探討“伏毒-細胞自噬-骨免疫”學說對骨質(zhì)疏松癥發(fā)病機制的影響

李平順 田杰祥 周孟茹 魏勇 王鋼*

1.甘肅中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院,甘肅 蘭州 730000

2.甘肅中醫(yī)藥大學,甘肅 蘭州 730000

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis,OP)是世界上最常見的骨病,其特征是骨礦物質(zhì)密度低,使受影響的骨骼容易骨折。骨穩(wěn)態(tài)取決于破骨細胞(osteoclasts,OC)的骨吸收與成骨細胞(osteoblast,OB)的骨形成之間的精確平衡,并涉及一系列復雜且高度調(diào)控的步驟。當骨吸收速度快于骨形成速度時,骨穩(wěn)態(tài)就會被破壞。基于骨穩(wěn)態(tài)的多種調(diào)節(jié)機制,臨床上出現(xiàn)了一系列針對OP的藥物,包括雙膦酸鹽、選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑、降鈣素、分子靶向藥物等。然而,許多藥物有嚴重的不良反應或不適合長期使用。所以,基于OP的新發(fā)病機制,尋找更有效的治療藥物迫在眉睫。雖然OP 涉及多種分子機制,但疾病發(fā)作的兩個關(guān)鍵因素是雌激素減少和氧化應激增加;有趣的是,雌激素似乎會誘導骨細胞發(fā)生自噬,而氧化應激是由自噬缺陷引起的。自噬是一種重要的細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)系統(tǒng),可回收有缺陷的大分子和細胞器以維持細胞的新陳代謝。越來越多的證據(jù)表明,自噬是免疫細胞、骨細胞分化與活化的必需過程,自噬失調(diào)可導致骨免疫紊亂,直接或間接引起OB/OC比例失衡,骨組織微結(jié)構(gòu)破壞,骨骼質(zhì)量與強度降低。本綜述以“伏毒”理論為切入點,以“伏毒-細胞自噬-骨免疫”學說為基礎,探討自噬、骨免疫學與OP的關(guān)系,為OP發(fā)病機制和潛在治療靶點提供了新的見解。

1 伏毒理論

“伏毒”首見于《脈經(jīng)》“熱病……伏毒傷肺中脾者死;熱病……伏毒在肝腑足少陽者死”中熱病的論述[1]。“伏者,匿藏也”;所謂“伏邪”指藏于體內(nèi)而不立即發(fā)病的病邪。“毒,邪氣蘊結(jié)不解之謂”,當邪氣過盛則可蘊而成毒。

國醫(yī)大師周仲瑛認為“伏毒”是指邪毒深伏潛匿,伏而不覺,發(fā)時始顯;且毒愈深,氣愈虛,虛愈甚,邪愈滯,正愈傷,故伏毒具有纏綿、蟄伏、暗耗、多變、難治等致病特點。伏毒的成因無外乎外、內(nèi)兩端。外感邪毒入侵人體后,若正氣盛,則暫不發(fā)病;若正氣虛,則邪毒得以深伏內(nèi)藏。內(nèi)傷“伏毒”則是內(nèi)傷久病,臟腑虧虛、陰陽失調(diào),則濕、寒、熱、火等內(nèi)生邪氣及痰飲、瘀血等有形實邪,郁積不化,日久醞釀而成濕毒、熱毒、火毒、瘀毒、痰毒等,皆屬伏毒[2]。

OP歸屬于中醫(yī)“骨萎”,老人多虛多瘀,而骨痿的基本病理特點恰恰是虛、瘀。因虛至瘀,瘀久致虛,虛、瘀相互作用,產(chǎn)生新的病理產(chǎn)物,導致“伏毒”的產(chǎn)生,即“虛瘀致毒”。“虛”,臟腑虧虛,骨骼失養(yǎng);“瘀”,血液成凝滯狀態(tài),骨骼及周圍組織中的細胞難以通過血液進行物質(zhì)交換,骨骼微循環(huán)被破壞,骨代謝紊亂;“毒”,骨細胞肥大、萎縮,或變性、凋亡。“伏毒”作用于骨骼,表現(xiàn)為骨組織微結(jié)構(gòu)破壞,骨骼質(zhì)量與強度降低,形成骨痿[3]。

