維甲酸對小型豬牙周膜干細胞成骨誘導能力的比較研究

張鵬濤 張蕾 張遠 馬路平 丁成 王進濤 鐘良軍

慢性牙周炎（chronic periodontitis，CP）是一種慢性感染性疾病，會引起牙周組織慢性進行性破壞［1］，最終導致牙齒松動、缺失。牙周治療的目的是消除齦上和齦下菌斑，終止牙周病變［2］，最理想的牙周治療效果能使牙骨質、牙槽骨、牙周懸韌帶獲得再生［3］。2004年，SEO等［4］學者首次從人牙周膜細胞中分離純化出STRO-1陽性的細胞，并且發現這些細胞具有多方向誘導分化能力，將其命名為牙周膜干細胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs），從此為牙周組織再生提供了新的種子細胞和理論依據。維甲酸（retinoic acid，RA）是一種調控胚胎發育和骨形成的重要信號分子［5］，研究發現RA具有誘導多種間充質干細胞向成骨方向分化的能力［6-9］。小型豬在口腔頜面部發育生物學、解剖學和生理學上與人類相似，因此被認為是比較理想的研究口頜系統疾病的大動物模型，已被廣泛應用于涎腺、牙齒、牙周以及頜骨疾病研究與再生治療探索中［9-10］。目前不同濃度RA對PDLSCs成骨誘導的差異研究尚少，本實驗擬對小型豬PDLSCs體外分離、培養、鑒定，并使用不同濃度的RA對其進行成骨方向誘導，觀察各濃度RA誘導后小型豬PDLSCs的堿性磷酸酶活性、相關成骨基因表達的差異，以期為臨床修復骨缺損提供新思路，為動物實驗提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 實驗對象 健康雄性4～6個月齡貴州小型香豬4只，體質量15～20 kg。

1.2 實驗試劑 低糖DMEM，胎牛血清（HyClone公司，美國），細胞培養用青霉素、鏈霉素，0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液（Solarbio公司，中國），L-α-磷酸抗壞血酸，茜素紅染色劑，β-甘油磷酸鈉，全反式維甲酸（Sigma公司，美國），小鼠抗人STRO-1單克隆抗體（R＆D，美國），山羊抗小鼠IGM-FITC熒光二抗（Santa Cruz公司，美國），小鼠抗人波形蛋白Vimentin、小鼠抗人角蛋白PCK、免疫組化試劑盒（博士德公司，中國），DAB顯色試劑盒（中杉金橋，中國），ALP活性檢測試劑盒（建成，中國）。引物（上海生物工程有限公司合成，中國）、實時熒光定量試劑盒（Takara，大連寶生物工程有限公司，中國）。

1.3 小型豬PDLSCs原代培養 3%戊巴比妥鈉30 mg/kg，鹽酸氯胺酮15～20 mg/kg聯合麻醉小型豬，碘伏消毒術區，鋪巾，拔除小型豬前牙4顆，使用含1,000 U/mL雙抗無菌PBS沖洗離體牙3次，手術刀片刮取根中1/3牙周膜組織，將牙周膜組織修剪為1 mm2大小組織塊，均勻鋪在25 cm2細胞培養瓶底，小心加入1 mL DMEM培養基（含10%胎牛血清，200 mmol/L谷氨酰胺，100 μmol/L L-α-磷酸抗壞血酸），置37 ℃、體積分數為0.05 CO2培養箱中培養，次日補液至5 mL，換液1次/3 d，待細胞變形游出，貼壁，增殖至80%左右時，胰蛋白酶消化傳代。

1.4 小型豬PDLSCs有限稀釋法分離純化 收集原代培養擴增的小型豬PDLCs對數期培養上清液1,500 r/min離心10 min，與新配置培養基以1∶1比例混合，制備適應性培養基。取對數期第一代PDLCs，調整細胞濃度為10～15個/mL，接種于96 孔板，常規培養4 h后鏡檢，標記單個細胞孔，繼續培養，換液1次/5 d，培養14 d至有細胞克隆形成（≥50個細胞為克隆形成判定標準）胰蛋白酶-EDTA消化傳代，擴增培養，純化后的PDLSCs擴增冷凍備用。

