基于序列的多重聚合酶鏈反應對獻血者HLA/HPA基因分型

陳星星 倪修文 李璋 許先國

在醫學實踐中，成分輸血技術的應用范圍不斷提升，血小板輸注已發展為治療血小板減少以及功能障礙所致疾病的關鍵療法。然而，在血小板輸注次數增加的情況下，患者常會面臨血小板輸注無效（platelet transfusion refractory，PTR）的問題［1］，導致PTR重要原因可分為免疫性因素及非免疫性因素。免疫性因素主要包括人類白細胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）抗體、血小板同種抗原（human platelet antigen，HPA）抗體、CD36抗體等。據調查顯示，免疫性血小板抗體造成的PTR占18%～25%［2］，HLA和HPA基因型的配合性輸注是有效解決PTR的重要方式之一［3］。為解決PTR的發生，需要分析本地區血小板獻血者HLA-A、B及HPA基因分布特點，并建立相應的區域性血小板供應庫，為患者提供與其抗原相匹配的單采血小板，從而有效降低PTR的發生風險。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2020年1月至2021年12月期間5,411例獻血者樣本進行HLA-I類（A、B）基因測序，對其中199例單采血小板獻血者樣本進行HPA1-6、15、21w系統基因分型研究。納入標準：所有參與者須滿足《獻血者健康檢查要求》，年齡在18～45歲之間，血小板捐獻次數≥2次。此項研究已通過嘉興市中心血站倫理審查委員會審批，均已簽署知情同意書。

1.2 主要試劑與儀器 人類基因組DNA提取試劑由美國Roche公司提供；HLA-A、B基因分型試劑由中國臺灣TBG公司提供；HPA基因分型試劑由美國應用生物系統公司提供。9700型PCR擴增儀由美國ABI公司提供；凝膠成像系統由美國BIO-RAD伯樂公司提供；電泳儀由美國BIO-RAD伯樂公司提供；ABI 3730基因測序儀由美國ABI公司提供。

1.3 DNA提取 留取獻血者的血液標本5 mL，采用EDTA-Na2進行抗凝，通過MagNA Pure 96全自動DNA提取系統（購自美國Roche公司）。實驗中選定提供方為美國Roche公司的DNA提取試劑盒（MagNA Pure 96DNA and Viral NA Large Volume Kit）開展DNA提取工作，調整DNA濃度為30～50 ng/μL，純度A260/A280為1.6～2.0，嚴格依據說明書操作。

1.4 HLA-I類基因分型 對入庫的血小板捐獻者分別對HLA-A、HLA-B基因進行分型，采取multiplex PCR-SBT法對HLA-I類基因（HLA-A和HLA-B位點）進行高分辨分型檢測，使用中國臺灣TBG公司提供的HLA檢測試劑盒（批號為：A位點AA19091K、B位點AB19091K）對HLA-A、HLA-B基因的第2-4外顯子進行測序，測序反應產物經純化后，上ABI 3730基因測序儀進行電泳分析，利用uTYPE7.3分析軟件指定標本的HLA-A、HLA-B基因型。

1.5 HPA擴增和基因分型 HPA擴增和基因分型方法參照文獻［2］執行：PCR擴增在ABI 9700熱循環儀上進行，擴增條件為95 ℃5 min，95 ℃30 s，60 ℃30 s，72℃1 min，共30個循環；72 ℃10 min。2 μL擴增產物通過電泳在2%瓊脂糖凝膠中用0.5 μg/mL乙錠溴化物染色并通過紫外光進行可視化分析。在ABI 3730 DNA分析儀上處理序列反應產物，并使用SeqScape 2.5軟件（美國生物應用系統公司）分析序列數據。