2 自噬的中醫(yī)微觀機制

自噬是一個集合術(shù)語,涵蓋了一系列分解代謝途徑,通過溶酶體降解和細胞質(zhì)成分的循環(huán),如蛋白質(zhì)聚集物、受損或無用的細胞器以及入侵的病原體,調(diào)節(jié)細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)[4]。自噬的3種主要亞型是,微自噬(通過內(nèi)溶酶體腔室的限制膜內(nèi)陷直接獲得胞質(zhì)貨物)、伴侶介導的自噬(伴侶介導的未折疊蛋白通過KFERQ 樣多肽序列募集到溶酶體)和巨自噬(以雙膜囊泡為特征,即自噬體,它在與溶酶體融合以進入裂解室之前完全吞噬目標物)[5-6]。

自噬是由一系列自噬相關(guān)基因(autophagy related genes,ATGs)調(diào)控的。自噬的過程可以分為4個步驟[7-10]:①誘導自噬:該過程中涉及Atg1/ulk1復合物;②自噬體的形成:III類PI3K-Atg14復合體、Atg9-Atg2-WIPI-1(Atg18)復合體和Atg5-Atg12-Atg16L1復合體參與了自噬體的膨脹和成熟,還需要LC3/ GABARAP(酵母中的Atg8)的脂化作用,這取決于ATG3、ATG4和ATG7;③自噬體與溶酶體的轉(zhuǎn)運和融合:該過程需要Rab7、異位p-顆粒自噬蛋白5同源物(EPG5)、HOPS、pleckstrin同源結(jié)構(gòu)域含蛋白家族成員1 (PLEKHM1) 12和可溶性NSF附著蛋白受體(SNAREs);④完成自噬:這需要通過水解酶降解自噬體貨物,并通過轉(zhuǎn)運體/permeases將降解產(chǎn)物釋放到細胞質(zhì)中,在那里它們可以被重新用于合成生物大分子或其他代謝途徑。

正常情況下,自噬可通過清除老化或受損的細胞器起到維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的作用,然而,當自噬過度被激活或抑制則可導致各種病理過程。自噬的過程可看作是機體對于正氣與邪氣的調(diào)控反應,是中醫(yī)陰陽動態(tài)平衡的微觀體現(xiàn)。在邪氣侵襲初期,自噬對細胞起著保護作用,當自噬功能被抑制時,則易導致各種疾病的發(fā)生,而疾病發(fā)生后期,自噬被過度激活必然耗傷正氣。各種疾病的發(fā)生發(fā)展皆與絕對的或相對的自噬不足和自噬過度相關(guān),這與“正虛”和/或“邪實”導致機體陰陽失和而發(fā)病相類似[11]。

正氣是指人的形體結(jié)構(gòu)、精微物質(zhì)及正常的功能活動、抗病能力和康復能力,以及人體對外界的適應能力、調(diào)控能力,有維護自身生理平衡與穩(wěn)定的功能。正如《內(nèi)經(jīng)》中所言:“邪之所湊,其氣必虛。”外感邪毒入侵人體后,若正氣盛,則暫不發(fā)病;若正氣虛,則內(nèi)傷“伏毒”。以OP為例,“伏毒”作用于骨骼,引起骨細胞絕對的或相對的自噬不足和/或自噬過度,導致骨細胞肥大、萎縮,或變性、凋亡,骨組織微結(jié)構(gòu)破壞,骨骼質(zhì)量與強度降低,形成骨痿;從此種意義上講,自噬的失調(diào)與伏毒的形成和致病密切相關(guān)。

