同源異型盒蛋白轉(zhuǎn)錄因子-2在前列腺癌中表達(dá)及臨床意義

胡俊彪 吳慧玲 張春霆

前列腺癌是我國老年男性常見的惡性腫瘤之一［1］。血清前列腺特異性抗原（PSA）的應(yīng)用使前列腺癌診斷和隨訪有了重要的參考指標(biāo)，但臨床中部分前列腺癌患者疾病進(jìn)展并未發(fā)現(xiàn)血清中PSA異常增高［2-3］。眾所周知，前列腺癌病因不明，為了找尋前列腺癌相關(guān)標(biāo)志物，近年來，前列腺癌患者的液體活檢和前列腺癌新的血清標(biāo)志物的尋找成為研究焦點(diǎn)。有部分研究結(jié)果顯示同源異型盒蛋白轉(zhuǎn)錄因子-2（EN2）在前列腺癌組織和尿液中異常［4-5］，是否與前列腺癌生化復(fù)發(fā)和預(yù)后有關(guān)尚未闡明。本研究采用免疫組織化學(xué)SP法對(duì)EN2蛋白在前列腺癌中表達(dá)及與前列腺癌臨床病理和五年生化復(fù)發(fā)和總體生存之間的關(guān)系進(jìn)行研究，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年1月至2017年12月本院泌尿外科經(jīng)病理確診的81例前列腺癌和同期45例前列腺增生患者組織標(biāo)本。其中前列腺癌患者年齡61.5～80.3歲，中位年齡（71.8±2.5）歲；前列腺增生年齡62.0～81.4歲，中位年齡（71.5±2.6）歲；參照2002版美國癌癥聯(lián)合委員會(huì)（AJCC）前列腺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，臨床分期Ⅰ～Ⅱ期45例，Ⅲ～Ⅳ期36例。分化程度按Gleason評(píng)分：Gleason≥7分39例，Gleason＜7分42例；所有患者病理標(biāo)本留取前未采用放療、化療及雄激素阻斷內(nèi)分泌治療。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，均知情同意并簽訂同意書。

1.2 方法 實(shí)驗(yàn)操作參照免疫組化SP法實(shí)驗(yàn)試劑盒說明書進(jìn)行。石蠟標(biāo)本包埋組織，3 μm切片，脫蠟水化后微波修復(fù)抗原；加入稀釋1∶100的兔抗人EN2多克隆抗體（Abeam公司，UK#28731）；4 ℃過夜，辣根過氧化物酶和抗兔IgG（Maixin-bio公司，鼠抗人多克隆抗體：KIT-5003），DAB顯色及蘇木素復(fù)染，結(jié)果棕色為陽性染色。以PBS代替一抗作陰性對(duì)照，用已知EN2陽性切片作陽性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判定 取5個(gè)高倍視野進(jìn)行觀察每例切片（×200），觀察細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果的蛋白分布情況和陽性細(xì)胞比率。EN2蛋白表達(dá)以細(xì)胞質(zhì)和（或）細(xì)胞核染成棕色為陽性細(xì)胞。按以下標(biāo)準(zhǔn)判定EN2蛋白表達(dá)為陽性和陰性表達(dá)：陽性細(xì)胞率＞25%為陽性表達(dá)，陽性細(xì)胞率≤25%為陰性表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件。率的比較采用χ2檢驗(yàn)或精確概率法進(jìn)行分析，隨診臨床PSA檢測(cè)結(jié)果和總體生存進(jìn)行Kaplan-Meier生存分析法分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果 前列腺癌EN2蛋白增高表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)及部分細(xì)胞核中，BPH組織中EN2蛋白少量表達(dá)（見下圖1/2）。

圖1 前列腺增生中EN2蛋白表達(dá)（HE×200）

圖2 前列腺癌中EN2蛋白表達(dá)（HE×200）

2.2 EN2在前列腺癌中的表達(dá)與前列腺臨床病理關(guān)系 EN2在前列腺癌及BPH組織中表達(dá)陽性率分別為72.83%和11.11%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。前列腺癌中EN2表達(dá)與Gleason評(píng)分、臨床分期相關(guān)，前列腺癌Gleason＜7分陽性表達(dá)42例，陽性表達(dá)率為59.52%；Gleason≥7分39例，陽性表達(dá)率為87.18%。臨床Ⅰ～Ⅱ期和Ⅲ～Ⅳ期陽性率分別為62.22%和86.11%（見表1）。

