不同來源硒對山羊血液及睪丸抗氧化酶活性的影響

楊茹潔

（1.山西省畜牧獸醫(yī)學校，山西太原 030024；2.山西農業(yè)大學，山西晉中 030801）

谷胱甘肽過氧化物酶（Glutathione peroxidase，GSH-Px）是生物體內重要的含硒酶，是生物體內抗氧化防御體系的重要組成之一，能夠有效的清除體內新陳代謝所產(chǎn)生的氧自由基，防止生物大分子發(fā)生氧化應激反應，保護細胞膜的結構和功能，維持組織內的氧代謝平衡。分子生物學和遺傳學的研究表明，GSH-Px 活性降低，可以導致組織細胞抗氧化損傷能力減弱，直接影響細胞的分裂、繁殖、遺傳及生長，進而干擾核酸、蛋白質、粘多糖及酶的合成及代謝，引發(fā)多種疾病[1]。GSH-Px 還能防止精子在生長過程中的突變。GSH-Px 也是反映機體硒水平的重要指標。胡彩虹[2]報道，添加0.01～0.30μmol/L 的不同水平的蛋氨酸硒和納米硒（以硒計），能顯著提高雞肝細胞中GSH-Px 的活性。姚元枝等[3]報道日糧添加硒0.1～0.3mg/kg 時，能顯著提高全血中GSH-Px 活性。關于硒對山羊GSH-Px 的活性影響的報道甚少。

因此，本試驗通過在羊日糧中添加蛋氨酸硒和納米硒，研究不同來源硒對波爾山羊公羔血液及組織器官內抗氧化酶活性的影響，以期在實際生產(chǎn)上為應用硒提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

納米硒：上海四通納米科技有限公司，濃度184mg/kg，粒徑20～60nm，平均粒徑36nm。

蛋氨酸硒（美特硒）：浙江建德維豐飼料有限公司饋贈，濃度1500mg/kg，分子式：C20H43N4O8S4Se，分子量675。

1.2 試驗設計和飼養(yǎng)管理

本試驗選用山西太行山腹地貧硒地區(qū)黎城種羊場80 只體重相近、體格健壯的種用2 月齡斷奶的波爾山羊公羔。公羔隨機分為5 組，每組16只羊。預試2 周，正試16 周，分別飼喂基礎日糧（對照組）；基礎日糧+0.1mg/kg 蛋氨酸硒（蛋氨酸硒I 組）；基礎日糧+0.3mg/kg 蛋氨酸硒（蛋氨酸硒II 組）；基礎日糧+0.1mg/kg 納米硒（納米硒I 組）；基礎日糧+0.3mg/kg 納米硒（納米硒II 組），添加量以硒濃度計算。基礎日糧組成及營養(yǎng)水平見表1。試驗羊只進行驅蟲和常規(guī)免疫。各組供試公羔采用舍飼高架飼養(yǎng)，在整個試驗期每日每只公羔定量供給700g 飼料，實際干物質量580g，分別在早7:00 和晚19:00 分兩次等量飼喂，精料在飼喂干草前30min 飼喂，自由飲水。

表1 基礎日糧配方與主要營養(yǎng)成分

1.3 樣品采集

每個試驗組每隔4 周隨機選取3 只公羔頸靜脈采血10mL，加肝素鈉抗凝，冷凍于-20℃，另取5mL 血 液37℃水 浴1h，3000r/min 離 心15min，分離血清保存于離心管中，-20℃保存待測。每個試驗處理每隔4 周隨機去勢3 只公羔，取出雙側睪丸用生理鹽水沖洗3～5 次，去除血漬及脂肪，剝離表面白膜及附睪，迅速將左側睪丸切塊后置于-70℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 檢測的項目及方法