1.5 小型豬PDLSCs鑒定 取純化后第三代對數期PDLSCs，棄去培養液，PBS沖洗3次，4%多聚甲醛固定30 min，PBS蕩洗3 次，3%雙氧水處理15 min，PBS蕩洗3次，山羊血清工作液封閉30 min，傾去。滴加稀釋濃度為10 μg/mL的小鼠抗人STRO-1一抗，濕盒4 ℃孵育過夜。37℃復溫1 h，PBS蕩洗3次，加FITC標記的山羊抗小鼠二抗，37 ℃孵育1 h，PBS蕩洗3次，熒光顯微鏡鏡檢。對照組以PBS代替一抗，其余操作步驟不變。免疫細胞化學法行波形蛋白（Vimentin）、角蛋白（pan cytokeratn，PCK）免疫組織化學染色，DAB顯色液顯色，鏡檢觀察染色結果。對照組以PBS代替一抗，其余操作步驟不變。

1.6 實驗分組 參照Chadipiralla等學者研究方法［11］根據RA終濃度不同將實驗組分為RA 0.5 μm組、1 μm組、2 μm組。對照組不添加任何誘導劑。

1.7 RA誘導小型豬PDLSCs成骨分化 取對數期第三代PDLSCs接種于35 mm細胞培養皿內，常規培養，待細胞匯合達70%左右棄去培養液，更換成骨誘導液（低糖DMEM，10%胎牛血清，1 μmol/L維甲酸，100 μmol/L抗壞血酸，200 mmol/L谷氨酰胺，10 mmol/L β-甘油磷酸鈉），細胞分三組分別加入誘導劑RA 0.5 μm、1 μm、2 μm，每3 d更換成骨誘導液。對照組細胞做常規培養。

1.8 小型豬PDLSCs成骨誘導鑒定 （1）堿性磷酸酶（Akaline Phosphatase，ALP）染色：PDLSCs成骨誘導至第14天，棄去培養液，PBS沖洗2次，加入固定液覆蓋培養皿皿底，室溫下固定3 min，吸去固定液，PBS沖洗2次，加入底物應用液，37 ℃孵育15 min，蒸餾水洗凈，蘇木素復染襯核3 min，鏡檢。（2）茜素紅染色：PDLSCs誘導至第21天，棄去培養液，PBS沖洗兩次，4%多聚甲醛固定1 h，茜素紅染液處理10 min，蒸餾水沖洗，鏡檢。

1.9 ALP活性檢測 取對數期第三代小型豬PDLSCs，以每孔2,000個細胞接種于96孔板內，培養48 h后更換成骨誘導液，誘導組依據各誘導劑終濃度不同進行分組（RA 0.5 μm組、1 μm組、2 μm組），對照組不添加成骨誘導液，每組設置5個復孔（n=5），換液1次/3 d，于誘導第14天檢測各組細胞ALP活性，提取細胞蛋白質，BCA法定量分析各孔待測樣本蛋白質含量。

1.10 Real-Time PCR定量分析ALP、骨鈣素（Osteocalcin，OCN）、骨橋蛋白（Osteopontin，OPN）、I型膠原（Type I collagen，Col I）基因表達 取對數期第三代PDLSCs接種于6 cm細胞培養皿，成骨誘導至第21天時提取細胞總RNA，反轉錄cDNA儲存備用，每組實驗樣本含量為5（n=5）。以GAPDH為內參基因，豬GAPDH、ALP、OCN引物序列參考WANG等［12］的報道，豬OPN、Col I引物委托上海生物工程有限公司設計，各基因引物序列如下：

表1 各基因引物序列

Real-Time PCR體系按順序加入SYBR PreMix 10 μL，上下游引物各0.4 μL，cDNA模板2 μL，無菌去離子水補足至總體系20 μL；陰控以無菌去離子水代替cDNA模板，其他成分不變；GAPDH為內參基因。Real-Time PCR反應條件為95 ℃ 30 sec，95 ℃5 sec，60 ℃ 20 sec，循環45 次，繪制溶解曲線，65 ℃～95 ℃ 1 min，分別檢測ALP、OCN、OPN、Col I基因表達水平。