2.3 EN2陽性表達(dá)與前列腺癌五年生化復(fù)發(fā)之間的關(guān)系 Kaplan-Meier生存分析結(jié)果生存曲線可見EN2陰性表達(dá)復(fù)發(fā)率較EN2陽性低，結(jié)果發(fā)現(xiàn)42例生化復(fù)發(fā)的前列腺癌中EN2陽性表達(dá)37例，陽性表達(dá)率為88.10%，39例無生化復(fù)發(fā)的前列腺癌中陽性表達(dá)率為56.41%；兩者相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖3）。

圖3 EN2陽性表達(dá)與前列腺癌五年生化復(fù)發(fā)關(guān)系曲線圖

2.4 EN2陽性與前列腺癌五年生存之間的關(guān)系 EN2陽性表達(dá)在46例前列腺癌中生存40例，陽性表達(dá)率為86.96%，無生存前列腺癌中陽性表達(dá)為19例，陽性表達(dá)率為54.29%；兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Kaplan-Meier生存分析繪制生存曲線可見EN2陽性表達(dá)的總體死亡率較EN2表達(dá)陰性高（圖4）。

圖4 EN2陽性與前列腺癌五年生存關(guān)系曲線圖

3 討論

EN2是近年來發(fā)現(xiàn)的在胚胎發(fā)育過程中起重要作用的癌基因［6］，其翻譯后的蛋白質(zhì)是由Engrailed-2基因編碼的非I類蛋白質(zhì)，其中包含了一段由60個(gè)氨基酸組成的高度保守蛋白結(jié)構(gòu)域［7］，絲/蘇氨酸蛋白激酶2（CK2）對(duì)EN2進(jìn)行分泌和轉(zhuǎn)移的調(diào)控。EN2是Wnt信號(hào)通路中的關(guān)鍵因子，經(jīng)典Wnt信號(hào)通路下游有Dsh、糖元合成酶激酶3、高遷移率蛋白盒基因和B-環(huán)連蛋白，Wnt經(jīng)典信號(hào)通路中胞質(zhì)內(nèi)Dsh作用B-catenin，使細(xì)胞質(zhì)中B-catenin累積，進(jìn)入細(xì)胞核與T細(xì)胞作用調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄；B-catenin的激活促進(jìn)下游靶基因細(xì)胞周期素D1（CyelinDl）、原癌基因（c-Myc）等表達(dá)從而引起腫瘤細(xì)胞增殖。

研究發(fā)現(xiàn)EN2異常突變會(huì)誘發(fā)腫瘤發(fā)生和進(jìn)展［8］，本研究采用免疫組化SP法對(duì)EN2在前列腺癌中的表達(dá)狀況和其與前列腺癌的5年生化復(fù)發(fā)和5年生存之間的關(guān)系進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EN2在前列腺癌呈現(xiàn)增高表達(dá)，尤其是在Gleason≥7分高于Gleason＜7分患者中，且EN2增高表達(dá)與前列腺癌5年生化復(fù)發(fā)和五年生存相關(guān)；這結(jié)果與先前有研究EN2與乳腺癌分化程度相關(guān)類似［9］。至于EN2在乳腺癌中作用機(jī)制研究，在對(duì)靶向干擾EN2后，可發(fā)現(xiàn)乳腺癌細(xì)胞增長減慢［10］；也有學(xué)者對(duì)EN2在前列腺癌患者尿液中水平進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)尿液中EN2水平增高［11］，且尿液中增高的EN2對(duì)前列腺癌陽性預(yù)測(cè)敏感性和特異性分別為66%和90%［8］，但該研究未對(duì)患者隨訪結(jié)果進(jìn)行研究。EN2在前列腺癌中的作用機(jī)制是否通過經(jīng)典Wnt信號(hào)通路發(fā)揮作用，還是有其他作用途徑和方式，有待進(jìn)一步研究證實(shí)。雖然本實(shí)驗(yàn)對(duì)前列腺癌中EN2的表達(dá)和前列腺癌的預(yù)后進(jìn)行了研究，結(jié)果表明EN2在前列腺癌發(fā)生進(jìn)展中有重要作用，另外需要進(jìn)一步在細(xì)胞學(xué)研究中對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行深入研究，以明確其在前列腺癌中的作用機(jī)制。

總之，EN2在前列腺癌中增高表達(dá)，其增高表達(dá)與前列腺癌臨床病理相關(guān)，與前列腺癌患者五年生化復(fù)發(fā)和總體生存有關(guān)，但EN2在前列腺癌中作用機(jī)制比較復(fù)雜，要了解其確切的作用機(jī)制，尚需要對(duì)EN2在細(xì)胞基礎(chǔ)上進(jìn)行作用途徑及作用方式的研究。