LC對非小細胞肺癌放療增敏的作用及其機制研究

陳素梅 朱魯程 許雅思 張仕蓉 馬勝林

肺癌是世界范圍內最常見的惡性腫瘤之一，居癌癥相關死亡的首位，嚴重威脅人們的生命和財產安全［1］。目前，放射治療（放療）仍是肺癌最重要的治療手段之一，但由于放射治療的相關毒性及耐藥等多種因素，放療的療效仍有較大的局限性，因此，增強放療的敏感性，改善放療抵抗，具有重要的現實意義。近年來，傳統中藥細梗香草的抗腫瘤作用受到人們的廣泛關注［2-4］。本研究小組對細梗香草的抗腫瘤作用及其分子機制進行了系統研究。既往的研究成果表明：細梗香草總皂苷（LC）對肺癌細胞具有抑制增殖、促進凋亡的作用，這些抗腫瘤作用可能與誘導細胞內活性氧（ROS）爆發，激活線粒體凋亡通路相關［4］。同時還對細梗香草的抗腫瘤潛能進行了體內研究，發現LC能夠顯著抑制體內腫瘤的生長，且對肝腎功能無明顯毒副作用［4］。然而，目前有關LC是否具有放療增敏的潛能尚不清楚。本研究擬通過研究LC聯合放療對非小細胞肺癌細胞增殖、凋亡等影響，明確LC的放療增敏作用，并對其可能涉及的分子機制進行初步探索，為LC與放療在肺癌細胞中的聯合應用提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 主要細胞株、試劑和儀器 肺癌細胞株H460、PC-9、H1299由本研究所（杭州市第一人民醫院轉化醫學中心）保存，LC：由浙江大學生物醫學工程與儀器學院生物醫學工程學系田景奎教授友情提供；Annexin-FITC/PI凋亡試劑盒購自杭州聯科生物公司，DNA-pKcs抗體購自Millipore公司、Ku80、RAD50購自Santa Cruz，GAPDH、β-actin購自Cell Signaling Technology公司；細胞增殖檢測試劑盒（MTS）Promega，lipfectamine 2000 transfection reagent購自Invitrogen（gibco）公司，流式細胞儀由FACSan becton Dickson制造，酶標儀由Bio-Rad公司制造。

1.2 實驗方法 （1）MTS法檢測細胞增殖：取對數生長期肺癌細胞（H460、PC-9、H1299），3,000個細胞/孔接種于96孔板，加入不同濃度的LC（0.5、1、2、4、6、8、16及32 μg/mL），共培養12 h、24 h或48 h，MTS法檢測細胞存活率，存活率（%）=（As-Ab）/（Ac-Ab）×100%，并繪制細胞生長曲線。（2）克隆形成實驗［放射增敏比（SER）和聯合指數（CI）］：根據MTS結果選取H460和PC-9兩種細胞后續實驗，不同濃度的LC預處理48 h后，分別予不同劑量放療（0、1、2、4、6 Gy），將照射好的細胞以500/孔的細胞密度接種在六孔板中，于37 ℃含5%的CO2培養箱中培養7～14 d，以肉眼能見克隆，且克隆未融合為佳，固定、染色，計數，細胞數目＞50個計作為1個克隆，根據單擊多靶模型作出劑量-細胞存活率曲線并計算放射增敏比（SER）和LD50。根據LC和放療的LD50，選取持續劑量的LC和放射線聯合作用于H460和PC-9細胞，根據克隆形成數，制作CI曲線，具體見CHOU等［5-6］的研究。（3）流式細胞術Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡：H460和PC-9兩種細胞以5×105個細胞/孔接種于6孔板，待細胞完全貼壁后，加入細梗香草（1 μg/mL）預處理48 h，以2 Gy劑量的放療24 h后，收集（1～5）×105個細胞，Annexin V-FITC/PI試劑盒FCM檢測細胞凋亡情況。（4）蛋白印跡法和小干擾RNA方法檢測細梗香草放療增敏的分子機制：蛋白印跡法：RIPA裂解提取總蛋白，BCA測定蛋白濃度，蛋白變性，電泳，孵育一抗、二抗，掃描，并采用ImageJ分析軟件處理圖像。根據蛋白印跡法結果選取核心蛋白分子DNA-PKcs，si-DNA-PKcs下調肺癌細胞蛋白表達，再行克隆形成實驗。siRNA的合成：由Qiagen公司設計靶向DNA-PKcs基因的siRNA序列，作用于DNA-PKcs的催化活性區（11637～11655）。正義鏈：5’GATCCCGGGCGCTAATCGTACTGAATTCAAGAGAIT CAGTACGATTAGCGCCCTTITAAA-3’；反義鏈：3’GGC CCGCGArrAGCAIGACRRAAGITrCTCTAAGTCATGCTAA TCGCGGGAAAA AACCTTTTCCA-5’，采用化學合成的方法合成siRNA；轉染并檢測轉染效率：具體過程詳見Lip2000的說明書，Western blot檢測DNA-PKcs 蛋白表達水平；克隆形成實驗分組情況：A.空白對照組：未經任何處理；B.陰性對照組：采用亂碼siRNA轉染；C.si-DNA-PKcs；D.實驗組：培養液中含15 nmol/L 靶向DNA-PKcs的siRNA，然后再予細梗香草和放療，克隆形成實驗方法同前計算出集落形成率。