3 自噬與骨免疫學

人們早就認識到免疫系統(tǒng)和骨骼系統(tǒng)密切相關(guān),這種串擾,也稱為骨免疫學,是骨骼健康所需的主要過程。例如,各種免疫調(diào)節(jié)細胞(T和B淋巴細胞、巨噬細胞、DC)與OC誘導的骨吸收有關(guān);免疫細胞釋放促炎細胞因子,例如IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-17在OC-OB耦合中充當關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑,以維持骨重塑的平衡[12]。

骨免疫學是通過許多細胞和分子過程實現(xiàn)的,最近發(fā)現(xiàn)自噬在其中起著不可或缺的作用[13]。隨著對細胞自噬和骨免疫分子機制的更深刻理解,自噬系統(tǒng)和骨免疫之間的密切關(guān)系逐漸被揭示出來:自噬在自噬銜接蛋白的幫助下,通過模式識別受體(pattern recognition receptor,PRRs)觸發(fā)一系列免疫反應,從而完成清除細胞內(nèi)微生物的基本過程[14]。同時,自噬通過消除內(nèi)源性炎癥小體干擾細胞因子等免疫介質(zhì),以及通過調(diào)節(jié)抗原呈遞細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)等形式進一步影響免疫反應,最終引起OC/OB比例失調(diào),導致骨質(zhì)流失或關(guān)節(jié)破壞[15]。

3.1 自噬參與T、B淋巴細胞的分化與活化

自噬對T淋巴細胞分化與活化的影響:此效果可通過控制先天免疫細胞來實現(xiàn)的,例如,自噬缺陷的巨噬細胞大量分泌IL-1α和 IL-1β,在IL-6和TGF-β的協(xié)同作用下誘導Th17型T淋巴細胞免疫反應[16]。ATG5缺陷小鼠的骨髓樣細胞在感染結(jié)核分枝桿菌后具有更高水平的IL-17,使用結(jié)核分枝桿菌抗原在體外刺激ATG5缺陷小鼠肺細胞淋巴細胞也表現(xiàn)出類似的CD4+T淋巴細胞的IL-17表達增加的現(xiàn)象[17]。T淋巴細胞在自噬的幫助下維持其活化狀態(tài)[18]:①自噬抵消了上調(diào)的CD95和CD95 L對TCR刺激產(chǎn)生的促凋亡作用;②自噬消除了T淋巴細胞中受損的線粒體并維持正常的氧化應激水平以抑制細胞凋亡;③自噬通過維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣通量的穩(wěn)態(tài)參與T淋巴細胞活化。

自噬對B淋巴細胞及抗體免疫反應的影響:漿細胞是終末活化期的B淋巴細胞,是獲得性體液免疫應答的主要效應細胞。存在于次級淋巴器官(如脾臟和淋巴結(jié))中的B淋巴細胞在遇到抗原后會分化為壽命短的漿細胞。反復刺激T淋巴細胞可產(chǎn)生記憶性B淋巴細胞和長壽漿細胞,這些細胞可在特化的骨髓生態(tài)位中終生存活,維持基礎抗體水平并保留針對特定抗原的免疫記憶,從而能夠及時產(chǎn)生防止病原體和有毒物質(zhì)的抗體。漿細胞是專門的抗體分泌細胞,其中合成、組裝和分泌大量抗體。B淋巴細胞向漿細胞的分化是由細胞應激介導的內(nèi)在重塑過程,與蛋白質(zhì)組學可塑性有關(guān),涉及細胞壓力、代謝和細胞更新之間的復雜關(guān)系。抗體產(chǎn)生的調(diào)控涉及研究這種特殊分泌細胞中的蛋白質(zhì)折疊和組裝,以及分析骨髓長壽漿細胞及其周圍環(huán)境的成分。自噬在漿細胞分化中起著至關(guān)重要的作用,它涉及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、分化和抗體產(chǎn)生之間的平衡。自噬是決定長壽漿細胞命運和機體長期免疫力的內(nèi)在因素[19]。

