妊娠期糖尿病患者血清circFOXP1和circMAP3K4基因表達變化及臨床意義

肖波,方娟,張遠遠,王燕,吳利榮

妊娠期糖尿病(gestational diabetes mellitus,GDM)是妊娠期間出現的代謝紊亂疾病[1]。GDM的危險因素包括肥胖、既往糖尿病史、2型糖尿病家族史和遺傳等因素[2]。在妊娠晚期,血糖水平急劇升高[3]。但當前缺乏早期預測和診斷GDM的分子標志物,因此,研究GDM相關的生物指標,對提高GDM的診斷具有重要意義。在GDM患者血清中發現了大量失調的circRNA[4]。研究表明,環狀RNA叉頭框蛋白P1(circrna forkhead frame protein P1,circFOXP1)是一種轉錄抑制因子,在調節全身葡萄糖穩態中發揮作用[5]。糖尿病小鼠的肝臟circFOXP1表達水平降低[6]。circMAP3K4在GDM患者的胎盤中高表達,其表達與孕期母體體質量增加和口服葡萄糖耐量試驗(oral glucose tole-rance test,OGTT)時間—血糖曲線的曲線下面積(AUC)呈正相關。生物信息學分析結果顯示,circMAP3K4可以通過miR-6795-5p/PTPN1軸調節胰島素-PI3K/Akt通路[7]。目前,對于circFOXP1和circMAP3K4基因表達在GDM患者的研究甚少,因此,本研究旨在研究GDM患者血清中circFOXP1和circMAP3K4基因表達狀況,以期為GDM的診斷提供新的診斷標志物,報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2021年11月—2022年11月武漢科技大學附屬漢陽醫院婦產科收治GDM患者128例為GDM組,同期選擇在醫院孕檢的健康孕婦128例為對照組,2組人員年齡、孕周、體質量指數(BMI)、產次、總膽固醇(TC)比較差異無統計學意義(P>0.05);與對照組比較,GDM組三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、空腹血糖(FPG)、空腹胰島素(FINS)水平顯著升高,高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平顯著降低(P<0.01),見表1。本研究已經獲得醫院倫理委員會批準(2021001026),受試者及家屬知情同意并簽署知情同意書。

表1 對照組與GDM組孕婦臨床資料比較

1.2 病例選擇標準 (1)納入標準:①符合《妊娠合并糖尿病診治指南(2014版)》的診斷標準[8];②首次確診為GDM者。(2)排除標準:①患有糖尿病、高血壓的患者;②患有惡性腫瘤的患者；③免疫性疾病者;④精神異常無法進行正常交流的患者。

1.3 觀測指標與方法

1.3.1 血脂血糖檢測:孕婦入組當天抽取空腹肘靜脈血10 ml,離心留取血清放置于-20℃待用。血清5 ml用于檢測TC、TG、LDL-C、HDL-C、FPG、FINS水平。使用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)法檢測TC(上海酶研生物科技有限公司)、TG(上海化邦生物科技有限公司)、LDL-C(上海化邦生物科技有限公司)、HDL-C(上海恒斐生物科技有限公司)、FINS(上海西格生物科技有限公司)水平,采用葡萄糖氧化酶法測量血糖水平,試劑盒購自于北京索萊寶科技有限公司。

1.3.2 血清circFOXP1和circMAP3K4基因檢測:上述剩余血清5 ml,采用實時熒光定量PCR(qPCR)檢測血清circFOXP1和circMAP3K4基因表達,提取血清總RNA,使用反轉錄試劑盒(上海吉至生化科技有限公司)合成cDNA。使用熒光定量PCR儀(型號Rotor-Gene Q,QIAGEN)和qPCR試劑盒(江西艾博因生物科技有限公司)進行circFOXP1和circMAP3K4基因表達檢測,反應體系共20 μl:2 × Probe qPCRFast Mix反應酶 10 μl,cDNA 1 μl,上下引物各1 μl,ddH2O 7 μl。反應條件:93℃ 90 s、93℃ 30 s、59℃ 30 s、72℃ 15 s,共計40個循環。試驗重復3次,嚴格遵循試劑盒說明書進行。采用2-△△CT法分析結果。qPCR引物由南京擎科生物科技有限公司進行合成,引物序列見表2。

表2 血清circFOXP1和circMAP3K4引物序列

2 結 果

2.1 2組血清circFOXP1和circMAP3K4基因表達比較 與對照組比較,GDM組患者血清circFOXP1表達顯著降低,circMAP3K4表達顯著升高(P<0.05),見表3。

表3 對照組與GDM組血清circFOXP1和circMAP3K4基因表達水平比較

2.2 GDM患者血清circFOXP1與circMAP3K4表達的相關性 相關性分析顯示,GDM患者血清circFOXP1和circMAP3K4表達呈負相關(r=-0.302,P=0.001)。

2.3 ROC曲線分析血清circFOXP1和circMAP3K4表達診斷GDM的價值 繪制血清circFOXP1和circMAP3K4表達診斷GDM的ROC曲線,并計算曲線下面積(AUC),結果顯示,血清circFOXP1、circMAP3K4及二者聯合診斷GDM發生的AUC分別為0.873、0.842、0.931,二者聯合優于各自單獨診斷(Z/P=2.207/<0.001,2.029/0.023),見表4、圖1。

