大豆球蛋白抗菌多肽抑制單增李斯特菌的機制研究

解博洋，王 昊，李月婷，張興國*

（1.長春中醫(yī)藥大學(xué) 健康管理學(xué)院，吉林長春 130117；2.長春市疾病預(yù)防控制中心，吉林長春 130000）

1 單增李斯特菌研究現(xiàn)狀

1.1 微生物學(xué)特征

單細胞增生李斯特菌是一種革蘭氏陽性、非成孔、兼性厭氧菌，其適宜的生長溫度通常在-0.4 ～50.0 ℃。該生物體因具有豐富的鞭毛，使其具有翻滾、蠕動的特征，但這一特征僅在較小的溫度區(qū)間內(nèi)方可進行。當溫度在20 ～25 ℃時，其細胞膜表面產(chǎn)生鞭毛，當溫度達到37 ℃時，鞭毛數(shù)量明顯減少[1]。單增李斯特菌對營養(yǎng)條件要求不高，通常在普通培養(yǎng)基上就能實現(xiàn)良好的生長，能適應(yīng)高pH 值、高鹽的環(huán)境，能在冷庫、冰箱等低溫環(huán)境下生存，有“冰箱殺手”之稱[2]。

1.2 臨床表現(xiàn)

單增李斯特菌的主要感染形式為局部感染和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的散播性感染，它屬于比較危險的感染性病原體，感染單增李斯特菌的死亡率可達到20%～30%。即使感染者在患病初期及時采取了相應(yīng)的治療手段，也很難將死亡率降到20%以下[3]。單增李斯特菌感染會造成患者發(fā)熱、腸胃炎、局部濃重、呼吸困難、敗血癥、腦膜炎以及孕婦流產(chǎn)等后果[4]，而老年人、免疫力較差者及孕婦，恰恰是感染單增李斯特菌的高危人群[5]。

1.3 流行病學(xué)特征

單增李斯特菌是一種人和動物皆可感染的病原菌，在全世界范圍內(nèi)有著不同程度的傳播狀況。在發(fā)達國家，人們感染單增李斯特菌的現(xiàn)象較為嚴重[6]。單增李斯特菌在大自然中分布很廣，多種動物也深受其害，如哺乳動物、節(jié)肢動物、魚類、鳥類等。單增李斯特菌可在不同種類動物之間通過口腔-糞便的途徑傳播，有可能是其在種群之間傳播的主要方式之一[7]。單增李斯特菌作為危害程度較大的食源性病原菌之一，其對于食品的污染是不容忽視的，單增李斯特菌可通過多種途徑污染生鮮水果蔬菜，也可以在食品的生產(chǎn)和加工環(huán)節(jié)中對乳制品、肉類食品以及未加熱即食的冷藏食品等造成污染[8]。

1.4 耐藥性

單增李斯特菌通常具有較強的耐藥性和耐環(huán)境性，其特點是通過與其他細菌交換耐藥性的方式來增強抗藥性[9-10]。單增李斯特菌引起的李斯特菌病需要使用復(fù)方磺胺甲惡唑、氨芐西林、青霉素等抗生素治療。人們?nèi)舾腥揪哂心退幮缘膯卧隼钏固鼐鷮蟠筇岣咧委煹碾y度，這將會導(dǎo)致患者的死亡率升高，更為嚴重的是單增李斯特菌攜帶的耐藥基因能夠在種屬內(nèi)及種屬間水平傳播[11]，造成多種食源性致病菌的普遍耐藥[12]。

2 大豆球蛋白抗菌多肽概述

大豆是人們熟知的一種植物，其含有豐富的蛋白質(zhì)（大豆蛋白）。大豆蛋白主要由11S（大豆球蛋白）和7S（β-伴大豆球蛋白）組成。其中，11S 是大豆蛋白的主要組成部分（約24%），通常以六聚體的結(jié)構(gòu)形式存在，每一個大豆球蛋白都由一種酸性和堿性多肽組成，通過二硫鍵連接在一起[13]。大豆球蛋白抗菌多肽是由11S（大豆球蛋白）在斷開二硫鍵后得到的一組堿性亞基，是分子量相近而結(jié)構(gòu)不同的堿性肽混合物，是抗菌肽中的一種。抗菌肽的來源很廣，在機體早期防御系統(tǒng)中發(fā)揮著重要的作用[14-15]。抗菌肽是已知的先天免疫反應(yīng)的基本成分，也可以作為某些生物體的免疫調(diào)節(jié)劑，是一種毒性低且高效、具有抗病毒、抗癌、抗菌活性的藥物。有研究表明，病原體通常對于抗菌肽很難產(chǎn)生耐藥性，也因此抗菌肽的研究被人們寄予厚望，被作為抗生素的潛在替代品[16]。大豆球蛋白抗菌多肽具有良好的熱穩(wěn)定性、低致敏性、溶解性和抗菌性，是具有潛力和開發(fā)前景的天然抗菌劑。

3 大豆球蛋白抗菌多肽抑制單增李斯特菌的機制

大豆球蛋白抗菌多肽具有抗菌廣譜性，與化學(xué)抗菌劑相比，其優(yōu)點是安全且無副作用，現(xiàn)代研究表明，大豆球蛋白抗菌多肽對單增李斯特菌的細胞膜、DNA 及其生物活性均有影響。