3.2 自噬對免疫效應分子的調(diào)控

自噬調(diào)節(jié)炎癥小體的激活:炎性體是一種胞質(zhì)多蛋白復合物,屬于一類新的炎癥信號通路,炎性體控制各種炎癥因子的成熟和分泌,例如IL-1β、IL-17和 IL-33等。胞質(zhì)NLR家族的成員(如NLRP3和NLRP1)與自噬受體相互作用形成炎性體[20]。在野生型巨噬細胞中,TLR激動劑LPS不能誘導炎性體激活和IL-1β 的分泌;當自噬調(diào)控基因ATG16L1或ATG7被敲除或使用化學試劑抑制自噬,LPS依賴性炎性體被重新激活;這些發(fā)現(xiàn)表明自噬調(diào)節(jié)炎性體的激活,同時限制炎性細胞因子IL-1β和IL-17的產(chǎn)生[21]。

迄今為止,自噬抑制炎性體的機制尚不清楚。一種可能的分子機制是通過自噬直接降解炎性體,因為自噬下調(diào)ROS的產(chǎn)生,從而抑制炎性體。自噬相關(guān)基因缺陷,如ATG5、ATG7、ATG12和ATG16L1, 導致線粒體的異常積累和ROS的大量增加。ROS可被先天免疫細胞中的炎性小體識別,釋放促炎因子,進而引起炎癥。自噬可以減少線粒體聚集和線粒體和過氧化物酶體的明顯滲漏,從而負向調(diào)節(jié)細胞內(nèi)ROS。這些發(fā)現(xiàn)表明ROS激活的自噬可能是一種負反饋調(diào)節(jié)機制[22]。

自噬對細胞因子產(chǎn)生和釋放的影響:研究發(fā)現(xiàn)自噬可直接影響某些細胞因子的轉(zhuǎn)錄、加工和分泌。值得一提的是,正常自噬通路的破壞會增加促炎細胞因子IL-1α、IL-1β和IL-17的分泌[23]。

3.3 骨免疫對骨重塑的調(diào)控

骨骼系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)之間的串擾最初通過研究發(fā)現(xiàn),免疫細胞來源的IL-1可以誘導OC的分化。研究發(fā)現(xiàn)源自適應性免疫系統(tǒng)的T輔助細胞通過產(chǎn)生RANKL在關(guān)節(jié)炎的炎癥性骨丟失中發(fā)揮關(guān)鍵作用;Th17細胞來源的IL-17是促進OC生成的關(guān)鍵炎癥因子;而Th2細胞來源的IL-4和IL-10被認為是OC的抑制劑。另一方面,Treg細胞以直接的細胞間接觸依賴性方式抑制OC生成,主要因為Treg上的細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)蛋白4(CTLA-4)細胞與OCPs上的 CD80和CD86結(jié)合,從而產(chǎn)生IL-4、IL-10和TGF-β;來自先天免疫系統(tǒng)的抗原呈遞細胞,如巨噬細胞,不僅充當OC前體,還參與OC生成調(diào)控[24]。

4 自噬與OP

絕經(jīng)后OP涉及多種分子機制,但疾病發(fā)作的兩個關(guān)鍵因素是雌激素減少和氧化應激增加。有趣的是,雌激素似乎會誘導骨細胞發(fā)生自噬,而氧化應激是由自噬缺陷引起的。自噬以基礎水平存在于所有細胞中,以維持穩(wěn)態(tài)并促進細胞存活以響應細胞應激條件,例如營養(yǎng)剝奪和缺氧。自噬是免疫細胞激活/極化和OC分化的必需過程,可保護細胞免受氧化應激;自噬在成骨過程中的本質(zhì)是參與OB的分化和礦化,特別是自噬體在細胞外鈣轉(zhuǎn)運中的作用[25]。此外,自噬還參與維持骨髓造血干細胞生態(tài)位。