圖1 血清circFOXP1和circMAP3K4對GDM診斷的ROC曲線

表4 血清circFOXP1和circMAP3K4診斷GDM的價值比較

2.4 Logistic回歸分析影響GDM發生的危險因素 以GDM是否發生為因變量(發生=1,未發生=0),以上述結果中P<0.05項目(TG、LDL-C、HDL-C、FPG、FINS、circFOXP1、circMAP3K4水平)為自變量,進行多因素Logistic回歸分析,結果顯示,FPG高、circFOXP1低表達和circMAP3K4高表達為GDM發生的危險因素(P<0.01),見表5。

表5 Logistic回歸分析影響GDM發生的危險因素

3 討 論

GDM是指妊娠前糖代謝正常,但妊娠期孕婦體內的糖耐量水平受損及空腹血糖水平升高[9]。隨著人類生活水平提高以及飲食的變化,GDM的發病率逐年增加[10]。在懷孕期間，發生不良妊娠的風險幾率增加,對所有待產孕婦及新生兒的生命健康造成嚴重威脅[11]。早期對GDM進行診斷能夠盡早改善孕婦的妊娠過程,因此尋找GDM診斷相關的指標具有重要的臨床價值。

circRNA是近期發現的內源性非編碼RNA,研究發現circRNA在基因表達的調控中起著重要作用,在臨床診斷和治療中可作為潛在的生物指標[12]。circRNA參與調節糖尿病患者胰島素的分泌[13]。circFOXP1已成為胰島素和生長因子作用的重要靶標,其在細胞生長、分化和應激反應中起著關鍵作用[14]。circFOXP1在人體組織中廣泛表達并調節許多組織的發育,包括心臟、胸腺和肺[15]。circFOXP1缺陷胚胎在心臟形態發生方面存在嚴重缺陷,包括流出道分隔和墊層缺陷,導致胚胎死亡[16]。本次研究表明,與對照組比較,GDM組患者血清中circFOXP1水平顯著降低,推測在GDM的發展中,circFOXP1可能起調控作用,表明circFOXP1可能參與了GDM的發生進程。ROC曲線結果表明,circFOXP1診斷GDM發生的AUC為0.873,敏感度為0.825,特異度為0.778,表明circFOXP1對GDM的診斷有一定的效能,有成為診斷GDM發生的潛力。多因素分析結果顯示,circFOXP1低表達為GDM發生的危險因素,進一步說明circFOXP1可能成為診斷GDM發生的生物標志物。

除胎盤外,circMAP3K4在幾種胰島素靶向組織中也表達豐富,如骨骼肌、肝臟和心臟[17]。circMAP6K3的m4A修飾可以影響其二級結構剪接、降解或分子穩定性,從而影響其表達[18]。有研究結果表明,circMAP3K4參與妊娠期間葡萄糖代謝過程,發現circMAP3K4在GDM患者的胎盤組織中高表達[7,19]。研究表明,circMAP3K4在參與調節母體葡萄糖代謝的過程中,會進一步影響胎盤的表觀遺傳變化[20]。本次研究表明,GDM組患者血清中circMAP3K4水平顯著高于對照組,與以往研究結果一致[19],表明circMAP3K4在GDM患者血清中高表達,在一定范圍內影響葡萄糖的代謝過程。ROC曲線分析結果顯示,circMAP3K4診斷GDM發生的AUC為0.842,敏感度為0.854,特異度為0.745,提示circMAP3K4的水平對GDM具有一定的診斷效能;多因素分析結果顯示,circMAP3K4高表達為GDM發生的危險因素,提示circMAP3K4可能參與GDM的發生及進展,有望成為新的診斷GDM的潛在靶點。

相關性分析顯示,GDM患者血清circFOXP1與circMAP3K4基因表達水平呈負相關,表明二者共同參與GDM的發生,從而影響到GDM患者的糖代謝穩態。二者聯合診斷GDM的AUC高于血清circFOXP1和circMAP3K4單獨診斷的AUC值,表明二者聯合診斷價值優于單一指標檢測的診斷價值,能夠提高GDM的診斷效能。

綜上所述,在GDM患者血清中circFOXP1呈低表達,circMAP3K4呈高表達,二者是GDM發生的危險因素,可以作為早期GDM診斷的生物標志物。但本次研究數量較少,GDM的發生過程較為復雜,后續將擴大樣本數量及延長研究時間,為GDM的研究提供可靠的臨床數據。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明

肖波、方娟:設計研究方案,實施研究過程,分析試驗數據;張遠遠:資料搜集整理,論文撰寫,論文修改;王燕:設計研究方案,分析試驗數據;吳利榮:資料搜集整理,進行統計學分析,論文修改