m6A修飾在脊髓損傷恢復(fù)中的研究進(jìn)展

張東旭 趙欣華 蔣煥瑩 周立新 孫忠人 尹洪娜

黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院針灸七科（哈爾濱 150006）

脊髓損傷（SCI）是一種嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）損傷疾病，常導(dǎo)致患者損傷平面以下的運(yùn)動、感覺及自主神經(jīng)功能障礙［1］。SCI按發(fā)病機(jī)制可分為原發(fā)性和繼發(fā)性（SSCI）兩類，其中原發(fā)性SCI為外傷及暴力等造成的血管結(jié)構(gòu)損傷、軸突破裂等機(jī)械性損傷；SSCI則常因原發(fā)性SCI產(chǎn)生的位移、血腫、壓迫等未及時解除，導(dǎo)致?lián)p傷部位產(chǎn)生如炎癥、細(xì)胞凋亡、膠質(zhì)瘢痕等持續(xù)性病理改變［2］。這種由SSCI產(chǎn)生的不利于神經(jīng)功能恢復(fù)的微環(huán)境也是SCI后難以恢復(fù)，具有較高的致殘率的原因，故對于SSCI的治療是SCI恢復(fù)的關(guān)鍵［3］。

N6-甲基腺苷（m6A）是真核生物必不可少的轉(zhuǎn)錄修飾［4］，已證實(shí)與神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理發(fā)展密切相關(guān)［5］。研究［6］發(fā)現(xiàn)，SCI后損傷部位m6A的修飾水平發(fā)生了變化，m6A相關(guān)調(diào)節(jié)因子參與了SSCI后損傷部位微環(huán)境的發(fā)展與變化。因此，m6A修飾相關(guān)調(diào)節(jié)因子可能是促進(jìn)SCI恢復(fù)的潛在治療靶點(diǎn)。本文就m6A參與的SCI恢復(fù)的可能機(jī)制研究現(xiàn)狀進(jìn)行綜述，以期為SCI的治療提供新思路。

1 m6A修飾

Conrad Waddington于1942年首次提出表觀遺傳修飾的概念［7］，這種修飾方式可通過一些化學(xué)修飾，在不改變基因序列的情況下，通過DNA、RNA、蛋白質(zhì)三個層面的修飾，調(diào)控基因的表達(dá)。其中RNA的化學(xué)修飾則被證實(shí)較多參與了CNS疾病的病理過程［8］。在已知的170多種RNA修飾中，m6A修飾具有高度動態(tài)性和選擇修飾性，可通過翻譯、剪切、降解及穩(wěn)定性的變化決定RNA的命運(yùn)［9］。m6A修飾這一過程是動態(tài)的、可逆的、保守的，依賴多種相關(guān)蛋白及酶，主要為甲基轉(zhuǎn)移酶、去甲基酶、m6A結(jié)合蛋白三類［10］。近年來，隨著測序技術(shù)的發(fā)展，大量研究表明，m6A修飾在一些疾病進(jìn)展中發(fā)揮重要的作用。

2 m6A修飾的多維機(jī)制

2.1 甲基轉(zhuǎn)移酶細(xì)胞內(nèi)RNA的甲基化通常需要各種酶的共同催化，這些酶被稱為“Writers”。作為m6A修飾中的“編碼器”，甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物，包括甲基轉(zhuǎn)移酶樣3（METTL3）及甲基轉(zhuǎn)移酶樣14（METTL14）及其他相關(guān)酶，如腎母細(xì)胞瘤相關(guān)蛋白1（WTAP）［11］。自1997年METTL3首次發(fā)現(xiàn)以來，其一直被廣泛研究，已知是甲基酶復(fù)合物的催化核心，能通過穩(wěn)定募集到特定的基因位點(diǎn)和促進(jìn)RNA轉(zhuǎn)運(yùn)到核糖體影響翻譯效率進(jìn)而影響基因表達(dá)［12］。另一種酶METTL14雖不具有催化作用，但其可與METTL3起協(xié)同作用，一方面與METTL3形成二聚體的穩(wěn)定復(fù)合結(jié)構(gòu)；另一方面可通過與RNA底物結(jié)合起到增加METTL3甲基轉(zhuǎn)移酶活性的作用［13］。除了METTL3和14，WTAP的作用也值得探討。WTAP在甲基化酶復(fù)合物中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，將復(fù)合物與RNA連接起來，WTAP的缺失會導(dǎo)致異常的基因表達(dá)和可變剪接［14］。

