基于毛細管電泳的多重PCR法在兒童急性呼吸道感染病原體診斷中的應用

閔晶 李云 陳冬嬋

兒童急性呼吸道感染是全世界兒童發病和死亡的一個主要原因［1］。病毒、肺炎支原體和肺炎衣原體等是其主要病原體。急性呼吸道感染癥狀復雜，病原多樣，部分可引起爆發流行。病原體分布在不同地區、不同季節、不同年齡段也有所不同［2-3］。因此，提高呼吸道病原核酸檢測率有助于快速掌握本地區兒童呼吸道感染的病原體特征，對明確病因和精準治療具有重要臨床意義。傳統PCR方法對多種病原體檢測常需要多次篩查，費時費力，還可能因為診斷時間長而延誤病情。基于毛細管電泳的多重PCR法可以在同一反應體系內同時完成多種病原體的定性分析［4］。本院率先在本地區開展此檢測項目，應用該方法對本院就診兒童急性呼吸道感染樣本進行了多種常見呼吸道病原體檢測，現將結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本院2021年12月至2022年10月兒科住院的急性呼吸道感染兒童884例，男510例，女374例；年齡19 d～14歲，其中≤1歲304例，＞1～3歲253例，＞3～6歲303例；＞6歲～14歲124例。診斷標準依照《諸福棠實用兒科學》第8版［5］，有≥1種呼吸道感染癥狀，如咳嗽、咳痰、流涕、咽痛、氣促等。排除腎病、血液病、免疫性疾病、心血管疾病或其它嚴重基礎性疾病。咽拭子就診當日采集，置于含樣本保存液的專用采集管，于-20 ℃凍存備用。

1.2 方法 對甲型流感病毒（InfA）、甲型流感病毒H1N1（2009）（influenza virus H1N1）、甲型流感病毒H3N2（influenza virus A，H3N2）、乙型流感病毒（InfB）、副流感病毒（PIV）、人鼻病毒（HRV）、偏肺病毒（HMPV）、冠狀病毒（HCoV）、博卡病毒（BoCa）、呼吸道合胞病毒（RSV）、腺病毒（ADV）、肺炎支原體（MP）、肺炎衣原體（CP）等13種病原體核酸進行檢測。試劑購自寧波海爾施基因科技有限公司。樣本核酸抽提和檢測均在臨床基因擴增實驗室按照標準操作規程進行。采用西安天隆科技有限公司NP968全自動核酸純化儀提取病毒核酸，然后在Long Gene A300 PCR基因擴增儀上進行多重RT-PCR擴增，最后在Health T400 sanger 測序儀上對產物進行毛細管電泳，檢測結果數據由ABI公司GeneMapper軟件進行分析，比對各個毛細管泳道目的位點峰與該道標準品的高峰和低峰來判定陰陽性。

1.3 統計學分析 采用SSPS 25.0統計軟件。計數資料以n或%表示，組間比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 病原體總體檢出率 患兒檢出病原體感染530例，陽性檢出率59.95%。單一病原體感染472例，占89.06%，≥2種病原體感染58例，占10.94%。病原體陽性595份，檢出率67.31%。HRV、RSV、HPIV等病原體排在前3位，分別為19.80%、10.63%、8.60%（表1）。

表1 病原體總檢出狀況

2.2 病原體混合感染檢出狀況 ＞2種病原體感染58例，混合感染率6.56%（58/884）。以2種病原體感染為主，占87.93%（51/58），其余7例為3種病原體混合感染（表2）。混合感染以合并HRV感染占72.41%（42/58）。

表2 病原體混合感染檢出情況

2.3 不同性別兒童病原體感染狀況 見表3。男童中檢出率最高的前3種病原體分別是HRV的21.76%（111/510），RSV的9.02%（46/510），HPIV的8.82%（45/510）；女童中檢出最高的前3種病毒體也是HRV的17.11%（64/374）、RSV的12.83%（48/374）、HPIV的8.29%（31/374）。