1.3 統計學方法 采用SPSS 18.0統計軟件包。計量資料以（±s）表示，組間比較采用t檢驗；計數資料以n或%表示，多組間比較采用one-way方差分析，組間比較采用χ2檢驗。均以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 LC抑制肺癌細胞株增殖和增強放療敏感性 為檢測LC對人肺癌H460、PC-9和H1299細胞增殖的影響，采用不同濃度的LC作用肺癌細胞，分別共培養12 h、24 h、48 h，MTS結果顯示：LC對三株細胞均具有增殖抑制的作用，且抑制作用隨濃度增加和作用時間的延長而加強，即呈劑量和時間依賴性（圖1A）。根據MTS藥物毒性實驗的結果，選取0.5 μg/mL、1 μg/mL進行本部分研究。圖1B示H460、PC-9和H1299細胞中LC濃度為1 μg/mL時放射增敏指數分別為（1.67±0.22）、（2.07±0.34）和（2.05±0.29），SER值均＞1.0，故LC對人肺癌細胞具有放射增敏作用。

圖1 LC抑制肺癌細胞株增殖和增強放療敏感性曲線圖。A. LC抑制三株肺癌細胞增殖曲線圖；B. LC聯合放療在三株肺癌細胞中的SER值曲線圖

2.2 LC與放療聯合具有協同增敏作用 CI是檢測兩種治療相互作用的常用指標，其中CI＜1.0、CI=1.0和CI＞1.0分別代表二者有協同作用、相加作用和拮抗作用。本研究通過檢測不同濃度的LC（1、2、4、6 μg/mL）和不同劑量的放射治療（1、2、4、6 Gy）對H460、PC-9細胞集落形成率的影響，獲得二者的半數致死量（LD50），根據LD50，選取持續劑量的LC和放療聯合作用于H460和PC-9細胞，制作CI曲線，從圖2B可以看出，在H460細胞中，LC濃度＜（4.84±0.13）μg/mL和放療劑量＜（4.99±0.05）Gy時，CI＜1；在PC-9細胞中，LC濃度＞（0.128±0.012）μg/mL和放療劑量＞（0.168±0.03）Gy時，CI＜1，二者聯合有協同作用。圖2C為不同抑制率時兩株細胞的CI和衰減指數（DRI）數值。因此，本部分從單個細胞的增殖能力進一步證實LC在肺癌細胞中具有顯著的放療增敏作用。

圖2 LC聯合放療在肺癌細胞中的聯合指數圖。A. LC和放療對H460和PC-9細胞克隆形成率的影響；B. LC聯合放療在兩株細胞中的CI曲線；C. 不同抑制率時兩株細胞的CI和衰減指數（DRI）具體數值

2.3 FCM檢測LC聯合放療對肺癌細胞凋亡的影響 如圖3A、B所示，H460經不同處理后各組細胞凋亡率分別為3.05%±0.92%，8.2%±0.99%、15.2%±2.97%、30.45%±1.93%，聯合組凋亡率顯著高于單純放療組（P＜0.05）。在PC-9細胞中對照組、LC組、放療組、聯合組凋亡率分別為1.10%±1.13%、8.55%±8.2%、14.55%±15.2%、30.55%±30.45%，聯合組也顯著優于單純放療組，差異有統計學意義（P＜0.05）。因此，細梗香草增強放療誘導的細胞凋亡效應。