4.1 氧化應激中自噬的調(diào)節(jié)

氧化應激在調(diào)節(jié)骨重塑過程的平衡中起著關(guān)鍵作用,包括對骨形成和骨吸收的影響。氧化應激誘導的活性氧(reactive oxygen species,ROS)可導致骨細胞和OB凋亡并抑制骨礦化和成骨,這與不平衡的OC形成相結(jié)合,導致骨質(zhì)流失加劇和OP進展[26]。在生理水平上,ROS可以作為信號分子參與細胞過程,如分化、增殖、凋亡、自噬和氧化還原信號;相反,過量的ROS水平會導致脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA受損,最終導致細胞死亡。為了應對氧化應激,自噬由細胞損傷引起的ROS水平調(diào)節(jié),并通過細胞保護機制支持細胞存活,減輕氧化應激造成的損傷。然而,ROS的過度積累也會通過自噬失調(diào)加劇細胞損傷,導致線粒體功能障礙和ROS水平升高[27]。

4.2 成骨細胞自噬

自噬在骨形成中起著重要作用,包括骨髓干細胞(bone marrow stem cell,BMSCs)分化成OB再到骨細胞、成骨、分化和骨基質(zhì)的形成。BMSC分化需要能量,而自噬體降解產(chǎn)物可被線粒體氧化,為其分化提供合適的能量供應[28]。BMSC向OB的分化過程涉及AMP活化蛋白激酶(AMPK)/mTOR信號軸介導的自噬的早期階段以及Akt/mTOR信號軸激活的后期階段[29]。相反,自噬水平的降低會直接抑制內(nèi)源性BMSCs的功能,進一步促進OP的發(fā)展[30]。當BMSCs完全分化為OB時,基礎自噬被完全抑制,但這并不表示分化的細胞不再具有自噬能力[31]。體外研究發(fā)現(xiàn),OB中FIP200消融誘導的自噬缺陷導致OB分化功能障礙[32]。此外,下調(diào)自噬標志物(如LC3-II和ATG7)的表達已被證明會導致OB分化受到抑制[33]。

此外,自噬還直接參與OB的礦化過程。OB中ATG7的條件性敲低導致體內(nèi)礦化能力降低[34],Osterix-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠中自噬相關(guān)基因Fip200或Atg5的敲除也導致小鼠礦化受損和骨量減少[35]。這些結(jié)果表明,在OB的礦化過程中需要自噬,這可歸因于自噬泡作為將磷灰石晶體分泌到細胞外基質(zhì)的載體。

4.3 破骨細胞自噬

OC從骨髓的造血干細胞分化而來,在骨重塑的開始階段至關(guān)重要,隨后分化成多核OC,然后遷移到骨骼表面。據(jù)報道,響應缺氧應激而產(chǎn)生的HIF1-α可上調(diào)BNIP3,從而增加Beclin-1的水平,然后激活伴隨自噬相關(guān)基因ATG的自噬通量,從而通過上調(diào)CTSK、NFATC1和MMP9,進而刺激OC分化和生成[36]。此外,據(jù)報道,自噬起始蛋白Beclin-1的水平在OC分化過程中會增加。Ctsk細胞表達條件性Beclin-1缺陷小鼠通過減弱OC功能而表現(xiàn)出骨皮質(zhì)厚度增加;而 Beclin-1在OC前體中的過度表達已被報道可增強體外自噬誘導的OC生成并增加骨吸收[37]。

除了在破骨細胞分化中的作用外,自噬還被證明對OC功能至關(guān)重要。終末分化的OC通過蒂緊密附著在骨表面,F-actin、talin、vinculin和α-actinin是OC附著的關(guān)鍵錨定目標,然后溶酶體遷移到骨表面并吸收骨。自噬相關(guān)蛋白 ATG4B、ATG5、ATG7和LC3都已被證明在促進骨吸收活動中起著至關(guān)重要的作用。例如,敲低OC中的ATG5和ATG7可顯著減少骨陷阱的深度和體積,并降低將溶酶體遞送至折疊膜邊界的能力,盡管這似乎不會影響破骨細胞的形成[38]。