1.11 統計學方法 采用SPSS 17.0統計軟件包。ALP活性測試，成骨相關基因表達對比分析，數據為多組間樣本均數比較，使用單因素方差分析進行處理。兩組間樣本均數比較，方差齊使用t檢驗，如方差不齊則使用t’檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 小型豬PDLSCs原代培養及有限稀釋法分離純化 組織塊法培養7 d左右可見細胞從組織塊中變形“爬出”，細胞形態為短梭形、多角形或星形，胞漿豐富，細胞核居中，見圖1。繼續培養，原代細胞呈旋渦狀生長，增殖速度緩慢。有限稀釋法篩選細胞可見單個孔細胞在24 h后開始增殖，約10 d左右出現克隆形成，細胞呈集落樣生長，形態與原代培養牙周膜細胞相類似，見圖2。

圖1 小型豬牙周膜細胞P0原代培養7 d（×50）

圖2 純化后小型豬牙周膜干細胞P3細胞 3 d（×50）

2.2 小型豬PDLSCs鑒定 純化后小型豬PDLSCs行STRO-1免疫熒光染色，倒置熒光顯微鏡下觀察可見細胞呈現綠色熒光，表現為細胞膜表達，見圖3。陰性對照組未見熒光染色。經免疫細胞化學法檢測Vimentin，鏡下可見細胞被染為棕褐色，為陽性表達，見圖4，對照組陰性表達。PCK為陰性表達，見圖5。

圖3 小型豬PDLSCs STRO-1免疫熒光染色（×100）

圖4 小型豬PDLSC Vimentin免疫細胞化學染色（×100）

圖5 小型豬PDLSC PCK免疫細胞化學染色（×100）

2.3 小型豬PDLSCs 成骨誘導 各誘導組PDLSCs添加誘導劑后，細胞增殖速度放緩或停止增殖，形態由短梭形變為多邊形，誘導14 d左右可見細胞聚集成團塊，核偏向一側，培養皿底出現肉眼可見的礦化結節，并隨培養時間的增長而變大，數量增多。對照組細胞形態無明顯改變，仍為短梭形或多角形，細胞出現接觸性抑制。（1）ALP染色結果：各誘導組PDLSCs誘導至第14天，使用ALP染色試劑盒染色，各誘導組細胞染色結果均為強陽性，表現為胞漿內出現咖啡色或褐色顆粒。對照組細胞為陰性。（2）茜素紅染色：各實驗組誘導PDLSCs 21 d后，行茜素紅染色，誘導組培養皿底可見紅色沉淀，呈現為“流沙”狀改變，對照組無明顯變化。鏡下觀察各實驗組細胞均可見散在礦化區域被染為紅色結節狀。對照組未見陽性染色。

2.4 ALP活性檢測 PDLSCs成骨誘導14 d后，相對于對照組，RA組細胞ALP活性較對照組明顯上調（P＜0.001），ALP活性隨RA濃度增高而增加（P＜0.001），呈現劑量依賴關系（見圖6）。

圖6 成骨誘導14 d ALP活性檢測結果

2.5 Real-Time PCR定量分析ALP、OCN、OPN、Col I基因表達 小型豬PDLSCs成骨誘導21 d后，各誘導組細胞ALP基因表達明顯上調，均高于對照組（P＜0.001），并且ALP基因表達上調水平隨RA濃度增高而增加（P＜0.03）。RA 0.5 μm組、1 μm組、2 μm組ALP基因表達分別是對照組的4.11、6.41、10.07 倍。相對于對照組，RA各誘導組細胞OPN基因表達明顯上調（P＜0.001），OPN基因表達隨RA濃度增高而增高，但RA 1 μm組與RA 2 μm組OPN表達差異無統計學意義（P=0.065）。RA 0.5 μm組、1 μm組、2 μm組OPN基因表達分別是對照組的2.71、3.94、4.08 倍。RA各誘導組OCN基因表達明顯上調（P＜0.001），OCN基因表達上調水平隨RA濃度增高而增高（P＜0.001），RA 0.5 μm組、1 μm組、2 μm組OCN基因表達分別是對照組的2.35、2.85、5.21倍。RA 0.5 μm組細胞ColI基因表達下調，但差異無統計學意義（P=0.239），RA 1 μm組、RA 2 μm組ColI基因表達均高于對照組和RA 0.5 μm組（P＜0.018），RA 2 μm組細胞ColI基因表達高于RA 1 μm組，但差異無統計學意義（P=0.246）。RA 0.5 μm組、1 μm組、2 μm組ColI基因表達分別是對照組的0.93、1.18、1.27倍。