1.4.1 全血、血清、睪丸組織中GSH-Px 活性的測定

谷胱甘肽過氧化物酶活性測定采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒，GSH-Px 的測定測定原理為：GSH-Px 可以促進過氧化氫與還原型谷胱甘肽反應生成H2O 及氧化型谷胱甘肽，GSH-Px的活力可用其酶促反應的速度來表示，測定其酶促反應中還原型谷胱甘肽的消耗，則可求出酶的活力。由于反應物在沒有GSH-Px 的條件下也能進行非酶促的氧化還原反應，因此在實驗中設定了非酶管的反應，在計算酶活力時用來扣除非酶促反應所引起的GSH 減少的部分。根據(jù)試劑盒說明書配制試劑，進行酶管與非酶管的酶促反應與顯色反應，最后用UV-2100 型紫外-可見分光光度計在412nm 處測定各管的OD 值。根據(jù)說明書提供的方法來計算GSH-Px 活力，見式（1）：

1.4.2 血清中超氧化物歧化酶及丙二醛的檢測

采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒，超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）的測定測定原理為：通過黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應系統(tǒng)產(chǎn)生超氧陰離子（O2-），后者氧化羥胺形成亞硝酸鹽，在顯色劑的作用下呈現(xiàn)紫紅色，用可見光分光光度計測定其吸光度。當被測樣品中含SOD 時，則對超氧陰離子自由基有專一性的抑制作用，使形成的亞硝酸鹽減少，比色時測定管的吸光度值低于對照管的吸光度值，通過公式計算可以求出被測樣品中的SOD 活力。根據(jù)試劑盒說明書配制試劑并進行反應，最后用分光光度計在5nm 處測定各管的OD 值。根據(jù)說明書提供的方法來計算SOD 活力，見式（2）：

丙二醛（Malonic aldehyde，MDA）含量的測定方法為TAB 法，即過氧化脂質降解產(chǎn)物中的丙二醛可與硫代巴比妥酸縮合，形成紅色產(chǎn)物，在2nm 處有最大吸收峰。按照試劑盒說明書提供的方法進行操作，分別設定標準管，標準空白和測定空白管，用分光光度計在2nm 處測定各管吸光度值。根據(jù)式（3）計算MDA 含量：

1.4.3 睪丸組織勻漿液的制備

將待測的睪丸組織在冰冷的生理鹽水中漂洗，除去血液，用濾紙拭干。準確稱量后，置于玻璃勻漿管內。量取9 倍于組織重的預冷的生理鹽水，將其2/3 倒入勻漿管內，放入搗桿，用電動勻漿機攪拌，使組織完全破碎。將勻漿液轉入離心管內，用剩余生理鹽水反復沖洗勻漿管內壁和搗桿，沖洗液也倒入離心管內，制成10%的睪丸組織勻漿液。將勻漿液以3000r/min 離心10min，取上清液，4℃冷藏備用。以上整個勻漿操作過程在4℃下進行。取適量10%的睪丸組織勻漿液，按照試劑盒說明書的要求，在測定前進行預實驗，后根據(jù)預實驗結果對勻漿液進行不同濃度稀釋后，測定GSH-Px 的活力。

1.5 主要儀器與設備

數(shù)顯電熱恒溫水浴箱購自于北京市長風儀器儀表公司，UV-2100 型分光光度計購自于尤尼卡（上海）儀器有限公司，電動勻漿機購自于德國IKA，低溫冷凍離心機購自于Beckman 公司，Y96000 型電子分析天平購自于上海精密儀器公司。

1.6 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)使用Excel XP 進行初步處理。SPSS 10.0 進行ANOVA 統(tǒng)計處理，并用Dunnett 法進行多重比較，P＜0.05 表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 不同水平的蛋氨酸硒和納米硒對波爾山羊公羔全血、血清、睪丸中GSH-Px 活性的影響

由表2 可知，隨著日齡的增長，羔羊全血中GSH-Px 的活性明顯升高。納米硒II 組GSH-Px活性在不同試驗階段均顯著高于對照組（P＜0.05），但相同濃度的不同硒源之間差異不顯著（P＞0.05）。蛋氨酸硒II 組和納米硒II 組在補硒4周后，GSH-Px 的活性迅速上升，在第12 周時達到高峰。而蛋氨酸硒I 組和納米硒I 組GSH-Px的活力則是平穩(wěn)上升，在第16 周達到高峰，高峰值略低于蛋氨酸硒II 組和納米硒II 組。