1.6 統計學分析 HLA和HPA基因頻率計算公式：基因頻率=基因數/總基因數；基因型頻率=基因型數/總基因型數。采用SPSS25.0進行統計學分析。aa或bb期望值=p 2*N或q 2*N，ab期望值=2*pq*N（p和q分別為a和b的基因頻率）。基于群體遺傳Hardy-Weinberg（H-W）平衡這一角度，來驗證是否符合H-W平衡。具體來看，計算各系統對偶抗原不配合概率（血小板隨機輸注HPA錯配概率）的具體公式：MMP=a 2（1-a2）+b2（1-b2）=2ab（1-ab），a、b代表對偶抗原等位基因頻率。

2 結果

2.1 嘉興地區獻血人群HLA-A、B基因頻率 樣本中共檢出 HLA-A、B位點等位基因66種。HLA-A位點等位基因15個，頻率前5位為A*2（0.3040）、A*11（0.2384）、A*24（0.1771）、A*33（0.0893）、A*30（0.0493）。HLA-B位點等位基因38個，頻率前5位為B*46（0.1137）、B*60（0.1136）、B*13（0.0931）、B*62（0.0822）和B*58（0.0820）。各等位基因頻率見表1，基因頻率較高（＞2%），見表2。

表1 嘉興地區獻血人群HLA-A、B基因頻率（n=5,411）

表2 嘉興地區HLA-A、B基因頻率（基因頻率＞2%）

2.2 嘉興地區HPA1～6、15、21w基因分布及基因型頻率 HPA1～6、15、21w系統與Hardy-Weinberg遺傳平衡定律相契合，說明系統具有恒定性。由數據可知，HPA-3和HPA-15系統的基因型雜合度、對偶抗原不配合率均最高，HPA-3雜合度（a/b雜合子基因型）最高（0.482），其次為HPA-15（0.437），HPA-3、15系統中a、b抗原頻率相近，HPA-3、15系統有b/b純合子基因型，分別為0.196、0.266；其余5個系統均以a/a純合子基因型為主，分別為0.995、0.8995、0.990、0.975、0.945，未見bb基因型（表3）。

表3 嘉興地區HPA基因頻率（n=199）

2.3 嘉興地區單采血小板獻血者HPA基因頻率與國內其他地區比較分析 嘉興地區HPA1～6、15、21w基因分布與其他9個地區兩兩比較，均無明顯差異（P＞0.05）（表4）。

3 討論

基于相關理論研究與實驗結果，選擇HLA匹配的血小板或者HLA和HPA均匹配的血小板是減少PTR的方法。研究HLA和HPA基因的多態性分布特征，可更好地預測本地血小板特異性同種免疫的發生，制定更加精準的血小板同種免疫性疾病篩查方案，更大限度避免PTR的發生。

本研究通過分析獲取了嘉興地區HLA和HPA基因的多態性分布頻率特征，具體結論如下：第一，與蘇湘暉等［4］以及黃璐等［5］的研究相比，本研究發現HLA基因頻率在不同地域之間存在明顯差異。因此，在建立HLA基因型數據庫時［6］，應綜合考慮地域人群的分布特點。第二，HPA3a/3b、HPA15a/15b的基因組存在顯著的遺傳多態性，這與王曉偉［7］的研究結果一致。并且HPA3系統的雜合程度較高，僅次于HPA15［8］。對偶抗原不配合的概率從高到低依次為HPA-3、15、2、6、21、5系統，這與劉艷等［9］研究結果不同，可能與該地區的遺傳多樣性有關。此外，嘉興地區HPA2a/2b的基因雜合程度高于HPA1a/1b，意味著由于HPA2系統不相容導致的免疫性血小板減少癥的發病率可能高于HPA1系統。第三，通過比較嘉興地區與其他9個地區的HPA1-6、15、21w基因的分布，本研究發現HPA基因的頻率分布在不同地區間無明顯差異，這與周丹等［10］的研究結論不同，可能與本研究基因庫的規模相對較小有關。

綜上所述，嘉興地區獻血者HLA和HPA基因分布，并構建機采血小板基因信息數據庫，為有效應對嘉興地區的PTR問題提供了支撐。本研究尚存在不足之處，基因庫規模有限，后續需擴大樣本量以收集更全面的數據［11］，從而有效避免同種免疫反應引起的問題，并減少血液資源的浪費。