圖3 LC增強放療誘導的肺癌細胞的凋亡。A. LC增強放療對肺癌細胞的殺傷作用的流式細胞術圖；B. FCM檢測結果的具體凋亡率

2.4 LC抑制DNA損傷修復機制 為探索LC的放療增敏分子機制，本研究對DNA損傷修復相關蛋白進行了檢測。如圖4A所示Western blot結果：LC可以顯著降低DNA-PKcs、Rad50、Ku80和Ku70的蛋白表達水平，這些均是NHEJ信號通路中的重要因子。本研究還利用小干擾RNA技術下調NHEJ信號通路中的關鍵分子DNA-PKcs表達，如圖4B所示肺癌細胞（H460和PC-9）中Si-DNAPKcs組DNAPKcs表達水平較質粒對照組顯著降低。下調Si-DNAPKcs蛋白后，再予檢測細梗香草及放療對肺癌細胞克隆形成的影響，圖4C所示si-control處理H460細胞后，LC可顯著增強放療抑制的細胞克隆形成率，而下調Si-DNA-PKc蛋白后，LC對放療無明顯的增敏作用。同樣，如圖4D所示在PC-9細胞獲得類似的結果。因此，可以推測LC通過調控NHEJ通路中的DNA-PKc蛋白發揮放療增敏作用。

圖4 LC通過調控NHEJ通路中的DNA-PKc蛋白發揮放療增敏作用。A. LC調控DNA損傷修復相關蛋白表達的Western blot條帶；B. 小干擾RNA技術下調DNA-pKcs蛋白表達效率；C. 下調H460細胞DNA-pKcs蛋白表達后，LC對放療增敏作用；D. 下調PC-9細胞DNA-pKcs蛋白表達后，LC對放療增敏作用

3 討論

本研究結果表明：傳統中藥LC顯著增強非小細胞肺癌放療敏感性。眾所周知，腫瘤細胞對各種原因引起的損傷均有一套完整的修復系統，通過啟動直接修復、堿基切除修復、核苷酸切除修復、堿基錯配修復、同源重組修復和非同源的末端連接六條通路來修復不同形式的損傷。其中同源重組修復和非同源的末端連接通路專門修復DNA雙鏈斷裂（DSB）。DSB是放射線引起的一種細胞致死性損傷，細胞發生DSB后，會產生一系列復雜反應，從而出現DSB修復、細胞周期阻滯或細胞凋亡，其中任何一個環節受到影響，均可能改變腫瘤細胞對放射線的敏感性［7］。哺乳動物細胞中DSB的修復方式主要包括同源重組修復（HDR）、經典非同源末端連接（NHEJ）、單鏈退火修復（SSA）和非經典非同源末端連接（ALT-NHEJ），各自通過募集不同的蛋白來完成修復，其中非同源末端連接是最主要的方法，其對維持基因組的完整性和正確性非常重要［8］。本研究的機制部分表明：細梗香草通過抑制NHEJ修復能力，而抑制放療引起的DNA損傷修復，進而發揮放療增敏作用。

非同源末端連接不依賴于同源DNA序列（通常為姐妹染色體）為模板，能直接連接受損DNA的兩個末端，在此過程中Ku70/80異質二聚體，DNA依賴性蛋白激酶（DNA-PKcs），核酸酶Artemis（ATM），DNA修復蛋白XRCC4，DNA連接酶IV和XLF等核心因子共同完成這一復雜的修復過程［9-10］。DNA依賴性蛋白激酶（DNA dependent protein kinase，DNA-PKcs）是一個由3個亞基組成的絲/蘇氨酸蛋白激酶，屬于磷脂酰肌醇-3激酶相關激酶家族（PI3K），是非同源末端連接DNA損傷修復過程中的關鍵蛋白激酶，并決定著該通路的整個進程。另外，Rad50、Ku80和Ku70都是NHEJ過程中的核心因子［11］。作者的Western blot結果也證實LC可以顯著降低DNA-PKcs蛋白表達水平，以及細梗香草通過降低Rad50、Ku80和Ku70等NHEJ過程中的核心因子的表達水平進一步干擾修復。

因此，從本研究的研究結果作者推測：LC可能通過抑制非小細胞肺癌DNA分子NHEJ修復能力增強放射治療的敏感性，但動物體內是否具有類似的生物學功能，尚需對荷瘤小鼠進行體內研究，本研究團隊將對此進行探索，為細梗香草的放療增敏作用提供更多的證據。致謝：

感謝美國杜克大學陳旭峰老師對本研究的技術支持和英文修正。