表2 不同水平的蛋氨酸硒和納米硒對波爾山羊公羔GSH-Px 活性的影響

納米硒II 組血清GSH-Px 的活性均顯著高于對照組（P＜0.05），但與蛋氨酸硒II 組差異不顯著（P＞0.05）。日糧添加不同飼料硒源后較對照組顯著提高了血清GSH-Px 的活性，但相同濃度的不同硒源之間差異不顯著（P＞0.05）。

隨著日齡的增長，羔羊睪丸中GSH-Px 的活性明顯升高。試驗組GSH-Px 的活性在整個試驗期內均顯著高于對照組（P＜0.05）。日糧添加不同飼料硒源后較對照組顯著提高了GSH-Px 的活性，但相同濃度的不同硒源之間差異不顯著（P＞0.05）。在試驗前期蛋氨酸硒II 組和納米硒II組對睪丸GSH-Px 的影響效果好于蛋氨酸硒I 組和納米硒I 組，但隨著補硒時間的延長，各試驗組GSH-Px 的活性基本一致。

試驗組羔羊肝臟中的GSH-Px 的活性顯著高于對照組（P＜0.05），在第16 周時蛋氨酸硒I 組和納米硒I 組的GSH-Px 活性基本一致，稍高于蛋氨酸硒II 組和納米硒II 組，對照組GSH-Px 活性最低。

2.2 不同水平的蛋氨酸硒和納米硒對波爾山羊公 羔血清中SOD 活性、MDA 含量的影響

由表3 可知，隨著日齡的增長，羔羊血清中SOD 的活性明顯升高。試驗組SOD 的活性在整個試驗期內均顯著高于對照組（P＜0.05）。日糧添加不同飼料硒源后較對照組顯著提高了SOD 活性（P＜0.05），但相同濃度的不同硒源之間差異不顯著（P＞0.05）。在試驗結束時，各試驗組之間差異不顯著（P＞0.05）。蛋氨酸硒II 組和納米硒II 組SOD 的活性在第12 周時達到高峰，第16周時不再升高。蛋氨酸硒I 組和納米硒I 組在第12 周時增幅較大，在第16 周時稍有增長。對照組在整個試驗期SOD 活性平穩(wěn)增長，但增長速度緩慢。

表3 不同水平的蛋氨酸硒和納米硒對波爾山羊公羔血清中SOD 活性和MDA 含量的影響

試驗組MDA 的含量在整個試驗期內均顯著低于對照組（P＜0.05）。日糧添加不同飼料硒源后較對照組顯著降低了MDA 的含量，但相同濃度的不同硒源之間差異不顯著（P＞0.05）。在試驗結束時，對照組血清MDA 含量最高，蛋氨酸硒II 組和納米硒II 組次之，蛋氨酸硒I 組和納米硒I 組最低。

3 討論

3.1 不同水平的蛋氨酸硒和納米硒對波爾山羊公羔體內GSH-Px 活性的影響

自由基是指能獨立存在的，含一個或一個以上不配對電子的原子、原子團、分子或離子。它是在有氧呼吸過程中由于O2-的連續(xù)單電子還原而產(chǎn)生的一系列有毒的中間產(chǎn)物。自由基對機體健康有著雙重作用：一方面，自由基對正常生命活動的許多重要反應必不可少，它參與生物活性物質的合成、解毒反應以及吞噬細胞、參與動植物胚胎發(fā)育等；另一方面，過量自由基侵襲構成細胞膜的脂質及蛋白質，產(chǎn)生各種不安定的自由基，給機體造成損害，成為各種疾病的病因及增惡因子，對機體危害很大。過量自由基的清除依賴于SOD、GSH-Px 和過氧化氫酶等的協(xié)同作用才能完成。GSH-Px 是生物體內重要的含硒酶，其活性和表達都受到生物體內硒含量與硒狀態(tài)的調節(jié)，缺硒會造成GSH-Px 活性降低，導致組織細胞抗氧化損傷能力減弱。有研究表明，缺硒可以引發(fā)脂質過氧化反應，導致蛋白質、核酸等生物大分子物質損傷，影響機體內環(huán)境的相對穩(wěn)定。當攝入硒的劑量為營養(yǎng)劑量時，含硒酶活力隨劑量的增加而增加，而當攝入硒劑量為超營養(yǎng)劑量時，含硒酶的活力升高到一定程度后就不再升高，維持在一個高水平的平臺上，即含硒酶的活力達到飽和。