4.4 線粒體自噬

線粒體在ATP的產(chǎn)生中起關(guān)鍵作用,ATP為細胞提供90 %以上的能量。線粒體DNA完整性和修復能力在應激反應中受損,例如線粒體跨膜電位(mitochondrial transmembrane potential,MMP)增加、氧化應激和缺鐵。如果損傷超過線粒體內(nèi)膜的膜電位,功能失調(diào)的線粒體將通過自噬途徑清除,這被稱為線粒體自噬。線粒體自噬不僅通過清除由氧化應激引起的受損線粒體來保護細胞免于凋亡,而且還促進新線粒體的生物合成,這對細胞穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。越來越多的證據(jù)表明,異常的線粒體自噬在干細胞分化和骨代謝紊亂中起著關(guān)鍵作用,進一步參與OP的發(fā)病,其機制可能與磷酸肌醇3-激酶(PI3K)和Pink1等信號有關(guān)[39]。

5 討論

長期以來,自噬一直被認為是細胞分化的必要組成部分,在OC中,自噬效應與OC的分化、活性、功能呈正相關(guān);在OB中,自噬效應與OB分化階段有關(guān):①BMSCs向OB分化階段:細胞自噬可以促進OB分化;②成熟OB階段:當BMSCs完全分化為OB時,基礎自噬被完全抑制。自噬抑制可導致體外礦化受損和體內(nèi)骨量/體積減少,隨之誘導氧化應激和RANKL的產(chǎn)生,誘導OC分化,這些結(jié)果表明自噬在成骨細胞分化和礦化過程中的基本作用,它作為礦化載體,保護OB免受氧化應激增加。這與OB中自噬缺陷/抑制導致骨質(zhì)疏松樣表型并誘導OC分化的現(xiàn)象一致[40]。

當人體外感邪毒或內(nèi)傷“伏毒”(類似于缺氧、遺傳、激素和營養(yǎng)、年齡等因素),導致陰陽失衡(即產(chǎn)生氧化應激和自噬激活),T、B淋巴細胞分化及炎癥因子分泌增加,誘導的ROS損害OB和骨細胞的骨形成并促進OC的骨吸收,OC自噬效應強于OB和骨細胞的保護作用,從而破壞骨穩(wěn)態(tài);而成熟OB的自噬被抑制,最終加速OP的進展。若致病因素導致自噬抑制,OB數(shù)量與功能下降,導致骨骼礦化受損和體內(nèi)骨量/體積減少,隨之誘導氧化應激和RANKL的產(chǎn)生,誘導OC分化,進一步誘發(fā)OP。

近年來隨著對細胞自噬與骨免疫學的深入探索發(fā)現(xiàn),以“伏毒”理論為切入點,以“伏毒-細胞自噬-骨免疫”學說為基礎,探討自噬是免疫細胞、骨細胞分化與活化的必需過程,自噬失調(diào)可導致骨免疫紊亂,直接或間接引起OB/OC比例失衡,骨組織微結(jié)構(gòu)破壞,骨骼質(zhì)量與強度降低,最終導致OP。

中藥通過調(diào)控細胞自噬、骨免疫治療OP具有廣闊的研究前景,但“伏毒-細胞自噬-骨免疫”學說仍處于探索初期,其循證依據(jù)有待我們的進一步探究。未來將繼續(xù)堅持在中醫(yī)辨證論治原則下利用現(xiàn)代分子生物學、網(wǎng)絡藥理學及蛋白組學等相關(guān)技術(shù),對“伏毒-細胞自噬-骨免疫”學說進一步深入研究,以期為OP的機制研究、診斷及治療提供新思路。