黃烊鹽陽離子向無色的假堿或查爾酮方向轉化,從而造成花青素降解、褪色。綜上所述,花青素應低溫保存。

圖2 溫度對黑果腺肋花楸花青素穩定性的影響Fig.2 Effect of temperatures on the stability ofAronia melanocarpa anthocyanins

2.2.3 pH值對黑果腺肋花楸花青素穩定性的影響

由圖3可知,在酸性條件下,花青素pH值為1～3時,隨著pH值增大,吸光度緩慢增大;在pH值為3時吸光度達到最大值,此時試管溶液呈紅色;當pH值為3～4時,吸光度快速下降;當pH值大于4時,隨著pH值的增大,吸光度下降趨于平緩,溶液顏色逐漸變淺。在堿性條件下,當pH值大于8時,溶液顏色變為藍紫色,且隨pH值增大溶液顏色逐漸加深;而在pH值大于11后吸光度稍有回升,溶液顏色由深綠色逐漸變成深棕色。這是由于花青素在不同的酸堿條件下,結構異構化反應發生改變,導致穩定性和顏色發生改變[24—25]。實驗表明,黑果腺肋花楸花青素在pH值小于3時相對比較穩定。

圖3 pH值對黑果腺肋花楸花青素穩定性的影響Fig.3 Effect of pH values on the stability of Aronia melanocarpa anthocyanins

2.2.4 金屬離子對黑果腺肋花楸花青素穩定性的影響

由圖4可知,添加Mg2+、Na+、Ca2+、K+的花青素水溶液,5 h后保留率分別為75.1%、77.2%、76.9%、75.4%;添加Fe3+的花青素水溶液呈現深紫色,添加Cu2+的花青素水溶液出現沉淀,5 h后保留率分別為71.9%、70.0%。其原因可能是花青素分子結構中存在一個以上自由的羥基時,易與金屬離子發生絡合,Fe3+破壞了花青素結構中的酚羥基,而Cu2+催化花青素結構上的酚羥基發生氧化反應,從而產生變化[26—27]。結果表明,添加Mg2+、Na+、Ca2+、K+對花青素穩定性的影響較小,而添加Fe3+、Cu2+對花青素穩定性的影響較大,故該花青素應避免與鐵制品、銅制品接觸。

圖4 金屬離子對黑果腺肋花楸花青素穩定性的影響Fig.4 Effect of metal ions on the stability of Aronia melanocarpa anthocyanins

2.2.5 氧化劑、還原劑對黑果腺肋花楸花青素穩定性的影響

由圖5可知,隨著H2O2濃度的升高,黑果腺肋花楸花青素保留率下降,當加入體積分數2% H2O2后,花青素保留率下降至40%。隨著還原劑Na2SO3濃度升高,花青素保留率下降,但下降程度相對于H2O2低。相較于H2O2,花青素對Na2SO3稍具有耐受能力。這可能是因為氧化劑與還原劑能夠親核攻擊花青素的C位,致使花青素開環生成查爾酮,發生降解[28]。姚思敏薔等[29]研究發現,氧化劑H2O2能破壞黑果枸杞中的花青素并使花青素水溶液褪色,這與本實驗結果基本一致。因此,黑果腺肋花楸花青素應該避免接觸氧化劑、還原劑。

圖5 氧化劑H2O2和還原劑Na2SO3對黑果腺肋花楸花青素穩定性的影響Fig.5 Effect of oxidant H2O2 and reducing agent Na2SO3 on the stability of Aronia melanocarpa anthocyanins

2.2.6 食品添加劑對黑果腺肋花楸花青素穩定性的影響

由圖6可知,在相同濃度的抗壞血酸和檸檬酸條件下,抗壞血酸對黑果腺肋花楸花青素穩定性的影響明顯低于檸檬酸;在0～5 h添加山梨酸鉀的花青素保留率下降較小,而添加苯甲酸鈉的花青素保留率下降較大,山梨酸鉀對黑果腺肋花楸花青素穩定性的影響明顯低于苯甲酸鈉;蔗糖與葡萄糖相比,蔗糖對花青素穩定性的影響較小。結果表明,上述食品添加劑對黑果腺肋花楸花青素穩定性均有影響,應加入護色劑提高其花青素保留率。