2.2 去甲基酶m6A去甲基化酶可以從核苷酸中去除甲基，通常稱為“Erasers”，其發(fā)現(xiàn)表明RNA的m6A修飾是動態(tài)并可逆轉(zhuǎn)的［10］。肥胖相關(guān)蛋白（FTO）和ALKB同系蛋白5（ALKBH5）是常見的“解碼器”，可以有效降低m6A修飾水平。FTO是第一個被發(fā)現(xiàn)的去甲基酶，其對于m6A修飾的去除是通過氧化反應(yīng)實(shí)現(xiàn)的，并在mRNA的降解、翻譯中發(fā)揮重要作用［15］。研究［16］還發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TO參與了不同情況下的神經(jīng)系統(tǒng)疾病的病理發(fā)展。ALKBH5是另一種能夠逆轉(zhuǎn)m6A修飾的酶，研究［17］發(fā)現(xiàn)ALKBH5的失活可導(dǎo)致mRNA上的m6A水平顯著升高。此外，ALKBH5也與轉(zhuǎn)錄后RNA調(diào)節(jié)有關(guān)，可緊密地與RNA底物結(jié)合，影響RNA的表達(dá)水平［18］。

2.3 m6A結(jié)合蛋白作為m6A修飾中的“讀碼器”，這些結(jié)合蛋白可以與m6A修飾位點(diǎn)結(jié)合直接或間接影響RNA翻譯、剪接和解體等生物過程，常被稱為“Readers”。其中值得關(guān)注的是YT521-B同源結(jié)構(gòu)域家族蛋白（YTHDFs、YTHDCs）、異質(zhì)核糖核蛋白（HNRNPs）和胰島素樣生長因子2（IGF2）。YTH家族因其特有的RNA結(jié)合位點(diǎn)可直接調(diào)控位于細(xì)胞核及細(xì)胞質(zhì)中的m6A修飾靶基因，進(jìn)而對RNA產(chǎn)生影響［19］；HNRNP家族則可通過調(diào)控位于細(xì)胞核中RNA底物的成熟過程，從而影響目標(biāo)RNA的豐度和剪接［20］。IGF2是最新研究發(fā)現(xiàn)的m6A結(jié)合蛋白，可以保護(hù)m6A修飾的mRNA免于降解［21］。上述結(jié)合蛋白都在與m6A修飾的甲基化位點(diǎn)結(jié)合后，識別并解析其相關(guān)生物功能的指令，進(jìn)而發(fā)揮對下游分子的調(diào)控作用。見圖1。

圖1 m6A修飾機(jī)制圖Fig.1 Mechanism diagram of m6A modification

3 m6A修飾在SCI后的生物學(xué)作用及機(jī)制

3.1 m6A修飾與炎癥SCI后損傷部位的炎癥微環(huán)境對預(yù)后的影響不容忽視，作為SCI后最早做出反應(yīng)的免疫細(xì)胞，小膠質(zhì)細(xì)胞參與了激活炎癥的級聯(lián)反應(yīng)，加重了繼發(fā)性損傷，是影響SCI后炎癥的關(guān)鍵因素［22］。

小膠質(zhì)細(xì)胞具有促炎型M1和抗炎型M2兩種表型。SCI常促使小膠質(zhì)細(xì)胞向M1型極化［23］。M1型小膠質(zhì)細(xì)胞在發(fā)揮防御作用的同時，也會加重神經(jīng)炎癥和神經(jīng)細(xì)胞損傷，影響神經(jīng)功能的恢復(fù)［24］。因此，對于小膠質(zhì)細(xì)胞極化的調(diào)控可能有助于神經(jīng)恢復(fù)并減輕繼發(fā)性損傷。研究發(fā)現(xiàn)m6A修飾在小膠質(zhì)細(xì)胞極化中可能起到了關(guān)鍵作用。ZHOU等［25］的研究發(fā)現(xiàn)，對于m6A讀取器YTHDC1的特異性敲除導(dǎo)致了小膠質(zhì)細(xì)胞向M1型極化，促進(jìn)了炎癥反應(yīng)。WEN等［26］的研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)METTL3可促使小膠質(zhì)細(xì)胞向M1型極化，其機(jī)制可能是METTL3以m6A依賴的方式激活了TRAF6-NF-κB通路，導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞向促炎型轉(zhuǎn)化，并產(chǎn)生炎性反應(yīng)。DING等［27］的研究發(fā)現(xiàn)，IGF2BP1是控制小膠質(zhì)細(xì)胞過度激活的潛在治療靶點(diǎn)，其可通過與靶標(biāo)3'UTR結(jié)合加強(qiáng)m6A修飾水平調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞的炎性反應(yīng)。此外，另一項(xiàng)研究［28］通過生物信息學(xué)的方式發(fā)現(xiàn)M0、M1、M2三種表型小膠質(zhì)細(xì)胞中l(wèi)ncRNA的m6A修飾水平存在差異，且M1型在m6A修飾中表現(xiàn)出最顯著的變化，這些具有修飾差異的lncRNA可以通過改變各種免疫系統(tǒng)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程來調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。研究［28］發(fā)現(xiàn)，m6A修飾與調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)的基因表達(dá)同樣具有動態(tài)、復(fù)雜的關(guān)系。綜上，m6A修飾可通過多種途徑對小膠質(zhì)細(xì)胞表型產(chǎn)生影響，而通過對m6A水平的調(diào)控可能減輕SCI損傷部位的炎性反應(yīng)，但目前對于SCI后特定調(diào)節(jié)因子、細(xì)胞表型及機(jī)制聯(lián)系的研究仍處于初始階段，未來可于此方向進(jìn)一步研究。