表3 不同性別兒童病原體檢出率［n（%）］

2.4 不同年齡段病原體特征 見表4。

表4 不同年齡兒童病原體檢出率［n（%）］

2.5 不同季節病原體檢出率 見表5。

表5 不同季節病原體檢出情況［n（%）］

2.6 上下呼吸道病原體檢出情況 見表6。

表6 不同感染部位病原體檢出狀況［n（%）］

3 討論

以往許多PCR試劑常只能檢測一種或幾種呼吸道病原體，而基于毛細管電泳的多重PCR方法覆蓋了臨床常見的呼吸道病原體，適合初步篩查，可滿足快速、準確的診斷需求。本研究首次應用此方法對本院急性呼吸道感染兒童病原體檢測，結果發現在884例患兒中，≥1種病原體的檢出率達59.95%，高于北京（50.45%）［6］、河北（30.73%）［7］、廣東（42.78%）［8］和福州（43.53%）［9］等地區，低于鄭州地區（77.37%）［10］。研究的人群、檢測方法和檢測病原體種類等可以造成檢測結果的差別，但也提示不同地區呼吸道病原體流行確實存在差異。感染以單一病原體感染為主，檢出前3位的病原體分別為HRV、RSV、HPIV，提示病毒是引起兒童急性呼吸道感染的主要病原體，這與國內其他地區流行病學調查結果相符。以前有研究報道病原體感染在不同性別中存在差異［11］，也有研究未見分布差異［12］。本研究中男童和女童病原體檢出率和排在前3位的病原體檢出率差異也無統計學意義，因此，不同性別與呼吸道病原體感染的相關性有待深入研究。

本研究發現1～3歲兒童中病原體檢出率最高，這可能由于斷奶后得不到母體帶來的抗體，呼吸系統發育又尚不健全，機體免疫系統對病毒防御能力相對較差導致［13］。以往有研究認為隨著年齡增長，兒童免疫系統發育日趨成熟，呼吸道病毒感染逐步降低［14］。而本調查中未見此種趨勢，可能由于本研究中研究對象均為住院患兒，其病情相對較重，因此，病原體檢出率未見顯著差異。

呼吸道病原體流行受到不同季節、不同氣候條件的影響［15］。本地區的病原體流行也有季節流行特征，檢出率在冬季最高，這與冬季氣候寒冷，呼吸道毛細血管痙攣、缺血，局部抵抗力減弱有關，而寒冷季節活動多在室內不通風環境，容易造成交叉感染。在檢出率較高的幾種病原體中，RSV在寒冷冬季出現高峰，MP的高峰是潮濕炎熱的夏季。呼吸道病原體的精準防控需要考慮當地病原體季節性流行特點。

本研究還發現部分患兒存在病原體混合感染，7例有3種病原體感染。這可能與兒童免疫系統相對發育不成熟、易受病毒攻擊有關，或者是感染一種病毒后，呼吸道黏膜障和機體免疫力受到破壞，為其它病原體感染提供了條件。多種病原體感染是否會加重病情，影響治療效果還有待進一步隨訪研究。本研究中下呼吸道感染兒童中RSV、HMPV、MP等病原體檢出率較高，有報道兒童感染HRSV或HMPV后有部分會引起下呼吸道感染，出現嚴重癥狀，而MP也是引起兒童社區獲得性肺炎的重要病原體，提示要警惕檢出這些病原體感染的患兒疾病進展。

本研究也存在一定局限性：（1）時間跨度較短，未能對本地區不同年份的病原體感染變化趨勢進行分析；（2）未對感染細菌進行檢測，從而更全面了解呼吸道感染病原譜構成。

總之，基于毛細管電泳的多重PCR方法具有同時覆蓋多種常見病原體特點，避免多次采樣，減少醫院感染機會；可實現病原精準診斷，指導抗生素合理應用。