本試驗結果表明不同水平的蛋氨酸硒和納米硒兩種有機硒化合物都能有效地提高公羔血液、睪丸及肝臟中的GSH-Px 活力，并且其活力隨補硒劑量的增加而增加，表現(xiàn)出明顯的濃度和時間效應，即隨著日糧中硒濃度的增加及添加時間的延長，GSH-Px 的活力相應增加，但硒劑量進一步升高并不能增加GSH-Px 活性。不同水平的硒產(chǎn)生的功效不同，在試驗前期高水平硒比低水平硒更有效。試驗結果顯示在波爾山羊公羔體內，補適量的硒能夠調節(jié)體內含硒酶的活性。含硒酶的活力隨著日糧中硒劑量的增加而相應提高，但相同濃度的蛋氨酸硒和納米硒組之間差異不顯著。

本試驗結果表明不同水平的蛋氨酸硒和納米硒均能顯著提高機體抗氧化能力，在試驗前期蛋氨酸硒優(yōu)于同水平的納米硒。其原因可能是波爾山羊公羔在缺硒的狀態(tài)下，機體可以很快利用蛋氨酸硒合成谷胱甘肽過氧化物酶，當機體的缺硒狀況得到緩解時，蛋氨酸硒合成谷胱甘肽過氧化物酶的速度變慢，而納米硒則表現(xiàn)出穩(wěn)定的增長效應。在第16 周時，相同濃度的納米硒表現(xiàn)出較蛋氨酸硒稍高的抗氧化能力。

3.2 不同水平的蛋氨酸硒和納米硒對波爾山羊公羔血清SOD 活性的影響

超氧化物歧化酶對機體的氧化和抗氧化平衡起著重要的作用，該酶能清除超氧陰離子自由基，保護細胞膜免受損傷，SOD 的含量測定結果表明：日糧中添加適量的蛋氨酸硒和納米硒可顯著升高公羔血清SOD 的活性，相同濃度的蛋氨酸硒組和納米硒組差異不顯著。納米硒組公羔血清中SOD 的活性稍高于蛋氨酸硒組。SOD 作為體內重要的清除活性氧的金屬酶，其活性的相對穩(wěn)定對維持機體的正常生理功能極為重要。趙先英等[5]用vtiC 阻斷法測定SOD 活性研究發(fā)現(xiàn)硒濃度由0.09mg/kg 增加到0.4mg/kg 時，SOD 活性顯著升高，說明硒具有抗氧化作用，與本試驗結果一致。

3.3 不同水平的蛋氨酸硒和納米硒對波爾山羊公羔血清MDA 含量的影響

機體的組織細胞在代謝過程中會產(chǎn)生自由基，而細胞膜含有大量的不飽和脂肪酸，自由基與不飽和脂肪酸發(fā)生作用生成MDA 等代謝產(chǎn)物。MDA 的量可以反應出機體內脂質過氧化的程度，間接的反應細胞的損傷程度，MDA 含量測定結果表明：不同水平的蛋氨酸硒和納米硒可顯著降低公羔血清MDA 含量，納米硒組公羔血清中MDA 含量稍低于蛋氨酸硒組。說明蛋氨酸硒可能產(chǎn)失了更持久的氧化應激。

納米硒和蛋氨酸硒相比，在生物利用度，如提高GSH-Px 的活力上具有相同的功效，與本試驗結果一致。此外，有試驗表明納米硒和蛋氨酸硒相比，具有較低的短期毒性和亞慢毒性[3]。納米硒在純粹化學體系的試驗中，在氧化還原能力、清除自由基能力上都表現(xiàn)出尺寸效應，即尺寸越小，效率越高[6]。

4 結論

日糧中添加0.1～0.3mg/kg 的蛋氨酸硒和納米硒均能顯著提高波爾山羊肝臟、血液及睪丸中GSH-Px，提高血清SOD 的活性，降低血清中MDA 的含量，提高了機體的抗氧化能力，減輕了機體代謝過程中自由基所致的脂質過氧化損傷。