圖6 食品添加劑對黑果腺肋花楸花青素穩定性的影響Fig.6 Effect of food additives on the stability of Aronia melanocarpa anthocyanins

2.3 黑果腺肋花楸花青素抗氧化活性測定

2.3.1 DPPH自由基清除率

由圖7可知,黑果腺肋花楸花青素和抗壞血酸清除自由基能力均隨著花青素濃度的增大而增大,當花青素濃度在1.0 mg/mL時,花青素清除率為94.6%,IC50值為0.398 mg/mL,略低于抗壞血酸(IC50值為0.414 mg/mL)。

圖7 黑果腺肋花楸花青素對DPPH自由基清除率的影響Fig.7 Effect of Aronia melanocarpa anthocyanins on the scavenging rate of DPPH radicals

2.3.2 ABTS自由基清除率

由圖8可知,黑果腺肋花楸花青素和抗壞血酸對ABTS自由基的清除率均隨著花青素濃度的增大而增大,當花青素濃度在1.0 mg/mL時,ABTS自由基清除率為39.1%,IC50值為0.628 mg/mL,低于抗壞血酸(IC50值為0.832 mg/mL)。

圖8 黑果腺肋花楸花青素對ABTS自由基清除率的影響Fig.8 Effect of Aronia melanocarpa anthocyanins on the scavenging rate of ABTS radicals

2.3.3 羥基自由基清除率

由圖9可知,黑果腺肋花楸花青素對羥基自由基的清除率隨著花青素濃度的增大而增大,當花青素濃度為1.0 mg/mL處,花青素羥基自由基清除率為31.9%,IC50值為0.718 mg/mL。表明花青素與抗壞血酸(IC50值為0.907 mg/mL)相比其清除羥基自由基的活性相對較弱。

圖9 黑果腺肋花楸花青素對羥基自由基清除率的影響Fig.9 Effect of Aronia melanocarpa anthocyanins on the scavenging rate of hydroxyl radicals

2.3.4 總還原力的測定

鐵離子還原能力作為抗氧化性能的一個重要指標,可反映抗氧化劑還原能力的大小,樣品對鐵離子的還原力越強,其抗氧化能力越強[30]。

由圖10可知,隨著濃度增大,黑果腺肋花楸花青素和抗壞血酸的總還原力增大,且呈一定正相關。黑果腺肋花楸花青素與抗壞血酸相比總還原力相對較弱,當花青素濃度在1.0 mg/mL時,花青素總還原力為28.6%。

圖10 黑果腺肋花楸花青素總還原力測定Fig.10 Determination of total reducing capacity of Aronia melanocarpa anthocyanins

3 結論

黑果腺肋花楸花青素易溶于水、無水乙醇與四氫呋喃,在溫度低于60 ℃、避光條件下穩定性更好;在pH值小于4時,花青素水溶液的穩定性較好,溶液呈紅色。隨著pH值增大,花青素水溶液顏色發生改變,依次為藍紫色、深綠色、深棕色;食品添加劑蔗糖、葡萄糖、抗壞血酸、檸檬酸、山梨酸鉀、苯甲酸鈉均影響花青素的穩定性,其中防腐劑山梨酸鉀和抗氧化劑抗壞血酸對花青素穩定性的影響較小;金屬離子Mg2+、Na+、Ca2+、K+對花青素穩定性的影響較小,金屬離子Fe3+、Cu2+對花青素穩定性的影響較大;該花青素對DPPH、ABTS、羥基自由基均具有清除能力,總還原力隨其濃度的增大而增強。綜上所述,黑果腺肋花楸花青素在醫藥、功能食品方面具有良好的應用前景。