3.2 m6A修飾與細(xì)胞凋亡細(xì)胞凋亡是神經(jīng)系統(tǒng)中細(xì)胞程序性死亡的一種常見形式［29］。神經(jīng)元細(xì)胞凋亡是SSCI造成脊髓神經(jīng)元死亡的主要原因，常在SCI后24 h內(nèi)大量發(fā)生［30］。因此，抑制細(xì)胞凋亡對于減輕繼發(fā)性損傷及幫助神經(jīng)功能重建至關(guān)重要。最近研究發(fā)現(xiàn)，m6A甲基化修飾與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切。

一項(xiàng)大腦中動脈閉塞（MCAO）大鼠的研究［31］中發(fā)現(xiàn)，m6A讀取器YTHDF1在MCAO大鼠腦組織中表達(dá)上調(diào)，對于YTHDF1特異性敲除不但減輕了損傷腦組織的細(xì)胞凋亡和神經(jīng)元損傷，還限制了梗死面積。此外，METTL3對于細(xì)胞凋亡的影響同樣值得注意，METTL3特異性失活誘導(dǎo)的m6A修飾會使小鼠新生小腦顆粒細(xì)胞大量凋亡，從而導(dǎo)致小腦發(fā)育不良［32］；小鼠海馬體中的METTL3缺乏則會增加局部細(xì)胞凋亡并改變細(xì)胞周期［33］。WANG等［34］的研究發(fā)現(xiàn)，SCI后大鼠RNA中METTL14含量及m6A修飾水平顯著升高，但抑制損傷局部METTL14表達(dá)可降低大鼠的整體m6A修飾水平，并且觀察到神經(jīng)元興奮性的增加及大鼠運(yùn)動功能的恢復(fù)。此外，該研究還通過體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，METTL14的過表達(dá)促進(jìn)了pri-miR-375向抑制細(xì)胞增殖的miR-375的轉(zhuǎn)化，從而誘導(dǎo)了細(xì)胞凋亡［34-35］。另一項(xiàng)研究［36］發(fā)現(xiàn)，真核蛋白翻譯延伸因子1A2（EEF1A2）的表達(dá)對于細(xì)胞凋亡具有抑制作用，但SCI后METTL14的表達(dá)上調(diào)并通過介導(dǎo)EEF1A2的m6A修飾水平，下調(diào)了EEF1A2的表達(dá)，從而促進(jìn)了SCI后的細(xì)胞凋亡。GAO等［37］的研究通過沉默METTL14發(fā)現(xiàn)，SCI大鼠EEF1A2表達(dá)上調(diào)，抑制了損傷部位細(xì)胞凋亡的同時還減少炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生及脊髓中的神經(jīng)元變性。通過上述研究可發(fā)現(xiàn)，甲基轉(zhuǎn)移酶在抑制SCI后細(xì)胞凋亡中有著不可替代的作用，可最大程度降低繼發(fā)性損傷帶來的細(xì)胞死亡，通過甲基轉(zhuǎn)移酶調(diào)控?fù)p傷部位m6A修飾水平有望成為SCI靶向治療的新方向。