3.1 大豆球蛋白抗菌多肽對單增李斯特菌細胞膜的影響

大豆球蛋白抗菌多肽是一種帶正電的陽離子抗菌肽，與單增李斯特菌細胞膜表面的負電區(qū)域能夠產(chǎn)生靜電相互作用，即帶正電荷的大豆球蛋白抗菌多肽中和了單增李斯特菌表面的脂壁酸和肽聚糖等陰性基團所帶的負電荷，同時抗菌肽通過插入脂質(zhì)雙層，與細胞膜磷脂上的陰離子接觸，誘導(dǎo)細菌膜去極化而產(chǎn)生布朗運動，使細胞膜或細胞壁拉伸，產(chǎn)生更大尺寸的孔，從而導(dǎo)致細胞壁和細胞膜的裂解。細胞膜的作用是維持細胞的形狀和完整性，并保證細胞的正常生理代謝。當細胞膜損傷時，細胞內(nèi)的電解質(zhì)Na+、K+及Ca2+等出現(xiàn)紊亂，導(dǎo)致細胞腫脹甚至死亡。ABDEL-SHAFI 等[17]在7S 和11S球蛋白抑制單增李斯特菌活性的實驗中，應(yīng)用透射電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，不同濃度的11S 球蛋白能夠?qū)е聠卧隼钏固鼐砻婕毎ぎa(chǎn)生不同程度的變形或裂解。實驗表明，大豆球蛋白抗菌多肽損傷了單增李斯特菌的細胞膜。

3.2 大豆球蛋白抗菌多肽對單增李斯特菌生理活性的影響

大豆球蛋白抗菌多肽不僅對單增李斯特菌的細胞膜有損傷作用，對其生理活性也有影響，如抑制細胞的能量合成和呼吸代謝。當細胞缺乏能量供應(yīng)時，細胞將緩慢生長，甚至死亡。ATP 酶在細胞能量代謝中具有重要的作用。在電解質(zhì)的作用下，ATP將分解為ADP 并釋放大量能量，大豆球蛋白抗菌多肽可以通過影響Na+、K+等電解質(zhì)，進而影響ATP的分解，并降低ATP 酶（如β-半乳糖苷酶）的活性，從而抑制單增李斯特菌的生長和代謝。微生物主要通過TCA 循環(huán)、EMP 途徑和HMP 途徑進行細胞呼吸代謝，這3 種途徑是細胞獲得能量的基本過程，如果細胞呼吸代謝受到抑制，微生物生命也將消耗殆盡。有研究表明[18]，大豆球蛋白抗菌多肽對單增李斯特菌的呼吸代謝有抑制作用，并在糖酵解途徑中最為顯著。NING 等[19]通過比較大豆球蛋白抗菌多肽對3 種呼吸代謝途徑的抑制作用，發(fā)現(xiàn)濃度為0.1 mg·mL-1的大豆球蛋白抗菌多肽在單增李斯特菌呼吸代謝過程中的總抑制率為20.88%，在EMP 途徑、TCA 途徑和HMP 途徑中的抑制率分別為41.00%、35.51%和25.20%。這表明，在EMP 途徑、TCA 途徑和HMP 途徑中，EMP 途徑受大豆球蛋白抗菌多肽的抑制最為明顯，且EMP 途徑中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)酶的活性下降最快，由此得出大豆球蛋白抗菌多肽可顯著抑制單增李斯特菌EMP 途徑中關(guān)鍵酶的活性，從而抑制其呼吸代謝。

3.3 大豆球蛋白抗菌多肽對單增李斯特菌DNA 的影響

DNA 是細菌生長、發(fā)育的主要遺傳物質(zhì)。大豆球蛋白抗菌多肽可導(dǎo)致單增李斯特菌中的DNA含量降低，這是由于大豆球蛋白抗菌多肽破壞了單增李斯特菌的細胞膜，使核酸及蛋白質(zhì)從細胞內(nèi)流出，同時大豆球蛋白抗菌多肽也會對單增李斯特菌的DNA 的復(fù)制及表達產(chǎn)生干擾。雖然大豆球蛋白抗菌多肽破壞單增李斯特菌DNA 的機制尚不明確，但LI 等[20]應(yīng)用一種合成抗菌肽對大腸桿菌的DNA 進行了處理。結(jié)果發(fā)現(xiàn)此抗菌肽中的P7 能夠與細菌DNA 相互作用，并抑制基因組脫氧核糖核酸的遷移，且P7 能夠插入基因組堿基對中，使細菌DNA 的復(fù)制停留在R 期，無法完成完整的復(fù)制周期，干擾正常的細胞周期。由此筆者認為大豆球蛋白抗菌多肽與單增李斯特菌中的DNA 相互作用，可能阻礙并抑制了大分子的合成以及相關(guān)基因的表達，同時破壞細菌正常的生命周期，從而導(dǎo)致細菌的死亡。

4 結(jié)語

綜上所述，大豆球蛋白抗菌多肽作為一種天然的抑菌劑，對單增李斯特菌具有良好的抑制效果，可從破壞細胞膜、DNA 以及抑制細胞呼吸代謝等多方面抑制或殺死單增李斯特菌。近年來，單增李斯特菌的耐藥性不斷上升，因此尋找高效、低耐藥性的替代品具有重要意義。大豆球蛋白抗菌多肽作為一種天然抗菌劑，對單增李斯特菌具有較好的抑制效果。大豆球蛋白抗菌多肽具有耐熱性、抗菌性、毒性低以及溶解性高的特點，可作為新型的天然防腐劑以保證食品安全。大豆球蛋白抗菌多肽具有較好的開發(fā)前景和潛力，本文闡述了大豆球蛋白抗菌多肽抑制單增李斯特菌的機制，為新型高效的天然抗菌劑的開發(fā)提供理論參考。目前仍有一些因素有待研究與探討，即研究大豆球蛋白抗菌多肽與抗生素聯(lián)合使用抑制單增李斯特菌的效果以及如何將大豆球蛋白抗菌多肽合理地應(yīng)用在食品的生產(chǎn)、加工和貯存中。