3 討論

研究發現在多種成熟的組織內如牙髓、脂肪、肝臟、骨髓、神經、牙周膜等組織［4，12-16］可分離出具有可多方向誘導分化能力的細胞，稱為成體干細胞。BYOUNG等［4］將人PDLSCs移植于牙周骨組織缺損區域內，PDLSCs可促進牙周組織再生，表明PDLSCs可能是促進牙周組織再生的種子細胞之一。

STRO-1是常被用于鑒定充質來源成體干細胞的表面標記物之一［4，17］。本研究使用有限稀釋法成功分離純化小型豬PDLSCs單克隆細胞株，免疫熒光法檢測純化后的小型豬PDLSCs結果發現STRO-1陽性表達，表明有限稀釋法純化后的PDLSCs具有成體干細胞的特性。Vimentin為陽性表達，PCK陰性表達，表明純化后的小型豬PDLSCs為間充質來源，無外胚層及上皮細胞污染。

ALP是干細胞成骨分化早期標志物［18］，是成骨細胞重要的免疫表型之一。本研究分別使用0.5 μm、1 μm、2 μm三種濃度的RA誘導小型豬PDLSCs 14 d，使用ALP染色試劑盒對其進行檢測發現各誘導組細胞ALP染色呈強陽性，而對照組為陰性。在成骨誘導第21天，茜素紅染色結果顯示，誘導組均為陽性染色，對照組為陰性。表明小型豬PDLSCs在各濃度RA誘導下，成骨活性相對于對照組明顯增強，出現成骨方向分化。本研究檢測成骨誘導14 d各組細胞ALP活性結果顯示，實驗組細胞ALP活性與RA濃度呈現劑量依賴關系，ALP是衡量成骨能力的指標之一，可以認為2 μm組RA對于小型豬PDLSCs誘導成骨的能力更強，這一結果與以對脫落乳牙干細胞及牙髓干細胞的成骨誘導的研究結果相類似［11，19］。

OPN是成骨細胞重要免疫表型之一，亦可作為成骨細胞分化的重要標志［19-20］。OCN是成骨細胞在骨礦化峰期之后才出現積聚，因此，可以認為OCN是一種晚期并且具有高度特異性的成骨標記物［21］。Col I作為成骨早期標記物之一，常被用于鑒定成骨細胞以及干細胞成骨誘導分化的檢測。在小型豬PDLSCs成骨誘導第21天時，使用Real-time PCR方法檢測各組細胞ALP、OPN、OCN、Col I基因表達，結果發現ALP、OCN基因表達隨RA濃度增加而上調，呈現劑量依賴關系。OPN基因表達水平隨RA濃度增高而增高，但RA 1 μm組與RA 2 μm組無統計學差異。ColI基因明顯上調，Col I基因表達水平隨RA濃度增加升高，但RA 1 μm與RA 2 μm兩組之間無統計學差異。RA 0.5 μm組細胞Col I基因表達相對對照組出現下調，但與對照組比較無統計學差異。CHADIPIRALLA等［11］應用RA分別誘導人脫落乳牙干細胞和人PDLSCs，結果發現RA明顯下調Col I基因表達水平，與本研究結果不同，這可能與細胞來源不同和所使用的培養基不同有關，前者無血清培養基，可能無法提供足夠的營養以合成Col I，從而抑制了Col I基因的表達。綜上所述，三種濃度的RA均可誘導小型豬PDLSCs分化為成骨樣細胞，RA可能是一種更優秀的成骨誘導劑，其成骨誘導能力在一定范圍內呈現劑量依賴關系，但其成骨誘導信號轉導通路仍有待于進一步研究。

目前慢性牙周炎的治療方法仍難以有效獲得牙周組織再生，組織工程學原理為牙周組織再生提供了新思路。RA是維生素A類的衍生物，對細胞增殖、分化、凋亡以及胚胎發育起著非常重要的作用，可使用生物制藥的工藝人工合成，具有較好的生物安全性，成本低廉，臨床應用經驗更豐富，其能否用于聯合PDLSCs修復較大范圍骨組織缺損，能否作為藥物應用于牙周炎的治療，具有較好的臨床研究前景，本研究為其提供了新思路和動物實驗的基礎。