3.3 m6A修飾與膠質(zhì)瘢痕SCI后星形膠質(zhì)細(xì)胞活化為反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞，胞體肥大、增殖，并向損傷部位遷移，形成膠質(zhì)瘢痕［38］。這種瘢痕早期可限制炎癥擴(kuò)散，而隨著疾病進(jìn)展，膠質(zhì)瘢痕形成物理屏障，并釋放軸突生長抑制因子，影響了神經(jīng)功能的恢復(fù)［39-40］。因此，探究m6A修飾對于膠質(zhì)瘢痕形成的影響可能為SCI的治療開辟新的研究領(lǐng)域。

最近的研究發(fā)現(xiàn)，m6A修飾可以調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞的生理功能。TENG等［41］的研究發(fā)現(xiàn)，在腦黑質(zhì)中特異性敲除METTL14后，黑質(zhì)中mRNA的總m6A修飾水平顯著降低，并激活了星形膠質(zhì)細(xì)胞，使小鼠的運(yùn)動功能顯著下降。HUANG等［42］的研究發(fā)現(xiàn)circSTAG1是重度抑郁癥小鼠海馬中表達(dá)顯著下調(diào)的一種circRNA，其可通過與ALKBH5結(jié)合，降低ALKBH5介導(dǎo)的脂肪酸酰胺水解酶（FAAH）mRNA的m6A修飾水平，從而限制星形膠質(zhì)細(xì)胞中FAAH的表達(dá)，達(dá)到減輕小鼠海馬中星形膠質(zhì)細(xì)胞功能障礙、減少星形膠質(zhì)細(xì)胞丟失的作用。對于SCI后星形膠質(zhì)細(xì)胞及膠質(zhì)瘢痕的影響，GE等［43］的研究表明，相較于單純SCI模型組，選擇性刪除METTL3的SCI模型組星形膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）表達(dá)降低，證明損傷部位反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量降低，抑制了膠質(zhì)瘢痕形成。XING等［44］的研究發(fā)現(xiàn)，SCI后METTL3在星形膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)顯著增加，這可能對星形膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)和功能產(chǎn)生了影響，但對于METTL3的變化對膠質(zhì)瘢痕的影響還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)闡明。另一項(xiàng)體外實(shí)驗(yàn)［34］發(fā)現(xiàn)，在用H2O2模擬SCI誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡后，METTL14敲除顯著減少了C8-D1A小鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞凋亡，這意味SCI后m6A的修飾水平與星形膠質(zhì)細(xì)胞的存亡密切相關(guān)，而對m6A修飾水平的影響可能對SCI后膠質(zhì)瘢痕的形成產(chǎn)生調(diào)控作用。總之，SCI后損傷部位m6A修飾水平的異常變化可能激活了星形膠質(zhì)細(xì)胞，并于損傷部位生成膠質(zhì)瘢痕，導(dǎo)致神經(jīng)功能的恢復(fù)受到抑制，但由于此方面研究仍較少，m6A修飾與SCI后膠質(zhì)瘢痕的關(guān)系仍需進(jìn)一步深入探究。

3.4 m6A修飾與軸突再生SCI后運(yùn)動功能障礙的主要原因是神經(jīng)環(huán)路連續(xù)性被破壞［45］。軸突作為神經(jīng)傳導(dǎo)功能的重要因素，促進(jìn)軸突再生及髓鞘化是神經(jīng)環(huán)路重建的關(guān)鍵［46］。既往研究［47］寄希望于移植外源細(xì)胞促使其向神經(jīng)元轉(zhuǎn)化來修復(fù)神經(jīng)環(huán)路。最近對m6A修飾的研究發(fā)現(xiàn)RNA修飾可以影響軸突再生。

在神經(jīng)系統(tǒng)中，神經(jīng)元軸突的再生受到m6A修飾的影響。YU等［48］研究表明，正常狀態(tài)下FTO即在神經(jīng)元的軸突中表達(dá)以維持軸突中m6A修飾水平的穩(wěn)定，將軸突中FTO特異性敲除后，與神經(jīng)元發(fā)育及軸突生長關(guān)系密切的生長相關(guān)蛋白43（GAP-43）mRNA的m6A修飾水平顯著升高，從而減少了GAP-43 mRNA的局部翻譯并抑制了軸突生長。此外，YTHDF1和YTHDF2則被證明分別作用于Wnt5a信號通路的兩個關(guān)鍵因子Wnt家族成員5A（Wnt5a）和散亂片段極性蛋白1（Dvl1）而后協(xié)同起到對軸突生長的負(fù)調(diào)控作用，而抑制YTHDF1及YTHDF2的表達(dá)可以促進(jìn)顆粒細(xì)胞中的軸突生長［49］。ZHUANG等［50］研究發(fā)現(xiàn)YTHDF1介導(dǎo)的m6A修飾對軸突導(dǎo)向受體3.1（Robo3.1）mRNA的翻譯起到正向調(diào)控的作用，抑制Robo3.1蛋白水平在交叉后的軸突中降低，從而控制脊髓中的預(yù)交叉軸突導(dǎo)向。在一項(xiàng)斑馬魚和小鼠的SCI實(shí)驗(yàn)［44］中，研究人員對損傷部位組織進(jìn)行MeRIP-seq、RNAseq等測序技術(shù)后發(fā)現(xiàn)，共計84個基因的mRNA在SCI后m6A修飾水平顯著改變，這樣的數(shù)量雖然不算龐大，但其中如hsp90ab1、taf1、igf2bp1及tp53等均已被證明在軸突生長和神經(jīng)元發(fā)展中發(fā)揮重要作用，提示m6A修飾可能參與了SCI后軸突及神經(jīng)元的生長發(fā)育，這是關(guān)于RNA m6A修飾在SCI中的作用的首次研究。此外，SCI后對軸突生長特異性標(biāo)記的抗乙酰化微管蛋白（AcTub）表達(dá)下調(diào)，說明軸突生長受到抑制，而對METTL14進(jìn)行敲除后AcTub的表達(dá)顯著上調(diào)，這表明METTL14對SCI后軸突生長具有調(diào)控作用［34，51］。總之，軸突再生是神經(jīng)環(huán)路重建的關(guān)鍵，也是SCI患者功能恢復(fù)的關(guān)鍵，m6A修飾可能是促進(jìn)SCI后軸突再生的潛在機(jī)制，調(diào)控m6A修飾水平的同時若可配合電針等針灸療法，可能對于患者的功能恢復(fù)產(chǎn)生意想不到的效果。見圖2、表1。

表1 m6A修飾相關(guān)蛋白在SCI中作用機(jī)制匯總表Tab.1 Summary of the mechanisms of m6A modification related proteins in spinal cord injury

圖2 m6A修飾相關(guān)蛋白在SCI中作用機(jī)制圖Fig.2 Mechanisms of m6A modification related proteins in spinal cord injury

4 總結(jié)與展望

作為RNA表觀遺傳學(xué)的關(guān)鍵部分，m6A修飾是一種動態(tài)修飾的過程，其水平由甲基轉(zhuǎn)移酶、去甲基酶及相關(guān)結(jié)合蛋白的變化共同影響。研究［52］已證實(shí)，在已知的170多種RNA甲基化修飾中m6A甲基化修飾在脊椎動物中含量最高，參與了多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病進(jìn)程。盡管關(guān)于m6A甲基化修飾在阿爾茨海默病、帕金森病、多發(fā)性硬化等神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的作用已有相關(guān)研究［53］，但關(guān)于這種翻譯后修飾在SCI中作用的研究仍處于起步階段。本綜述詳細(xì)概述了m6A甲基化修飾的研究現(xiàn)狀以及m6A甲基化修飾相關(guān)調(diào)節(jié)因子在SCI后如炎癥、細(xì)胞凋亡、膠質(zhì)瘢痕形成、軸突再生等病理生理過程中發(fā)揮的作用，提示m6A甲基化修飾在SCI的治療中存在巨大的應(yīng)用潛力。

但目前對于SCI后m6A修飾的研究存在如下問題，SCI后繼發(fā)性損傷的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，關(guān)于m6A修飾對SCI影響的具體機(jī)制的研究數(shù)量仍較少且研究內(nèi)容多以“甲基轉(zhuǎn)移酶”入手，還需要對SCI后去甲基酶和結(jié)合蛋白的影響進(jìn)行更多研究；除細(xì)胞凋亡外，尚未有SCI后其他細(xì)胞死亡方式同m6A修飾的研究；髓鞘再生及突觸形成對于SCI后神經(jīng)環(huán)路重建同樣意義重大，但目前鮮有研究，期待研究人員的進(jìn)一步深入研究，為m6A修飾減輕SCI后繼發(fā)損傷提供重要依據(jù)。作為SCI潛在治療方式，這種動態(tài)修飾過程可能成為影響SCI病理過程和促進(jìn)脊髓功能恢復(fù)的有效治療策略，在未來的研究中期待以m6A修飾為靶點(diǎn)的藥物或其他治療方式的誕生，作為更加精準(zhǔn)且有效的SCI治療方式，對減輕患者的病痛具有重要意義。